9-laboratoriya mashgʻuloti: Poliakrilamidli ge

9-laboratoriya mashgʻuloti:Poliakrilamidli gelda mikroorganizmlar hujayralarini immoblizasiyalash.
Yog 'uglevodorodlarini (OHC) parchalanishida etakchi rol biogeotsenozlarda keng tarqalgan va ulardagi ferment tizimlarining keng doirasi mavjudligi sababli turli tuzilmalarning neft tarkibiy qismlarini biologik parchalashga qodir boʻlgan Pseudomonas va Rhodococcus avlodiga mansub bakteriyalarga tegishli. . Mikroorganizmlar-neft parchalovchilari nafaqat neft mahsulotlari bilan ifloslangan tuproq va suvlarni bioremediatsiya qilishda [1, 2], balki ular asosida atrof-muhitning uglevodorodlar bilan ifloslanishini ekologik monitoring qilish uchun biosensor tizimlarini yaratishda [3, 4] va oʻrganish uchun ishlatiladi. neft komponentlarining biooksidlanish jarayonlarining qonuniyatlari [5, 6].
Biosensorlarni ishlab chiqishda biologik material fizik-kimyoviy transduserda ishonchli tarzda oʻrnatilishi (immobilizatsiyasi) kerak. Mikroorganizmlarning immobilizatsiyalangan hujayralari
* Ish 2009-2013 yillarga moʻljallangan "Innovatsion Rossiyaning ilmiy va ilmiy-pedagogik kadrlari" Federal maqsadli dasturi (P976-sonli davlat shartnomasi) tomonidan moliyaviy qoʻllab-quvvatlandi.
erkin boʻlganlar bilan solishtirganda, ular uzoq muddatli funktsional faollikka ega, bu nafaqat zararli ta'sirlardan himoya qiluvchi tashuvchining ta'siri, balki soʻnggi tadqiqotlarga koʻra, bakteriyalarda gen ekspressiyasini tartibga solishning global tizimi (Quorun Sensing) tomonidan belgilanadi. - QS) [7]. QS regulyatsiyasining ishlashi tizimdagi hujayralar kontsentratsiyasi bilan oldindan belgilanadi. Aniqlanishicha, bu tizim bioplyonkalar hosil boʻlishida muhim rol oʻynaydi, ya'ni oʻz-oʻzini immobilizatsiya qiluvchi hujayralar uchun muhim boʻlib, gramm-musbat va gramm-manfiy bakteriyalarda farqlanadi. Shuni ta'kidlash kerakki, bakteriyalar
— Pseudomonas va Rhodococcus avlodining moy degradatorlari hujayra membranasining tuzilishida sezilarli darajada farqlanadi: gramm-musbat
rhodokokklar turli sirtlarda yaxshiroq yopishadi, gramm-manfiy psevdomanadalar osonlik bilan desorbsiyalanadi.
Immobilizatsiya usuli mikrobial sensorlarning asosiy analitik va metrologik xususiyatlarini aniqlaydi, masalan, uzoq muddatli va operatsion barqarorligi, biosensorning javobini ishlab chiqish vaqti, aniqlash chegarasi, kalibrlash bogʻliqligining chiziqli oraligʻi, shuningdek, biosensor tahlilining selektivligiga ta'sir qiladi. Shunday qilib, gram-musbat va gramm-manfiy bakteriyalarni immobilizatsiya qilish usuli - moyni destruktorlarning ta'sirini oʻrganish muhim fundamental va amaliy vazifadir. Mikroorganizmlarning nafas olish zanjirining ishlashi ularning fiziologik faolligining muhim koʻrsatkichidir. Kislorod elektrodiga asoslangan biosensor tizimlari va uning yuzasida immobilizatsiyalangan mikroorganizmlarning butun hujayralari biomaterialda nafas olish faolligidagi oʻzgarishlarni qayd etish imkonini beruvchi sezgir vositadir.

Ushbu ishda immobilizatsiya uchun tashuvchining turiga qarab immobilizatsiyalangan bakteriyalar - Pseudomonas va Rhodococcus avlodining moy degradatorlari oksidlanish faolligini qiyosiy oʻrganish amalga oshirildi.

bakterial shtammlar. Biz Pseudomonas sp.142NF(pNF142) va Rhodococcus sp.X5, Rossiya Fanlar Akademiyasi Biokimyoviy fizika instituti, Pushchino, Plazmid biologiyasi laboratoriyasining mikroorganizmlar kollektsiyasidan ikkita tabiiy neft parchalovchilaridan foydalandik.
Oziqlantiruvchi muhit va etishtirish sharoitlari. Mikroorganizmlar uglerod va energiya manbai sifatida naftalin bugʻida (Pseudomonas uchun) yoki dizel yoqilgʻisi bugʻida (Rhodococcus uchun) 28 ° C da Petri idishlarida agarlangan (1,7 ogʻirlikdagi %) sintetik minimal Evans muhitida [8] etishtirildi.
Reaktivlar. Ishda ishlatiladigan barcha reagentlar kimyoviy jihatdan toza boʻlgan. yoki h.d.a. (Sigma (AQSh), HimMed (Rossiya), Dia-M (Rossiya)).
Bufer eritmasi 1/30 mM natriy kaliy fosfat buferi, pH = 7,6 (Na2HPO4 va KH2PO4 tuzlari, Dia-M, Rossiya) edi.
Retseptor elementining shakllanishi. Bakterial hujayralar Petri idishlaridan bufer eritmasi bilan yuvilib, 10 daqiqa (2000 rpm) davomida santrifüj qilingan (Fuga/Vortex Combispin FVL-2400). Choʻkma sifatida olingan biomassa bufer bilan yuvildi va supernatant shaffof boʻlgunga qadar (3-4 marta) yana santrifüj qilindi. Bakteriyalar turli tashuvchilarda immobilizatsiya qilingan. Immobilizatsiyadan soʻng hosil boʻlgan bioreseptor elementi polietilen gaz oʻtkazuvchan membranali (membrana qalinligi 50 m) Klark tipidagi kislorod elektrodiga joylashtirildi va neylon toʻr bilan mahkamlandi. Oʻlchovlar 25 ± 3 nA tayanch oqimida amalga oshirildi. Tizimdagi oqimning boshlangʻich qiymati ularning konsentratsiyasi bilan bogʻliq boʻlgan hujayralarning endogen nafasini miqdoriy jihatdan aks ettiradi.
Aktivlashtirilgan nitrotsellyuloza membranasida bakteriyalarni immobilizatsiya qilish. Nitrotsellyuloza membranali filtr yuzasi (gʻovak oʻlchami 2-5 m, Synpor) protsedura boʻyicha benzokinon bilan faollashtirildi.
25 mg yangi hujayra ogʻirligi faollashtirilgan membrana yuzasiga surtildi va 1 ml bufer eritmasida bir kun davomida inkubatsiya qilindi.