4-ma`ruza. Rekombinant dnk texnologiyasi

Burg R W., Miller B. M., Baker E. E., Birnbaum J., Currie S. A., Hartman R, KongY. L., 

Monaghan R L., Olson G., Putter I., Tunac J. B., Wallick  H., Stapley.,Oiwa R and Omura 

S.  2011.  Avermectins,  new  family  of  potent  anthelimintic  agents:  Producing  organism  and 

fermentation. Antimicrobial Agents and Chemotherapy15:361-367. 

 

---

 

 

 

 

Rekombinant  DNK  texnologiyasi  (shuningdek,  molekulyar  klonlash  yoki  genetik 

muhandislik)  -  bu  genetik  materialni  (DNK)  bir  organizmdan  boshqasiga  o'tkazishga  imkon 

beradigan  eksperimental  protseduralar.  Hozirgi  vaqtda  DNKning  alohida  bo'limlarini  kesish, 

DNK  sintezatorlarida  nukleotidlarni  (avtomatik  kimyoviy  DNK  sintezi  uchun  moslamalar) 

deyarli  cheksiz  miqdorda  olish,  nukleotidlar  ketma-ketligini  aniqlash  (ularni  ajratish,  tartiblash 

orqali) kuniga yuzlab kunlar, tanlangan genni o'zgartirish, kiritish. u yana madaniyatli hujayralar 

genomiga yoki bu o'zgartirilgan gen o'z faoliyatini boshlaydigan hayvonning embrioniga kiradi. 

Rekombinant  DNK  tajribalari  biologik  faol  moddalarni  sanoat  ishlab  chiqarishda  keng 

qo'llaniladi. Klonlash tajribalari quyidagi bosqichlarni o'z ichiga oladi. 

1.  Donor  organizmdan  mahalliy  DNKning  zarur  genlarini  (klonlangan  DNK,  kiritilgan 

DNK, maqsadli DNK, xorijiy DNK) ajratish. 

2.  Tozalangan  DNK  qismidagi  barcha  nukleotidlarni  tezda  dekodlash,  bu  genning  aniq 

chegaralarini va gen bilan kodlangan aminokislotalar ketma-ketligini aniqlashga imkon beradi. 

3.  Xost  hujayrasida  ko'payishi  mumkin  bo'lgan  klonlash  vektorining  cheklangan 

endonuklazalari bilan davolash.  

4.  Ikkita  DNK  parchalarini  DNK  ligazasi  bilan  yangi  rekombinant  molekula  -  «klon 

vektori - o'rnatilgan DNK» hosil bo'lishi bilan o'zaro bog'las 

5.  Ushbu  konstruktsiyani  xujayraga  (qabul  qiluvchiga)  kiritish,  u  erda  ko'payadi  va 

avlodlarga  uzatiladi.  Ushbu  jarayon  transformatsiya  deb  ataladi.  Transformatsiyadan  so'ng 

bakterial  hujayra  millionlab  bir  xil  hujayralar  tomonidan  klonlangan  DNK  parchasini 

ko'paytiradi.  

6.  Rekombinant  DNK  (o'zgartirilgan  hujayralar)  tashiydigan  hujayralarni  aniqlash  va 

tanlash.  

7.  Xost  hujayralari  tomonidan  sintez  qilingan  ma'lum  bir  protein  mahsulotini  olish  (6-

rasm). 

 

---

 

Rekombinant molekulalarning qurilishi bir qator fermentlar yordamida amalga oshiriladi  - 

bu murakkab jarayonning deyarli barcha bosqichlari uchun ajralmas va ajralmas vosita, birinchi 

navbatda  Rekstriktazachi  fermentlar  (Rekstriktazali  endonukleazalar,  Rekstriktaza  fermentlari). 

Rekstriktaza  fermentlari  Rekstriktaza  tizimining  ajralmas  qismidir  -  prokaryotik  hujayralarni 

modifikatsiyasi.  Ushbu  tizim  hujayralarni  begona  DNK  kirishidan  himoya  qilish  bilan  bog'liq. 

Modifikatsiya tizimi replikatsiyadan keyin darhol  tanib olish  joylarida o'z DNKini  metilatlaydi; 

hujayraga kiradigan xorijiy DNK, bakteriyalar Rekstriktaza fermenti yordamida gidrolizlanadi. 

Rekstriktaza  fermentlarining  uchta  asosiy  klassi  mavjud.  I  sinf  Rekstriktazali  fermentlar 

DNK  molekulalarini  o'zboshimchalik  bilan  parchalaydi,  I  va  III  sinflarning  Rekstriktaza 

fermentlari  metilatlash  va  endonukleazaga  ega.  Genetik  muhandislikda  ishlatiladigan  II  sinf 

fermentlari ikkita alohida oqsildan iborat: Rekstriktazali endonukleaz va metilazani o'zgartirish. 

Hozirgi kunda 400 dan ortiq turli xil rekstriktaza fermentlari qo'llaniladi. Ushbu fermentlar 

turli  xil  mikroorganizmlarni  sintez  qiladi.  Ularni  etishtirish  uchun  maqbul  sharoitlar  zarur 

(harorat, muhitning tarkibi va pH darajasi, kislorod kontsentratsiyasi va boshqalar). Hosildorlikni 

oshirish va ushbu fermentlarni ishlab chiqarish jarayonini standartlashtirish uchun Rekstriktazali 

endonuklaziv genlar E. coli ichiga klonlanadi. 

Rekstriktaza  fermentlari  ikki  qatorli  DNK  molekulasida  ma'lum  nukleotidlar  ketma-

ketligini  taniydi  va  ajratadi.  Molekulyar  klonlashda  donor  va  vektorli  DNKning  ajralishi  aniq 

belgilangan  joylarda  (saytlarda)  sodir  bo'lishi  muhimdir.  Rekstriktazachi  endonukleazalarning 

har bir fermenti DNKda ma'lum 4-6 nukleotidning ketma-ketligini «taniydi». Ko'p Rekstriktazali 

endonukleazlar bir-biridan teskari joylashgan bir nechta nukleotidlarning siljishi bilan DNKning 

ikkita ipida uzilishlar keltirib chiqaradi. Natijada, bitta zanjirni to'ldiruvchi uchlari har birida 4 ta 

nukleotidning "dumlari" bilan hosil bo'ladi ("yopishqoq" uchlari). Nukleotid zanjirini yopishqoq 

uchlari hosil bo'lishi bilan ajratish bilan rekstriktazadan tashqari, zanjirda bir-biriga qarshi qat'iy 

---

ravishda  DNK  hosil  bo'lishi  bilan  "to'r  uchlari"  bo'lgan  tanaffuslarni  keltirib  chiqaradigan 

Rekstriktazachi fermentlar mavjud. 

Faqat molekulyar klonlashda rekstriktaza fermentlari etarli emas, chunki yopishqoq uchini 

tashkil etuvchi to'rtta asos orasidagi vodorod aloqalari ikkita qo'shilgan DNK parchalarini ushlab 

turadigan  darajada  kuchli  emas.  Molekulaning  shakar-fosfat orqa  miya  bo'shlig'idagi  bo'shliqni 

bartaraf  etish  uchun  DNK  ligazasi  fermenti  yopishqoq  uchlarini  bir-biriga  ulashda  bir-biriga 

tutashgan  linukleotid  zanjirlarining  uchlari  o'rtasida  fosfodiester  aloqalarini  shakllanishini 

katalizlaydi. DNK ligazining kesishishi va to'mtoq uchlari. 

Shunday  qilib,  rekombinant  DNK  molekulasining  bir  qismi  klonlanishi  kerak  bo'lgan 

kerakli  genni  olib  yuradi,  boshqasi  esa  rekombinat  DNK  hujayrasida  ko'paytirish  uchun  zarur 

bo'lgan  ma'lumotlarni  o'z  ichiga  oladi.  Bundan  tashqari,  DNKni  rekstriktaza  paytida  turli  xil 

qismlar  hosil  bo'ladi  va  vektor  DNK  bilan  bog'lanishdan  (fosfetyter  bilan  bog'lanishdan)  so'ng 

turli xil birikmalar paydo bo'ladi, masalan, donor DNK parchalari va vektor DNK. Ikkinchisining 

sonini kamaytirish uchun Rekstriktaza vektorli DNK ishqoriy fosfataza bilan ishlov beriladi. 

Rekombinant DNKni kiritish uchun ikkita asosiy vektor ishlatiladi: 

1) Plazmidlar. 

2) Bakteriof 

Plazmidlar  bakterial  hujayra  genomining  1-3  foizini  o'z  ichiga  olgan  DNK  molekulalari 

shaklida  ekstrakromosomal  genetik  elementdir.  Barcha  bakteriyalarda  plazmidlar  mavjud. 

Ulardan  ba'zilari  o'zlarining  bir  hujayradan  ikkinchisiga  (P-plazmidlar)  o'tishini  ta'minlaydigan 

ma'lumotni o'z ichiga oladi, boshqalarida antibiotiklarga chidamlilik genlari (R-plazmidlar) yoki 

metabolitlardan  (degradatsiya  plazmidlari)  foydalanishga  javob  beradigan  maxsus  genlar 

to'plami  mavjud.  Har  bir  plazmidda  replikatsiyaning  boshlang'ich  joyi  mavjud  bo'lib,  bunda 

plazmidni  xost  hujayrada  ko'paytirish  mumkin  emas.  Agar  ikkita  yoki  undan  ko'p  plazmidlar 

bitta hujayrada birga bo'lolmasa, ular bir xil nomuvofiqlik guruhiga kiradi. Turli nomutanosiblik 

guruhlariga  kiruvchi  plazmidlar,  nusxalar  sonidan  qat'iy  nazar  bitta  hujayrada  erkin  mavjud. 

Ba'zi  mikroorganizmlarda bitta hujayrada 10 tagacha turli plazmidlar topilgan, ularning har biri 

o'z  funktsiyalarini  bajargan  va  o'ziga  mos  kelmaydigan  guruhga  tegishli.  Plazmidning 

replikatsiyasi  xromosoma  replikatsiyasidan  mustaqil  ravishda  sodir  bo'ladi.  Nusxalar  soni 

hujayraning tartibga solish tizimi tomonidan belgilanadi. 

Shunday  qilib,  plazmidlar  ularni  klonlangan  DNKni  uzatish  uchun  vektor  sifatida 

ishlatishga  imkon  beradigan  xususiyatlarga  ega.  Bunday  plazmidni  o'z  ichiga  olgan  bakterial 

klonni ushbu parcha ishlab chiqariladigan zavod bilan taqqoslash mumkin. 

Odatda,  plazmid  vektorlari  genetik  muhandislik  tomonidan  yaratiladi,  chunki  tabiiy 

(o'zgartirilmagan) plazmidlar "yuqori sifatli vektor" uchun zarur bo'lgan ba'zi xususiyatlarga ega 

emas: 

•  kichik  o'lcham,  chunki  ekzogen  DNKni  E.  coli  ga  o'tkazish  samaradorligi  plazmid 

uzunligi 15 ming juft nukleotidlarning pasayishi bilan kamayadi; 

   • Joylashtirilgan rekstriktaza joyi mavjudligi; 

•  rekombinant  DNKni  qabul  qiluvchi  hujayralarni  aniqlash  uchun  bir  yoki  bir  nechta 

selektiv genetik belgilar mavjudligi. 

Plazmidlar  hujayra  membranasining  o'tkazuvchanligini  oshiradigan  kimyoviy  moddalar 

yordamida  somatik  hujayralarga  kiritiladi.  Xususan,  plazmid  DNKining  hujayralarga  kirib 

borishini ta'minlash uchun ular kaltsiy xloridning muzli eritmasi bilan ishlanadi, so'ngra ular 42 ° 

C  da  1,5  minut  davomida  saqlanadi.  Ushbu  davolash  hujayra  devorining  mahalliy  yo'q 

qilinishiga olib keladi. Maksimal aylanish chastotasi 10 ga teng, ya'ni. har mingta hujayra uchun 

---

bittasi  o'zgaradi.  Transformatsiya  chastotasi  100%  emas,  keyin  o'zgartirilgan  hujayralarni 

aniqlash uchun tanlov sxemalari qo'llaniladi. 

Marker  sifatida  plazmid  tarkibida  bakteriyalarning  antibiotiklarga  chidamliligini 

aniqlaydigan  genlar  bo'lishi  mumkin.  Belgilangan  genga  begona  (donor)  genni  kiritish 

ikkinchisining  inaktivatsiyasiga  olib  keladi.  Bu  o'zgargan  hujayralarni  vektor  plazmidini 

(antibiotik  qarshiligini  yo'qotgan)  va  rekombinant  molekulani  (bir  biriga  qarshilikni  saqlab 

qolgan, ammo  boshqa antibiotikka qarshilikni  yo'qotgan) hujayralarni  farqlash  imkonini  beradi. 

Ushbu usul joylashtirilgan markerni inaktivatsiya deb ataladi. 

Rekombinant  DNK  (gibrid  plazmid)  o'z  ichiga  olgan  o'zgartirilgan  hujayralarni  tanlash 

uchun  ma'lum  antibiotiklarga  qarshilik  sinovlari  o'tkaziladi.  Masalan,  gibrid  plazmidni  olib 

yuradigan  hujayralar  ampitsillinga  chidamli,  ammo  tetratsiklinga  sezgir  (donor  DNK  marker 

geniga kiritilgan). 

Genom  DNKni  klonlangan  elementlarga  ajratish  va  bu  elementlarni  qabul  qiluvchi 

hujayralarga  kiritish  jarayoni  genom  kutubxonasini  (klon  banki,  gen  banki)  yaratish  deb 

nomlanadi. 

Barcha klonlashtirish tizimlari ikkita asosiy talabga javob berishi kerak: 1) klonlash uchun 

bir  nechta  saytlarning  mavjudligi;  2)  rekombinant  DNK  bilan  hujayralarni  juda  oddiy  aniqlash 

imkoniyati. 

E.  coli  barcha  muntazam  molekulyar  klonlash  protseduralari  uchun  asosiy  xujayralar 

sifatida keng qo'llaniladi. Chet ellik DNKni yuta oladigan hujayralar vakolatli deyiladi; Maxsus 

kultivatsiya  sharoitlaridan  foydalangan  holda  E.  coli  kompetentsiyasi  oshiriladi.  E.coli 

rekombinant  shtammlaridan  foydalangan  holda  ko'p  miqdordagi  xorijiy  oqsillarni  olish  uchun 

plazmid qurilgan, unda kuchli qo'zg'atuvchi, selektiv marker geni va Rekstriktaza fermenti uchun 

bir nechta noyob joylar - polilinker bo'lgan qisqa bo'lim mavjud. 

E.  coN  plazmidlarini  o'zgartirishning  samarali  usullari  bu  elektroporatsiya  (hujayra 

membranalarini  ularning  o'tkazuvchanligini  oshirish  uchun  elektr  toki  bilan  ta'sir  qilish). 

Klonlangan  genlarni  somatik  hujayralarga  kiritish  uchun  mikroinjektsiya  va  mikro  ponksiyon 

yoki DNK yuklangan membranali vesikulalarning (liposomalar) hujayra bilan qo'shilishi. 

Bakteriofaglarni  genetik  ma'lumot  tashuvchisi  sifatida  ishlatish  rekombinant  genni  virus 

genomiga  kiritib,  keyinchalik  infektsiyalangan  xost  hujayrada  tarqalganda  virus  genlari  bilan 

ko'payishiga  asoslanadi.  Buning  uchun  ikki  barmoqli  DNKli  bakteriofag  ^.  Virusi  ishlatiladi,  u 

hujayraga kirib, halqa ichiga tushadi. Bakteriofag M-13 - bu hujayrali dumaloq DNKli filamentli 

virus bo'lib, hujayrada ikki torli bo'lib, nasl hujayralarida ko'payadi. 

Biologik  faol  oqsillarni  olish  uchun,  eukaryotik  ekspressiya  tizimlarini  qidirishda, 

bakteriyalar  -  E.  coli  va  hasharotlar  hujayralari  uchun  baculoviruslarga  asoslangan  ifoda 

vektorlari  yaratildi.  Bunday  tizimda  rekombinant  bakuloviruslarning  rentabelligi  99%  ga 

ko'tarildi.  Baculovirus  bilan  kasallangan  hasharotlar  hujayralari  heterologik  oqsilni  sintez  qildi. 

Fage  asosidagi  vektorlar  klonlar  (genebanklar)  yaratish  uchun  qulaydir,  ammo  DNK  fragmenti 

bilan  nozik  manipulyatsiyalar  uchun  emas.  Batafsil  o'rganish  va  konversiya  qilish  uchun  DNK 

qismlari plazmidlarga klonlanadi. 

Ushbu  vektorlardan  tashqari,  genetik  muhandislik  fazali  X  DNKning  kos  joyini 

(to'ldiruvchi  yopishqoq  uchlarini)  olib  boruvchi  kosmos  -  plazmidlardan  ham  foydalanadi.Cos 

saytning  mavjudligi  in  vitro  fagning  boshiga  DNKni  o'rashga  imkon  beradi,  bu  esa  infektsiya 

orqali  hujayraga  kirib,  ingl.  transformatsiya  emas.  Fasmidlar  -  faglar  va  plazmidlar  orasidagi 

duragaylar - fag va plazmid shaklida rivojlana oladi. Klonlarni klonlash qobiliyatiga bo'ysungan 

holda, fasmidlar genlarni fajdan plazmid vektorlariga klonlashdan voz kechishga imkon beradi. 

---

Shunday qilib, har qanday protein mahsulotini olish uchun uni kodlaydigan genning to'g'ri 

yozilishini  va  tegishli  mRNK  tarjimasini  ta'minlash  kerak.  Transkripsiya  (RNK  sintezi)  ni 

boshlash uchun kerakli joyda promouter talab qilinadi va uni to'xtatish uchun tugatish kodi talab 

qilinadi. 

Klonlangan  genlar  bilan  kodlangan  turli  xil  oqsillarni  sintez  qilish  uchun  oddiy  S. 

segregisae  xamirturushidan  intensiv  foydalaniladi;  bu  bir  hujayrali  organizmlarning  genetikasi 

yaxshi  tushunilgan.  S.  segregisae  ifoda  tizimlarida  sintez  qilingan  rekombinant  oqsillar 

vaktsinalar va dorilar sifatida ishlatiladi. 

Mavjud  oqsillarga  yangi  xususiyatlar  berish  va  plazmidlar  yoki  PCR  yordamida  aniq 

o'zgarishlar  kiritish  orqali  noyob  fermentlarni  yaratish  mumkin.  Klonlangan  genlar  ushbu 

saytlarda  kerakli  aminokislotalarni  o'z  ichiga  olgan  oqsillarni  olish  imkonini  beradi.  DNKning 

kodlash  ketma-ketligiga  aniq  o'zgarishlarning  kiritilishi,  bu  aminokislotalar  ketma-ketligidagi 

ma'lum o'zgarishlarga olib keladi, yo'naltirilgan mutagenez deyiladi.