1 Tanlash usuli dnk-zimlarni olish uchun vitro

1 Tanlash usuli DNK-zimlarni olish uchun vitro
Nuklein kislotalarning genetik ma'lumotni saqlash va uzatish vositasi sifatida an'anaviy roli
Yerdagi tirik organizmlar uzoq vaqtdan beri o'rganilgan. Xuddi shunday, oqsillarning roli sifatida harakat qilish
biologik katalizatorlar ham yaxshi o‘rganilgan. Qobiliyat
Biroq, nuklein kislotalar 1980-yillarning boshlariga qadar katalizator sifatida ishlay olmadi ( Kruger ). va boshqalar al .
1982 yil; Guerrier-Takada va boshqalar. 1983). 1989 yilda Tomas Chexiya va Sidney
Altman "katalitik xususiyatlarini kashf etgani uchun kimyo bo'yicha Nobel mukofoti bilan taqdirlangan
RNK". Ularning RNKga asoslangan fermentlar yoki ribozimlarni kashf etishi yangi kashfiyotdir.
chunki ularning ishlari birinchi marta RNK ekanligini ko'rsatdi
murakkab biokimyoviy reaktsiyalarni katalizlash uchun kerak bo'lgan hamma narsaga ega. Tabiiy ribozimlarning kashf etilishi
sun'iy ribozimlarni, shuningdek, DNKga asoslangan fermentlarni qidirishga turtki bo'ldi.
(DNAwinter), ushbu bob bag'ishlangan. Ribozimlardan farqli o'laroq, DNK-zimlarning mavjudligiga dalil yo'q.
tabiatda. DNK tabiiy holatida asosan ikki zanjirli shaklda va mavjudligi
qo'shimcha
zanjir ikki zanjirli DNKni oddiy dupleks tuzilishga ega bo'lishiga olib keladi, bu esa DNKni olib tashlaydi.
murakkab uchinchi darajali tuzilmalarni yaratish qobiliyati. Dupleksning strukturaviy soddaligidan farqli o'laroq,
bir zanjirli DNK juda moslashuvchan va murakkab hosil qilishi mumkin
odatda fermentlarning faol joylariga xos bo'lgan uch o'lchovli tuzilmalar (Breaker 1997;
Ponce-Salvatierra va boshqalar 2016; Liu va boshq. 2017). Murakkab uchinchi darajali tuzilmalarni yaratish qobiliyati
Enzimatik katalizning asosiy xarakteristikasi.
Rivojlanish bilan sun'iy DNK-zimlarni izlash mumkin bo'ldi
Larri Gold, Jek Szostak va Jerald guruhlari tomonidan in vitro tanlash usuli
Joys. In vitro tanlash - bu imkon beradigan kuchli eksperimental yondashuv
DNK yoki RNK hovuzlaridan funktsional DNK yoki RNK ketma-ketligini izolyatsiya qilish
variantlari. Tuerk va Gold (1990) yuqori yaqinlikdagi ligandlarni ajratib olish mumkinligini ko'rsatdi.
maqsadli oqsilni bog'lash uchun RNK molekulalarining populyatsiyasidan. Ular o'zlarini berishdi
usul qisqartmasi "SELEX", bu ligandlarning tizimli evolyutsiyasini anglatadi
eksponensial boyitish orqali. Ellington va Szostak (1990) RNK molekulalarining bog'lanishini ko'rsatdi
organik bo'yoqlar tasodifiy ketma-ket RNK hovuzidan ajratilishi mumkin.
Ular o'z usullarini "in vitro tanlash" va RNKga asoslangan tanib olish deb atashgan.
aptamer elementlari. Robertson va Joys (1990) ko'rsatdiki, ribozim,
RNK molekulasini parchalaydi, DNK ketma-ketligini parchalash uchun rivojlanishi mumkin
yo'naltirilgan molekulyar evolyutsiya. Ushbu tadqiqotlar ikkita umumiy narsaga ega: qurilish
RNK molekulalari hovuzi va molekulalarni boyitishning samarali usulini ishlab chiqish,
qiziqtirgan vazifani bajaring. Bu usullar ikkalasi ham tabiiy tanlanishga o'xshaydi
jarayonlar o'zgaruvchanlik, tanlash va kuchaytirish bilan tartibga solinadi. Biroq, asosiy farq shundaki
in vitro tanlovi in vitro ichida amalga oshirilishi mumkin
haftalar, tabiiy tanlanish esa ancha uzoqroq vaqt oralig'ida sodir bo'ladi (minglab
yil yoki undan ko'proq).
In vitro tanlov dastlab funktsional RNK ishlab chiqarish uchun yaratilgan bo'lsa-da
molekulalar, u tezda DNK nusxalarini ajratib olish uchun kengaytirildi. Birinchi DNK
aptamerlar 1992 yilda tasvirlangan: Ellington va Szostak (1992) DNK izolyatsiyasini tasvirlab bergan.
organik bo'yoqlar guruhi uchun aptamers va Bock va uning hamkasblari
inson trombini bog'laydigan DNK aptamerlari haqida xabar berdi (Bock va boshq., 1992). Bu tadqiqotlar
keyin 1994 yilda Breaker va tomonidan birinchi DNaseme haqida hisobot
Joys: Tasodifiy ketma-ketlikdagi DNK hovuzidan ular DNK-zimni ajratib olishdi.
DNKga kiritilgan RNK aloqasining Pb2+ ga bog'liq bo'linishini amalga oshirish
ketma-ketlik (Breiker va Joys, 1994).
In vitro DNK-zimlarni tanlash bir zanjirli DNKning to'planishidan boshlanadi, bu esa
1016 tagacha noyob ketma-ketlikni o'z ichiga olishi mumkin. Bu DNK hovuzi (yoki DNK kutubxonasi)
avtomatlashtirilgan DNK sintezi yordamida olinishi mumkin. Sintez va tozalashdan keyin
kutubxonadan kimyoviy reaksiyani tezlashtiradigan yechim topish so‘raladi. Mayli
deylik, biz fosfodiester aloqasini kesuvchi DNKzimlarni qidiramiz
RNK substratining ichida taniqli fosfoester uzatish mexanizmidan foydalangan holda
rasmda tasvirlangan. 1a. Bunday holda, DNK kutubxonasi shunday o'zgartiriladiki
kutubxonadagi har bir variant substrat RNKni o'z ichiga oladi. DNK molekulalari qodir
Ushbu mexanizm bilan biriktirilgan RNK substratining bo'linishi qisqaradi va mumkin
katalitik faol bo'lmagan variantlardan oddiygina kattaligi bo'yicha ajratiladi. izolyatsiya qilingan DNK
molekulalar yangi hosil qilish uchun polimeraza zanjiri reaktsiyasi (PCR) orqali kuchaytirilishi mumkin
kutubxona endi katalitik faol molekulalarning kattalashtirilgan nusxalarini o'z ichiga oladi. Oldingi
tanlovning keyingi bosqichi boshlanishiga qadar, ikki qatorli o'zgartirish kerak
Antisens inhibisyonining oldini olish uchun PCR ishlab chiqarilgan DNKni bitta zanjirli DNKga qaytardi.
katalitik faol DNK ketma-ketliklari ularning komplementar zanjirlari bo'yicha. Izolyatsiya jarayoni va
yutuq tanlovning bir bosqichi sifatida baholanadi. Ko'pincha bir nechta
yuqori foizni o'z ichiga olgan DNK hovuzini yaratish uchun turlar kerak
RNKni parchalovchi DNKzimlar (1b-rasm).
Odatda, in vitro tanlash uchun molekulalar hosil bo'ladi, ularda yo'q
kerakli katalitik faollik. Bu molekulalar qandaydir tarzda tanlovda namoyon bo'ladi
turli omillar ta'sirida jarayon. Bu molekulalarning avlodi, ba'zan
"molekulyar parazitlar" deb ataladigan qattiq sharoitlarni qo'llash orqali oldini olish mumkin
katalitik faol molekulalarni tanlash imkonini beradi (to'xtatuvchi va
Joys 1994). Ushbu shartlarni amalga oshirish odatda bir necha marta sodir bo'ladi
katalitik faol DNK ketma-ketliklariga omon qolish uchun ko'proq imkoniyat berish uchun dastlabki turlar
tanlash jarayoni. Mutatsiyalar, shuningdek, izolyatsiya qilish uchun qat'iy shartlar bilan birga kiritilishi mumkin.
ko'proq tajribali DNKzimlar. Tugallanadigan turlar soni
aholining faolligiga bog‘liq. Aholining qoniqarli darajasini ko'rsatishi bilanoq
tadqiqotchi tomonidan aniqlangan individual DNK-zimlarning katalitik faolligi
keyin ketma-ketlik bilan aniqlash mumkin. In vitro tanlovining eng diqqatga sazovor xususiyati kirishdir
hisoblagich tanlashning qat'iy bosqichi. Agar juda erta qo'llanilsa, qarshi tanlov beixtiyor bo'lishi mumkin
Kamdan-kam uchraydigan, ammo kerakli DNK fermentlarini yo'q qiling.
Kichik ketma-ketlik takrorlanuvchi motivlar, masalan, RNK-parchalovchi DNKzim deb ataladi
Keyinchalik tasvirlanadigan 8-17, urinishlar uchun katta qiyinchilik tug'dirishi mumkin
in vitro tanlash orqali turli DNKzim ketma-ketliklarini izolyatsiya qilish maqsadida. 8-17 edi
kichik o'lchamlari tufayli turli xil kutubxonalardan turli laboratoriyalar tomonidan bir necha marta tanlangan,
manba kutubxonasida o'zgaruvchanlik va yuqori chastota. Yana bir muhim
In vitro tanlash bilan bog'liq muammo - bu bo'lishi mumkin bo'lgan ketma-ketlik maydonining cheklangan miqdori
bitta tajribada olingan. Tasodifiy ketma-ketlik bilan DNK ketma-ketlik maydoni
kutubxonaning o'lchami 4n, bu erda n - tasodifiy ketma-ketlikdagi nukleotidlar soni
mintaqa. N50 tasodifiy hovuz 450 yoki 1030 noyob ketma-ketlikdan iborat; Biroq,
faqat 1013-1016 xil o'z ichiga olgan sintetik DNK hovuzini yaratish mumkin
ketma-ketliklar. Barcha 450 ketma-ketlik variantlarini qamrab olgan to'liq ketma-ketlik kutubxonasini yaratish
3107 kg DNK talab qilinadi (Schlosser va boshq. 2009). Natijada, ketma-ketlik
fazoni to'liq o'rganib bo'lmaydi.
In vitro tanlov tadqiqotchilarga markazdan tashqariga chiqish imkoniyatini berdi
bir zanjirli DNK ketma-ketligini izolyatsiya qilish orqali molekulyar biologiya dogmasi
yoki ma'lum bir tanlangan maqsadni tanib olish yoki ma'lum bir kimyoviy katalizlash orqali
konvertatsiya qilish yoki ikkala funktsiyani bajarish. Ko'p in vitro tanlov tajribalari
qiziqarli DNK-zimlarni oldi, keyinchalik ular keng qo'llanilishini topdi. DA
qolgan bo'limlarda biz bir nechta misollarni muhokama qilamiz. Zn2+ (Li va boshq. 2000), Mg2+ (Cruz va boshq.) o'z ichiga oladi.
boshqalar 2004; Folhammer va Famulok
1996), Ca2+ (Folhammer va Famulok, 1996), Mn2+ (Kruse va boshq., 2004) va Cd2+.
(Kasprovitz va boshq., 2015).
8-17 va 10-23 o'rtasidagi funktsional farqlar har bir DNKzimning bo'lishiga imkon beradi
noyob ilovalar uchun ishlatiladi. 8-17-ilovalar asosan e'tiborga olingan
metall ionlarini aniqlash va molekulyar hisoblash, 10-23 potentsial uchun keng qamrovli o'rganilgan.
terapevtik ilovalar. Keyinchalik, birinchi DNazim tanlangan.
u past konsentratsiyalarda Pb2+ ni aniqlash imkonini beruvchi 8-17 motifini o'z ichiga olganligini tushundi.
(Breaker va Joys, 1994; Li va Lou, 2000). Li va Lu qanchalik muhimligini tushunishdi
Pb2+ datchiklarini ishlab chiqish inson salomatligi uchun xavflidir, chunki Pb2+ darajasi 480 nM dan oshadi.
qonda toksik (Li va Lu 2000). DNKzim Pb2+ ning kashfiyoti sabab bo'ldi
lyuminestsent, kolorimetrik, elektrokimyoviy,
elektrokimyoluminesans va elektr usullari (Schlosser va Li
2010; Xiang va Lu, 2013). Bu usullar boshqa metallga ham qo'llanilgan.
bo'limda tasvirlangan ion sensori. 2.2.
Bundan tashqari, molekulyar hisoblar sifatida 8-17 dan foydalanish mumkinligi birinchi marta ko'rsatildi.
Stojanovic va uning hamkasblari tomonidan qurilma (Stojanovic va boshq. 2002). masalan, mantiq
eshiklar DNK-zimlarni faollashtiruvchi effektor oligonükleotidlar bilan yoqilgan va
bu o'z navbatida mantiqiy kanalga aylantirilgan hisobot kanalini yaratdi.
funktsiyasi. 8-17 dyuymni kiritish orqali yanada qiziqarli hisoblash tizimlari namoyish etildi
yarim va to'liq qo'shimchalar, o'yin mashinalari kabi mantiqiy sxemalar
(MAYA) va signal kaskadlari (Lakin va boshq. 2017). Bunday hisoblash qurilmalari
virusli va bakterial genlarni aniqlashda muvaffaqiyat ko'rsatdi (Lakin va boshq. 2017).
O'shandan beri 10-23 DNAzim uchun arizalar uning terapevtik salohiyatiga e'tibor qaratishga moyil bo'ldi
10-23 har qanday RNK ketma-ketligini bog'lash va ajratish uchun mo'ljallangan bo'lishi mumkin,
Birinchi marta Santoro va Joys tomonidan ko'rsatilgandek, ular 10-23 dan bir nechta o'zgarishlardan foydalanganlar.
OIV-1 gagipol, env, vpr, tat va ner mRNKni faolsizlantirish (Santoro va Joys, 1997).
Demak, ko'plab tadqiqotchilar 10-23 ni bostirish uchun ishlatilishi mumkinligini ko'rsatdi
virusli va bakterial infektsiyalar, saraton bilan bog'liq mRNK turlarining ifodasi,
va yurak-qon tomir, yallig'lanish va nevrologik kasalliklarni keltirib chiqarmasdan
immunitet reaktsiyasi yoki uy egasiga toksik ta'sir (Fokina va boshq., 2015). Klinik sinovlar
10-23 ning bir nechta versiyalari karsinomani nishonga olish uchun amalga oshirildi va
yallig'lanish (Cho va boshq., 2013; Grassi va Grassi, 2013; Homburg va boshq., 2013).
DNKzimlar c-jun va GATA-3 ifodasini pastga tartibga solish orqali harakat qiladi. Klinik bosqich I
c-jun mRNK ifodasini kamaytirish orqali harakat qiluvchi DNKzim Dz13 bilan tadqiqot,
yakunlandi va ma'lumotlar Dz13 ni qo'llash o'simta hajmini kamaytirishini ko'rsatadi
va nazorat bilan solishtirganda o'simta hujayralarida c-Jun ifodasi (Fokina va boshq.
2015). SB010, DNK-zimlarga qaratilgan GATA-3 mRNK bilan I bosqich klinik sinovi,
allergik bronxial astmani davolash uchun. Davolash SB010
nazorat guruhiga nisbatan o'pka funktsiyasini yaxshilash. Dz13 va SB10 ham ko'rsatildi
barcha boshqariladigan dozalarda xavfsiz va yaxshi muhosaba qilinadi (Fokina va boshq., 2015). 2 DNK-zimning vakili
2.1 DNK qish 8-17 va 10-23
Bugungi kunga qadar eng ko'p o'rganilgan ikkita DNK-zim 8-17 (3a-rasm) va 10-23 (3b-rasm).
RNKni parchalaydigan DNK qishlari Santoro va Joys (1997) tomonidan aniqlangan. Ikkala DNK qishi
barcha RNK substratlarini, shuningdek, kimerik DNK/RNKni bog'lash va parchalashga qodir
DNK zanjiriga ko'milgan RNKning bir birligini o'z ichiga olgan substratlar. Garchi ikkalasi ham
DNKzimlar o'xshash ikkilamchi tuzilishga ega, ularning maqsadli substratlari boshqacha. bu
10-23 har qanday purin pirimidinida RNK ketma-ketligini ajratish uchun mo'ljallangan bo'lishi ko'rsatilgan.
tugun; aksincha, original 8-17 faqat RNK substratini parchalashi mumkin.
bo'linish joyiga ulashgan GT tayanch juftligi bilan (Santoro va Joyce 1997). LEKIN
Bir necha yil o'tgach, bizning guruhimiz 8-17 ketma-ketlikning ko'plab variantlari mavjudligini aniqladi
Ximerik DNK/RNKdagi har qanday RNK dinukleotid birikmasini birgalikda parchalashi mumkin
ketma-ketlik (Kruse va boshq. 2004; Schlosser and Lee 2010). Bundan tashqari, tergov
8-17 va 10-23 katalitik yadrolar ikkala DNK-zimning katalitikni saqlab qolishi mumkinligini ko'rsatdi.
asosiy katalitik qoldiqlar o'zgarishsiz qolar ekan, faollik va strukturaviy
yaxlitlik saqlanadi (Vang va boshq. 2010). Qizig'i shundaki, katalitik yadroni o'rganish 8-17
va 10-23 10-23 ekanligini isbotladi
maxsus variant 8-17 (Wang va boshq. 2010). 8-17 ko'pchilik tomonidan mustaqil ravishda ajratilgan
marta ikki valentli metall ionlarining turli kofaktorlaridan foydalangan holda turli tadqiqot guruhlari tomonidan 2,2 UO2
2+ DNazim
DNKzimlar metall ionlarini aniqlash uchun juda mos keladi, chunki DNKzimlar yordamida yaratilishi mumkin
o'ziga xos metall ioniga bog'liq. Metall ionlari DNK-zimlarning buklanishiga yordam berishi mumkin va mumkin
hatto katalizda muhim rol o'ynaydi. Ko'p RNK parchalanadigan DNK qishlari namoyon bo'ladi
inson salomatligi uchun zararli bo'lgan metall ionlari uchun yuqori o'ziga xoslik, masalan, Pb2 +
(Breiker va Joys, 1994), UO2
2+ (Liu va boshq. 2007) va Hg2+ (Hollenstein va boshq. 2008),
xabar qilingan. Bir yorqin misol - UO2 uchun RNKni parchalovchi DNKzim.
2+
(3c-rasm). UO2 uchun juda sezgir va o'ziga xosdir.
2+: o'rnatilgan lyuminestsent sensori
bu DNKzim bilan 1 million UO2 selektivlikka erishish mumkin edi.
2+ yana
boshqa metall ionlari va aniqlash chegarasi 45 pM UO2
2+ (Liu va boshq., 2007).
Uranning kashf etilishi inson salomatligi uchun muhim ahamiyatga ega; yuqori
Uranga ta'sir qilish buyraklar, miya va jigarning normal ishlashini buzishi mumkin.
(Nguyen va boshq., 2017). AQSh atrof-muhitni muhofaza qilish agentligiga ko'ra
(EPK), uranil ionlarining biologik mavjudligi uchun zarur, UO2
2+, mast
nazorat ostida suv. Atrof-muhitni muhofaza qilish agentligi ifloslanishning maksimal darajasini aniqladi
UO2
Ichimlik suvida 2+ 130 nM (Li va boshq. 2008). Floresan, kolorimetrik,
UO2 bilan bog'liq elektrokimyoviy va elektr signalizatsiya usullari
2+ DNazim
EPKning aniqlash chegarasiga mos keladigan darajada sezgir. UO2
2+
Rivojlanish ehtiyojini qondirish uchun DNKzim biosensorlari qo'llanilgan
real vaqtda UO2 ni aniqlash va miqdorini aniqlash uchun oddiy, ishlatish uchun qulay usul
2+. Floresan markalash usullari, masalan, florofor yoki söndürücü bilan kovalent bog'lanish
DNKning oxiri yoki ichki hududi eng past aniqlash sezuvchanligini ko'rsatdi
UO2
2+ (45 pM) (Liu va boshq. 2007). Kabi etiketlanmagan lyuminestsent usullar
UO2 dupleks mintaqasida tashqaridan bog'langan florofor
2+ DNazim,
oddiyroq va tejamkor tizimni ta'minlaydi, shu bilan birga, aniqlash sezgirligi
3 nM ga kamayadi (Xiang va boshq. 2010). Elektrokimyoviy usullar ham qo'llaniladi.
taxminan 1 nM UO2 ni aniqlash uchun ko'rsatilgan
2+ tegishli immobilizatsiya orqali
Oltin elektrodlar yuzasida DNKzim (Tang va boshq. 2013). huzurida
UO2
2+, immobilizatsiyalangan DNKzim parchalanadi va ferrotsenni chiqaradi, elektroaktiv
molekula, oltin elektroddan. Bu oqimning pasayishiga olib keladi. Boshqa
UO2 ni aniqlash uchun ma'lum glyukometr yordamida usul
2+ ko'rsatilgan
9,1 nM UO2 aniqlash chegarasini ta'minlash
2+ (Xiang va Lu, 2011). UO2
2+
DNazim va invertaz (saxarozaning fruktoza va glyukozaga gidrolizlanishini katalizlovchi ferment)
komplekslar magnit boncuklar ustida immobilizatsiya qilinadi. Qachon UO2
2+ ha
hozirgi vaqtda ajralgan DNK-invertaz kompleksi eritmaga chiqariladi va
Chiqarilgan invertaz saxarozani glyukozaga gidrolizlaydi. Glyukoza miqdori aniqlanadi
aniqlash uchun shaxsiy qon glyukoza o'lchagich (PGM) va PMG ko'rsatkichlaridan foydalanish mumkin
UO2
2+ konsentratsiya; Eritmadagi DNK-invertaz komplekslari proportsionaldir
UO2 ga
Sinov namunasida 2+. PGM portativligi joyida aniqlash imkonini beradi
UO2
2+. Shu bilan bir qatorda, oltin nanopartikulyar (AuNP) tizimi oddiy beradi
UO2 ni aniqlash
2+ yalang'och ko'z bilan aniqlanishi mumkin bo'lgan rang o'zgarishidan foydalanish.
rang o'zgarishiga agregat (ko'k/binafsha) va dispersiya (qizil) holati ta'sir qiladi.
AuNP. Belgilangan va etiketlanmagan AuNP usullari kirishga ruxsat beruvchi past darajadagi aniqlashni ta'minlaydi
hujayralar va RNKni himoya qilish uchun fotosensitiv o-nitrobenzil guruhi
NaA43 qismi (Torabi va boshq. 2015). Ushbu o'zgartirilgan NaA43 kompleksi ishlatilgan
HeLa hujayralari va hujayradan tashqari muhitdan Na + ning induktsiyalangan oqimi bilan,
30 daqiqa ichida floresansning ortishi kuzatildi (Torabi va boshq. 2015). Endogen, Na+ ichkarida
hujayra 9–19 mM bo'lib, NaA43 daraja hosil qila olmaydi
signal. Ushbu muammoni hal qilish uchun NaA43 ni birlashtirgan strategiya ishlab chiqilgan
signalni kuchaytirish uchun katalitik soch ipi (CHA) bilan (Wu va boshq. 2017). DA
HeLa hujayralarida endogen Na+ mavjudligi, Na+ DNKzim vositachiligida Na+ boʻlinishini keltirib chiqaradi.
va primerga o'xshash fragmentni chiqaradi. Buzilgan parcha
CHA kuchaytirilishini boshlaydi va flüoresansni yoqish signalini ishlab chiqaradi. Nihoyat,
EtNa alkogol tarkibini 5% farq bilan aniq o'lchashi ko'rsatilgan
tijorat alkogolli ichimliklar, bu EtNa ning ishlashini ko'rsatadi
murakkab matritsa (Zhou va boshq. 2015a).
3 Bakteriyalar uchun DNKzimlarga asoslangan muhandislik biosensorlari
Patogenni aniqlash
Guruhimiz RNKni parchalaydigan turli DNK-zimlarni topishga qiziqdi.
va ulardan oddiy va ishlatish uchun qulay biosensorlarni yaratish uchun foydalanish.
(Schlosser va Li, 2009; Liu va boshq., 2017; Morrison va boshq., 2018). Ushbu bo'limda biz
bakteriyalarga sezgir RNKni parchalovchi RNKlarni ishlab chiqish bo'yicha so'nggi harakatlarimiz haqida gapiring
DNK-zimlar va ularni aniqlash uchun biosensor tizimlarini ishlab chiqishda foydalanish
bakterial patogenlar. Biz RNK parchalanishini rivojlantirishdan ayniqsa manfaatdormiz
katalizni floresan hosil qilish bilan bog'laydigan florogen DNKzimlar (RFD).
Ushbu DNKzimlar juftlik o'rtasida joylashgan RNK aloqasini yo'q qilish uchun mo'ljallangan
bir zanjirli DNK ketma-ketligida ftorfor/söndüruvchi modifikatsiyalangan nukleotidlar;
Ushbu funktsiya bilan ular real vaqtda lyuminestsent lampalar sifatida qulay foydalanishlari mumkin.
datchiklar (Tramvay va boshq. 2012; Ali va boshq. 2012).
3.1 Bakteriyosensitiv RFDlarni in vitro tanlash
Erdagi inson hayoti davomida mikroblar hamma joyda mavjud bo'lgan.
va bizning omon qolishimizda ajralmas rol o'ynagan. Biroq, afzalliklarga qo'shimcha ravishda
ular bakteriyalarni ham antagonist sifatida ishtirok etishini ta'minlaydi. Ko'pincha patogenlar
ifloslangan oziq-ovqat va suv manbalaridan, sirtlardan, atrof-muhitdan,
va hayvonlar va inson vektorlari (Schurch va Siezen 2010). Chiroqdan keyin
sodir bo'lgan bo'lsa, bakterial manbani shtamm darajasiga qadar aniqlash va izolyatsiya qilish juda muhimdir
yoki keyingi infektsiyani va uzatishni oldini olish uchun pastki tur. DNazim
ma'lum bir patogen uchun juda xos bo'lgan zond qimmatli hisobot sifatida ishlatilishi mumkin
tizimi. Bundan tashqari, yaqinda bakteriyalar befarqlikda katta rol o'ynashi ko'rsatildi, 50 nM
va 1 nM, mos ravishda (Li va boshq. 2008). Belgilangan AuNP usullari
UO2 mavjudligida "o'chirish sensori" ni taqdim eting
2+, UO2
2+ DNKzim bilan belgilangan AuNP agregatlari qismlarga bo'linadi va disperslanadi, bu esa rangi o'zgarishiga olib keladi.
binafshadan qizilgacha. Belgilanmagan AuNP usullari "o'chirish sensori" ni ta'minlaydi
UO2 mavjudligi
2+, RNK parchalanishi UO2
Yagona ajratish uchun 2+DNKzim
AuNP yuzasida adsorbsiya uchun DNK. Qo'shimcha bilan
NaCl, bir zanjirli DNK bilan bog'langan AuNPlar yig'ilmaydi, natijada
Qizil rang. Nihoyat, UO2 ni hujayra ichidagi aniqlash
UO2 yordamida jonli hujayralarda 2+
2+
DNAzim bilan belgilangan AuNP tizimi metall ionlarini tushunishga yordam beradigan usullarni taklif etadi.
hujayralar ichida lokalizatsiya va tarqatish. AuNP-DNK komplekslari oson
HeLa hujayralari tomonidan so'riladi va UO2 ishtirokida
2+, RNK parchalanishi ajralib chiqadi
bo'lishi mumkin floresan oshirish uchun florofor dan söndürme
kashf etilgan (Wu va boshq. 2013).
2.3 Na+ DNKzim
Oxirgi yigirma yil ichida uni rivojlantirish bo'yicha keng qamrovli tadqiqotlar olib borildi
Ikki valentli metall ionlariga bog'liq DNKzimlar. Biroq, yaqinda qiziqish
Bir valentli DNK-zimlarni izolyatsiya qilish biosensorlarni yo'naltiruvchi ustuvor ahamiyatga ega
Na+ kabi monovalent ionlar bo'lgan biologik tizimlar va jarayonlar
, o'ynang
hal qiluvchi rol (Torabi va boshq. 2015). Bir valentli metallni ishlab chiqishga oldingi urinishlar
ion bilan faollashtirilgan DNK-zimlar faqat past katalitik tezligi bo'lgan DNK-zimlarni hosil qiladi;
zaif sezuvchanlik va selektivlik (Faulhammer va Famulok 1997; Geyer va Sen
1997 yil; Carrigan va boshq. 2004). Biroq, hozirgi tadqiqotlar ushbu muammoni hal qiladi
yuqori sezgir va selektiv Na + ning izolyatsiyasi
- faollashtirilgan RNKni parchalovchi DNK-zimlar:
NaA43 (3d-rasm), Ce13d (3e-rasm) va EtNa (3f-rasm). NaA43 Torabi tomonidan ajratilgan.
va hamkasblar; DNAzym qodir lyuminestsent sensorga aylantirildi
Na + ning boshqa metall ionlariga nisbatan 10 000 marta selektivligiga erishish, aniqlash
mavjud bo'lganda 0,1 min1 kuzatilgan doimiy tezlik
400 mM Na+ (Torabi va boshq., 2015). Qizig'i shundaki, Ce13D, yana bir Na +
Tarkibida uch valentli lantanid Ce3+ga nisbatan katalitik faollikka ega DNKzim
NaA43 bilan bir xil Na + bog'lash motivi, garchi ular ikki xil va alohida bo'lsa ham
Shaklda ko'rsatilganidek, in vitro tanlov tajribalari o'tkazildi. 3d, f (Torabi
va Lu 2015; Zhou va boshq. 2015b). Na+ uchun Kd Ce13D ekanligi aniqlandi
20-40 mM (Chjou va boshq., 2016a, b), Ce13D esa faqat faol edi.
Ce3+ va Na+ ning bir vaqtning o'zida mavjudligi
. EtNa izolyatsiyasi, Chjou va
hamkasblar DNAzimning ko'p qirrali funksionalligini namoyish etdilar. EtNa aniqlay oladi
Ko'p miqdorda etanol va DMSO (72%) mavjudligida Na + (Chjou va boshq.
2015a). Na+ borligida ham
, EtNA faolligi 1000 baravar yuqori
etanol suvga qaraganda.
Na+ DNK-zimlaridan foydalanish hujayra ichidagi aniqlash uchun moslashtirilgan va
Na+ signalizatsiyasi
va organik erituvchilarda Na+ ni aniqlash. Floresan NaA43 hujayra ichidagi aniqlash uchun ishlatilgan.
inson salomatligi va saraton kabi kasalliklar uchun alfa spiral katyonik polipeptidlar bilan o'zgartirilgan,
diabet, semizlik, infektsiyalar va yallig'lanish (Mager 2006; Upadhyaya va Banerjee 2015; Jon
va Mullin 2016).
Shunday qilib, DNKzim problari tejamkor diagnostikani ishlab chiqish uchun ishlatilishi mumkin.
bu kasalliklar.
Biz izolyatsiya qilish uchun ishlatilishi mumkin bo'lgan in vitro tanlash usulini ishlab chiqdik
bakteriyalarni tanib olish uchun tasodifiy ketma-ketlik hovuzlaridan bakteriyalarga sezgir yuqori o'ziga xos RFD
birinchi navbatda ma'lum bir biomarkerni aniqlashga hojat qoldirmasdan qiziqish
bakteriyalar uchun. Bu ikki marta tanlashni amalga oshirish orqali amalga oshiriladi
ikki asosiy bosqichdan iborat strategiya: qarshi tanlash, qaysi davomida DNK hovuz
DNKni olib tashlash uchun mo'ljallanmagan bakteriyalarning xom hujayra aralashmasi bilan inkubatsiya qilinadi
o'zaro reaktiv faollikka ega bo'lgan molekulalar, keyin ijobiy tanlov, bu erda
qarshi tanlov bosqichidan DNK hovuzining reaktiv bo'lmagan qismini inkubatsiya qilish.
taxminiy bakteriyaning xom hujayra aralashmasi bilan (2-rasm). Biz namoyish qildik
ikki mo'ljallangan bakterial sensorlar bu yondashuv samaradorligi
ikki xil bakteriyalar yordamida turli tadqiqotlar: Escherichia coli (E. coli) va
Clostridium difficile (S. qiyin). E. coli tadqiqotida (Ali va boshq. 2011), biz izolyatsiya qildik
RFD Bacillus yordamida 20 tur tanlovdan keyin RFD-EC1 nomini oldi
subtilis (B. subtilis) qarshi tanlov bakteriyasi va E. coli musbat tanlov maqsadi sifatida. Biz
RFD-EC1 ga qarshi kuchli tanazzulga uchragan faollikni namoyon etishini aniqladi
E. coli, lekin B. subtilisga nisbatan zaif faollik, shuningdek, ko'plab boshqa bakteriyalar (Ali
va boshqalar. 2011). RFD-EC1 faqat mavjudligida aniqlanadigan signalni ishlab chiqishi mumkin
1000 E. coli xujayralari madaniyat bosqichi va bitta koloniyani aniqlashsiz
12 soatlik etishtirishdan keyin birlik hosil bo'lishi (Ali va boshq. 2011).
C. difficile (Shen va boshq. 2016) bilan ishlash uchun biz xuddi shu narsani ko'rsatdik.
BI/027-H ni ajrata oladigan RFDlarni ajratib ko'rsatish uchun tanlash yondashuvidan foydalanish mumkin,
C. difficile ning boshqa shtammlardan gipervirulent, antibiotiklarga chidamli shtammi
C. difficile, shuningdek, boshqa turdagi bakteriyalar. Ushbu tadqiqotda BI/027-H sifatida foydalanilgan
ijobiy tanlov maqsadi, E. coli, B. subtilis va CD630 (BI/027 bo'lmagan shtamm)
C. difficile) qarshi tanlov maqsadlari sifatida ishlatilgan. 25 raunddan keyin
naslchilikda biz RFD-CD1 deb nomlangan RFDni ajratib oldik, bu nafaqat turlarga xosdir.
balki kuchlanish-selektiv.
Xuddi shu yondashuv RFDlarni izolyatsiya qilish uchun ham qo'llanilgan, bu maxsus bo'lishi mumkin
sutemizuvchilar hujayralari tomonidan faollashtirilgan. Aniqrog'i, biz juda selektivlikka erishdik
MDA-MB-231, ko'krak saratoni hujayrasini tan olish uchun AAI2-5 nomli RFD (He va boshq.
2014). AAI2-5 hujayra lizatidan foydalangan holda 25 tur tanlovdan so'ng olingan
MCF-10A (normal ko'krak hujayra liniyasi) salbiy tanlash maqsadi sifatida va
MDA-MB-231 ijobiy tanlov maqsadi sifatida. AAI2-5 ajrata oladi
MDA-MB-231 boshqa ko'plab inson hujayralari, shu jumladan oddiy ko'krak hujayralari,
va ko'krak saratoni hujayralarining boshqa kichik turlari.
Bizning uchta tadqiqotimiz natijalari shuni ko'rsatadi
Ikkilamchi tanlash strategiyasi mos hujayra chiziqlari bo'lganda yuqori tanlangan RFDlarni olish imkonini beradi
kiruvchi o'zaro reaktivlikni bartaraf etish uchun salbiy maqsadlar sifatida tanlangan. Kalit
Ushbu yondashuvning afzalligi shundaki, u ma'lum bir biomarkerdan foydalanishni talab qilmaydi.
DNKzimni tanlash; o'rniga, potentsial DNKzim davomida o'z maqsadini topadi
rasmda ko'rsatilganidek tanlash. 4. Bundan tashqari, RFD-CD1 kesilganlarni tanib ko'rinadi
TcdC versiyasi, 6-aminokislota transkripsiya omili
BI-027-H shtammi bilan bog'liq bo'lgan ichki kesish, lekin boshqalar emas
C. difficile shtammlari (Shen va boshq., 2016). Bu buyuklikning ajoyib namunasidir
RFDlar erisha oladigan o'ziga xoslik darajasi.
3.2 Bakteriyalarni DNKzim vositachiligida kolorimetrik aniqlash
patogenlar
RFD ham afzalliklarga ega bo'lgan kolorimetrik tahlillarni o'rnatish uchun ishlatilishi mumkin
yalang'och ko'z bilan arzon va oson talqin qilinishi mumkin. Masalan, bizda bor
klassik ishlatadigan E. coli ni aniqlash uchun kolorimetrik tahlilni ishlab chiqdi
lakmus testi va RFD-EC1 (Tramvay va boshq. 2014). Tahlil magnit boncuklardan foydalanadi.
protein fermenti ureaza bilan belgilangan RFD-EC1 tomonidan immobilizatsiyalangan
(5a-rasm). DNKzim E. coli tomonidan faollashtirilganda, u parchalanadi va tashlanadi.
magnit boncuklar eritma ichiga, ular bilan etiketli ureaz olib. Bu qaror
to'plangan va pH-sezgirni o'z ichiga olgan yangi eritmada karbamid gidrolizi uchun ishlatiladi
fenol qizil bo'yoq (5b-rasm). Karbamidning gidrolizi ammiak hosil bo'lishiga olib keladi, natijada pH paydo bo'ladi
sariqdan pushti rangga o'zgarishi bilan birga ko'tariladi (Tramvay va boshq. 2014). Bu
oddiy usul 500 tagacha E. coli hujayralarini aniqlashi mumkin.3.3 Faollashgan bakteriyalar bilan chop etilgan qog'oz sensorlar
DNA qish
Bakteriyalarga javob beradigan DNKzimlar qog'ozga asoslangan sensorlarni ishlab chiqarish uchun ham ishlatilishi mumkin. Per
Misol uchun, biz yaqinda E. coli uchun qog'oz sensori yordamida amalga oshirilishi mumkinligini ko'rsatdik
RFD-EC1 va pullulan (Ali) o'z ichiga olgan maxsus ishlab chiqilgan siyoh yordamida inkjet bosib chiqarish
va boshqalar. 2017). Pullulan juda jozibali xususiyatga ega polisakkariddir: quritilganda,
uzoq vaqt davomida ushlangan biomolekulalarni barqarorlashtiradigan plyonkalarga qotib qoladi.
vaqt, lekin suvli eritmada oson eriydi (Jahanshahi-Anbuhi va boshq. 2014, 2016;
Hsi va boshq. 2017). Qo'lga olingan molekulalar juda uzoq saqlash muddatiga ega. Masalan,
pullulan bilan qog'oz yuzasiga chop etilganda, RFD-EC1 hech bo'lmaganda barqaror bo'lib qoladi
6 oy (Shay va boshq., 2017). Biroq, E. coli o'z ichiga olgan qo'shilganda
eritma, RFD-EC1 yorilib, yuqori darajadagi floresan signalni hosil qiladi
osongina kashf qilinadi. Sinov jarayoni oddiy va tushunarli va natijalar
talqin qilish oson (Ali va boshq. 2017). Atrof-muhit sharoitida saqlash paytida mahsulotning barqarorligi juda muhimdir.
ushbu aniqlash qurilmasi uchun afzallik; Tashish va saqlash uchun ideal
resurslari cheklangan hududlar.
4. Xulosa
dan katalitik faollikka ega bo'lgan bir zanjirli DNK ketma-ketliklarini ajratib olish qobiliyatimiz
tasodifiy ketma-ket DNK hovuzlari cheksiz muhandislik imkoniyatlarini ochib beradi
Amaliy ilovalar uchun DNKga asoslangan fermentlar. Ushbu bobda biz faqat
RNKni parchalovchi DNK-zimlarning tekshirilgan bir qancha misollarini muhokama qildi
toksik metall ionlari va bakterial patogenlarni aniqlash uchun terapevtik yoki sensorlar sifatida. bu
Ishonchim komilki, yanada ko'proq eng yaxshi DNKzimlar paydo bo'lishda davom etadi
in vitro tanlash bo'yicha tajribalar, bu esa yanada ilg'or terapiya, diagnostika,
shuningdek, boshqa foydali kimyoviy yoki biologik vositalar