1. hujayralarni kullanish

Mikroorganizmlarning protoplastlarini olish usullari

Protoplastlarni olish usulini tanlash organizmlarning tur xususiyatlari va birinchi navbatda ularning hujayra devorlarining tuzilishi bilan belgilanadi , chunki prokaryotlar ichida ham hujayra devorlarining tuzilishida sezilarli farqlar mavjud, bu farqlar haqida gapirmasa ham bo'ladi. prokaryotik va eukaryotik organizmlarning tuzilishi .

Shunga qaramay , mikroorganizmlarning uch xil guruhidan - bakteriyalar, xamirturushlar va qo'ziqorinlardan protoplastlarni olish usullarini ikkita asosiy guruhga birlashtirish mumkin:
1) hujayra devorining qattiq qatlamining fermentativ lizisi;
asosiy devor polimerlarining normal sintezini bostiruvchi omillardan foydalanish .
Bakteriyalardan protoplastlarni olish

plazmoptoz " hodisasini ko'rsatdi - hujayra tarkibini gipertonik eritma ichiga joylashtirilganda atrof-muhitga chiqarish - bakteriyalar Bacillus uchun. subtilis va vibrion proteus . Shu bilan birga, protoplazma sferik jismlar shaklida ajralib chiqdi va juda tez yo'qoldi .

Bakteriyalardan protoplastga o'xshash jismlarni olish bo'yicha asosiy ishlar 1950-yillarning boshlarida boshlangan. Bu yillarda turli tuzlarning gipertonik eritmalaridan foydalanib, hujayra yetishtirish sharoitining sharsimon shakllar hosildorligiga ta'siri aniqlandi . To'plar kontsentratsiyasining qiymati (suspenziya qanchalik qalinroq bo'lsa, to'plarning shakllanishi shunchalik intensiv bo'ladi ) va muhitning pH ta'siri (zaif kislotali va neytral reaktsiyalar to'plarning shakllanishiga yordam berdi, kislota va ishqoriy reaktsiyalar esa) aniqlandi . to'p hosil qilmadi). Biroq, hosil bo'lgan sferik shakllarning yaxlitligini saqlab bo'lmadi, ular tezda lizidi .
Protoplastga o'xshash tuzilmalarni olishning keyingi bosqichi gidrolitik ferment lizozim yordamida bakteriya hujayra devorining fermentativ erishi edi . Buning uchun turtki M. Salton (M. Salton ) tomonidan gram-musbat bakteriyalarning hujayra devorlarining lizozim ta'sirida erishi fakti tomonidan aniqlangan fakt edi . Biroq, bu tajribalarda ham protoplastga o'xshash jismlar juda beqaror bo'lib chiqdi.
bakterial hujayralarni gipertonik sukroz eritmasida lizozim bilan davolagan K. Weibull (S. Weibull ) yo'l qo'ymadi . U tomonidan olingan sharsimon jismlar osmotik bosim stabilizatori bo'lgan muhitga joylashtirilsa, uzoq vaqt davomida o'z yaxlitligini saqlab qoldi. K.Veybul o‘simlik sitologiyasida ilgari qo‘llanilgan atama yordamida hosil bo‘lgan sharsimon shakllanishlarni protoplastlar deb atagan .
Lizozimning faolligiga ozmotik bosim stabilizatorlari sifatida ishlatiladigan moddalar ta'sir qilishi mumkinligi aniqlandi . Masalan, 0,5% NaCl dan foydalanish lizozimning hujayralarga ta'sirini inhibe qiladi. Uglevodlar bakterial protoplastlarni olish uchun eng yaxshi stabilizator hisoblanadi. Ko'pincha saxaroza, glyukoza, rafinoza, melibioza , trehalozaning 0,1-0,6 M eritmalari ishlatiladi . Ba'zida shakarning yuqori konsentratsiyasi ishlatiladi.
Gram-musbat bakteriyalarning protoplastlarini olish uchun hujayralarni gipertonik eritmada lizozim bilan oddiy davolash kifoya qiladi . Ushbu ferment ta'sirida hujayra devorining qattiq peptidoglikan qatlami eriydi . Shu bilan birga, lizozimga sezgirlik nafaqat har xil turdagi bakteriyalarda, balki turli shtammlarda ham bir xil emas.
Gram-manfiy bakteriyalarning protoplastlarini olish uchun lizozim bilan oddiy davolash samarasizdir. Ushbu bakteriyalarning hujayra devorlarida peptidoglikanning yupqa qatlami ligoproteinlar , fosfolipidlar, lipopolisakkaridlardan tashkil topgan tashqi qatlam bilan o'ralgan bo'lib , uni lizozim ta'siriga kirishmaydi . Enzimning substratga kirishi hujayra devorining sirt qatlamlarini buzishni talab qiladi.
lizozim ta'siriga tayyorlash hujayralarning sezgirligini oshiradigan turli usullar yordamida amalga oshiriladi : ishqoriy pH darajasida yoki yuqori konsentratsiyali saxaroza mavjudligida bakteriyalarni suyuq ozuqa muhitida oldindan inkubatsiya qilish yo'li bilan ; hujayralarni xelatlovchi birikmalar (masalan, Na-EDTA ) yoki mono- va ikki valentli kationlar bilan davolash; oldindan muzlatish-eritishni qo'llash.
R.Repaske tomonidan taklif qilingan va hozirgacha har xil turdagi gram-manfiy bakteriyalarda protoplastlarni olishda foydalanilgan usul edi . Muallif pH 7,6−8,0 bo'lgan muhitda lizozim va EDTA ning birgalikdagi ta'siri ostida protoplastlarni olish imkoniyatini ko'rsatdi .
1976 yilda R. Vayss Repasque usulini o'zgartirib, EDTA yordamida E. coli protoplastlarini olishning tezlashtirilgan usulini taklif qildi . U lizozim va EDTA hujayralariga qo'shma harakatni emas , balki ketma-ket ta'sir ko'rsatdi.
lizing qiluvchi omillar sifatida ham ishlatilishi mumkin .
Bakteriyalarda protoplastlarni olish usullarining ikkinchi guruhi tayyor hujayra devorlarini yo'q qilishni emas, balki ularning sintezini inhibe qilishni ("muvozanatsiz o'sish" usullarini) o'z ichiga oladi . Hujayra devorlari sintezidagi metabolik buzilishlar ikki holatda sodir bo'ladi : 1) mutatsiya natijasida hujayra devori polimerlari sinteziga olib keladigan reaktsiyalar zanjirida genetik blok paydo bo'lishi mumkin; 2) qattiq mukopolimer hosil bo'lishiga to'sqinlik qiluvchi vositalar ta'sirida hujayra devori sintezini buzgan holda .
Ba'zi bakteriyalarda hujayra devorlarining yaxlitligi o'sish muhitida mukopolimer aminokislotalarning mavjudligiga bog'liq : DAP , sistein, alanin , lizin, glitsin, ornitin va glutamik kislota. Hujayra o'sishi paytida ular tugasa, hujayra devori sintezi to'xtaydi ( Streptococcus faecalis ).
protoplastlarni olish uchun keng qo'llaniladigan usullardan biri bu penitsillin usuli deb ataladigan , peptidoglikan sintezini buzish uchun penitsillin xususiyatiga asoslangan . (Birinchi marta 1956 yilda K. Ledermeister va E. Kellenberger tomonidan taklif qilingan) Penitsillin usuli faol sitoplazmatik komponentlarning sintezi hujayralarda bostirilgan hollarda samarasiz bo'ladi , masalan, hujayralar xloramfenikol , streptomitsin yoki xlortetratsiklin ta'sirida . Penitsillinning faol o'sayotgan hujayralarga ta'siri peptidoglikan sintezining oxirgi bosqichida , bu polimer deyarli qurilganidan keyin transpeptidatsiya reaktsiyasini inhibe qilishgacha kamayadi .
Penitsillin usuli gram-musbat bakteriyalarning protoplastlarini olish uchun mos emas . Bu bakteriyalarning hujayra devoridagi mukopolimer qatlami gram-manfiy bakteriyalarda bo'lgani kabi qo'shimcha qatlamlar bilan himoyalanmaganligi va hujayralar antibiotik bilan o'stirilganda lizisga uchraganligi bilan izohlanadi . Biroq, Corynebacterium dan protoplastlarni olish usulini muvaffaqiyatli qo'llash haqida alohida hisobotlar mavjud glutamicum , buning uchun boshqa usullar samarasiz edi .
Bu usullardan tashqari bakteriyalardagi protoplastlarni boshqa usullar bilan ham olish mumkin: glitsin, fag ta'sirida. litik ferment, normal va immun zardob, kompliment, avtoliz usuli va boshqalar.
Gram-manfiy va gramm-musbat bakteriyalardan olingan protoplastlar qolgan sirt tuzilmalarining sifati bilan farqlanadi . Gram-musbat bakteriyalarning protoplastlarida hujayra devori to'liq yo'q va ularning sharsimon tanalari faqat sitoplazmatik membrana bilan o'ralgan . Gram -manfiy bakteriyalarning sharsimon tanalari murakkab hujayra devorining muhim qismini ushlab turadi va sferoplastlar deb ataladi .