15-Mavzu: Immunoferment usuli yordamida viruslarni diagnostika qilish

15-Mavzu: Immunoferment usuli yordamida viruslarni diagnostika qilish

Immunoferment usuli bu usul eng sezgir usuldir. Virus (AG) borligini boshqa usullar bilan aniqlab bo‘lmagan vaziyatlarda bu usul qo‘l keladi, ya’ni u bilan nanogramm miqdordagi viruslar (AG) larni aniqlasa bo‘ladi. Bu usulni qo‘llaganda AT va AG, AT bilan kon’yugat (ferment va AT kompleksi), ferment bilan substrat orasidagi reaksiyalar birorta qattiq fazada (polistirolda yoki poliamid membranada) olib boriladi

IFAning "sendvich" turi
Ishdan maqsad. IFAni o‘rganish va bu usul yordamida boshqa usullar sezgirligi etmagan hollarda va hujayrada juda kam to‘planadigan viruslarni har xil namunalarida aniqlashni o‘rganish.
Kerakli materiallar: Reaktivlar: immun AZ, peroksidaza yoki boshka ferment, natriy peryodat, K₂ HPO₄ , sefadeks G-200, triton-X-100, substrat (H₂O₂ va aminosalitsil kislotasi), kontrol zardob, virus namunalari, PEG (molekula massasi 6000) polistirol mikroplatlar (SHvetsariya firmasi chiqaradi) yoki poliamid membrana, termostat, xromatografiya kolonkasi, fraksiya o‘yuvchi kollektor, FEK, spektrofotometr, titrator T-107.
Ishning borishi. IFA viruslarni aniqlash quyidagi bosqichlarda olib boriladi:
1.IFA olib boriladigan polistirol platalar (yoki poliamid membranalari)ga ATlarni immobilizatsiya qilish;
2.AT va fermentdan sintezlangan kon’yugat-peroksidaza va AT;
3.IFAni amalga oshirish.
Avvalo polistirol plataga yoki poliamid membranaga immobilizatsiya qilinadigan ATni AZdan toza holda ajratib olish yoki gammglobulin qismini ajratib olish zarurdir. Globulin qismini ajratib olish uchun 10 ml AZ ga teng hajmda 20 % lik PEG solinadi va bu aralashma 15 mi
nut 8000 aylanish tezligida sentrifuga qilinadi. CHo‘kmaga tushgan AZ ni gammaglobulin qismi 10 ml 0,01 M kaliy fosfat (KFB) buferida eritiladi (pH 7,4). CHo‘ktirib so‘ngra yana qaytadan eritib tozalash ishlari ikki qayta olib boriladi. So‘ngra 4⁰C da kechasiga KFB da dializ qilinadi. Hosil bo‘lgan AZ ning globulin qismi polstirol plataga
immobilizatsiya qilishga va ferment bilan kon’yugat olishda ishlatiladi.
AZ ning globulin qismi bilan peroksidazadan kon’yugat olish.
5 mg peroksidazani 1ml sovutilgan distillangan suvda eritiladi va 0,2 ml 0,1 M natriy peryodat quyiladi, so‘ngra 7,4 lik 0,01 M KFB bilan dializ qilinadi. Dializdan so‘ng eritmaning pH 9,5 gacha ko‘tariladi va unga 5 mg pH 9,5 ga keltirilgan gamma globulin qo‘shiladi. Hosil bo‘lgan aralashma 2 soat davomida xona haroratida muntazam aralashtirilgan holda inkubatsiya qilinadi. Hosil bo‘lgan kon’yugatni eritmadagi boshqa
moddalardan tozalab olish uchun gelfiltratsiya yordamida G-200 markali sefadeks to‘latilgan kolonkadan (1,5x100 sm) KFB bilan elyusiya qilinadi. Olingan fraksiyalar spektrofotometr yordamida analiz qilinadi va kon’yugatni tashkil qilgan qism ajratib olinadi, konsentratsiyasi o‘lchanadi, ampulalarga solinadi va -20⁰C da muzlagan holda saqlanadi. Ishlatiladigan qismi ishdan oldin eritiladi.
Substrat tayyorlash. Issiq distillangan suvda 0,8 mg/ml lik 5- aminosalitsil kislotasi eritiladi va eritmaning pH ni 6,0 ga 1 n li KON yordamida keltiriladi.
IFA o‘tkazishdan oldingina tayyorlangan 5-aminosalitsil kislota vodorod peroksidi bilan 10:1 nisbatda aralashtirilib ishlatiladi.
Gammaglobulinning immoblizatsiya qilish uchun polistrol plashka ishlatiladi. Uning gamma globulin yoki ATni plashkaning har bir chuqurchalariga 200 mkl dan solinadi va 4^⁰C haroratda bir kechaga qoldiriladi. Immobilizatsiya qilinmagan ATlar bir minutdan 3 marta 0,05% triton X-100 solingan 0,01 M pH 7,4 bo‘lgan KFB bilan yuviladi.
Keyingi bosqichda reaksiya shu immobilizatsiya qilingan AT bilan aniqlanadigan virus (AG) orasida bo‘ladi. Uning uchun tozalangan virus yoki tekshiradigan virusli namuna shu mikroplat chuqurchalariga solinadi va bir soat davomida 37⁰C da sorbsiya qilinadi.
So‘ngra bog‘lanmagan AG va boshqa ortiqcha moddalar yuvib tashlanadi. Endi plashkaga 200 mkl kon’yugat solinadi va bir soat davomida 37⁰C da inkubatsiya qilinadi. Ortiqcha kon’yugat qam yuvilgandan so‘ng mikroplatalarga substrat solinadi. Peroksidaza oksidlanishidan so‘ng hosil bo‘lgan mahsulot oddiy ko‘z bilan aniqlanadi yoki 490 nm to‘lqin
uzunligida spektrofotometrda yoki absorbsnmetrda nur yutish darajasi o‘lchanadi (Platalarning jigar rangini ko‘p kamligiga qarab virusni mikdori aniqlansa ham bo‘ladi).