Auditoriyadan tashqari mustaqil ish

8-AUDITORIYADAN TASHQARI MUSTAQIL ISH
8-mavzu. IFA, immunoblot, PZR, radioimmun reaksiyalarning yuqumli kasalliklar tashxisida qo‘llanilishi, qo‘yish texnikasi.
Ishning maqsadi: IFA, immunoblot, PZR, radioimmun reaksiyalarning yuqumli kasalliklar tashxisida qo‘llanilishi, qo‘yish texnikasi bo’yicha ma’lumotga ega bo’lishadi.
Hisobot shakli: taqdimot tayyorlash.
Bajarish uchun sarflanadigan vaqt: 6 soat
Topshiriqni bajarish uchun metodik ko‘rsatmalar: Polimeraza zanjir reaksiyasi yoki PZR bu maʼlum DNK boʻlagini in vitro (odam organizmida emas, tajriba probirkasida) koʻp marta nusxalash usuli hisoblanadi. PZR termostabil DNK polimerazaga, Taq polimerazaga, bogʻliq va DNKning shu qismi uchun maxsus DNK praymerlari boʻlishini talab qiladi. PZRda harorat oʻzgarishi bilan reaksiya bir necha marta takrorlanadi, shu orqali DNK nishon qismining koʻplab nusxalarini olish mumkin. PZR ustida koʻplab tajribalar va amaliy dasturlar olib borilgan. Bundan asosan DNKni klonlash, tibbiy diagnostika va sud-tibbiy ekspertizasida foydalaniladi.
PZR nima?
Polimeraza zanjir reaksiyasi (PZR) bu DNK maʼlum qismining koʻplab marotaba (million yoki milliard) nusxasini olish uchun qoʻllanadigan, keng tarqalgan laborator usul hisoblanadi. Bu DNK qismi tajriba oʻtkazuvchini qiziqtirgan har qanday soha boʻlishi mumkin. Misol uchun, bu tadqiqotchi funksiyasini aniqlashni maqsad qilgan gen yoki sud-tibbiy ekspertizasida jinoyatni ochish uchun qoʻllanadigan genetik ashyoviy dalil boʻlishi ham mumkin.
Odatda PZRning maqsadi DNKning kerakli qismini tahlil qilish yoki boshqa maqsadlar uchun yetarli darajada hosil qilishdir. Misol uchun, PZR orqali koʻpaytirilgan DNK keyingi tajribalar, masalan, ketma-ketlikni aniqlash, gel elektroforez yoki klonlash uchun yuborilishi mumkin. PZR biologiya va tibbiyotning koʻplab sohalari, xususan, molekulyar biologiya, tibbiy tashxislash va hatto ekologiyaning ayrim sohalarida ham qoʻllanadi. Taq polimeraza
Organizm hujayrasidagi DNK replikatsiyasi kabi, PZR jarayonida ham yangi DNK zanjirlarini hosil qilish uchun andoza DNK va DNK polimerazalarning boʻlishi talab etiladi. PZRda odatda Taq polimeraza deb nomlangan DNK polimerazasi qoʻllanadi, bu issiqlikka chidamli bakteriyalardan (Thermus aquaticus) ajratib olinadi. T. aquaticus issiq buloqlar va gidrotermal tuynuklarda yashaydi. Uning DNK polimerazasi issiqlikka juda chidamli va (70°C) bu haroratda odam yoki E. coli DNK polimerazasi nofunksional holatda boʻladi) atrofida eng faol holatda boʻladi. Bu haroratga chidamli Taq polimeraza PZR uchun juda mos keladi. Koʻrib turganimizdek, PZRda yuqori harorat andoza DNKni denaturatsiyalash yoki uning zanjirlarini ajratish uchun takroriy ravishda qoʻllanadi.
PZR praymerlar
Boshqa DNK polimerazalar singari Taq polimeraza ham faqatgina qisqa nukleotidlar ketma-ketligi, yaʼni praymerlar mavjud boʻlgandagina DNK sintezini boshlashi mumkin. PZR reaksiyalarida tajriba oʻtkazuvchi praymer yordamida nusxasi olinishi yoki koʻpaytirilishi kerak boʻlgan DNK qismini belgilaydi.
PZR praymerlari qisqa bir zanjirli DNK boʻlaklari boʻlib, odatda (20) ta nukleotiddan iborat. Har bir PZR reaksiyasida ikkita praymer ishlatiladi va ular nishon (nusxalanishi kerak boʻlgan) qismga yon tomonlaridan birikishga moslashtirilgan. Bunda praymerlar ketma-ketligi andoza DNKning qarama-qarshi zanjiriga, yaʼni nusxasi yaratilishi kerak boʻlgan qismning chetki uchi (qirrasi)ga bogʻlanadi. Praymerlar andozaga komplimentar asos juftlashuvi orqali bogʻlanadi.
PZR bosqichlari
PZR reaksiyasining asosiy tarkibiy qismlari Taq polimeraza, praymerlar, andoza DNK va nukleotidlar (DNK qurilish birliklari)dir. Ferment uchun zarur boʻlgan kofaktorlar bilan birga yuqoridagilar bitta probirkaga yigʻiladi, keyin yuqori va past harorat almashinib turuvchi takroriy siklga qoʻyiladi, natijada DNK sintezlanadi.
Asosiy bosqichlar:
Denaturatsiya (96°C): DNK zanjirlarini denaturatsiya qilish yoki ajratish uchun reaksiyaga yuqori harorat beriladi. Natijada keyingi bosqich uchun kerakli bir zanjirli andoza hosil boʻladi. Yumshatish (55-65°C): praymerlar andoza DNKdagi komplimentar qismlariga bogʻlanishi uchun reaksiyada harorat pasaytiriladi.
Uzaytirish (72°C): Taq polimeraza praymerlarni uzaytirib, yangi DNK zanjirlarini sintezlashi uchun reaksiyada harorat koʻtariladi. Bu sikl oddiy PZR reaksiyasida (25-35) marta takrorlanadi, umumiy hisobda DNKning koʻpaytiriladigan qismiga bogʻliq ravishda 2-4 soat vaqt sarflanadi. Agar reaksiya samarali (yaxshi natijali) boʻlsa, nishon qism bir nechtadan milliard marotabagacha koʻpayishi mumkin. Chunki har reaksiyada faqat boshlangʻich DNK andoza sifatida xizmat qilmaydi, balki bitta reaksiyada yangi sintezlangan DNK ham keyingi reaksiyada andozaga aylanadi. Reaksiyada praymerlar va Taq polimeraza molekulalari juda koʻp miqdorda boʻladi, shu tufayli DNK molekulalari soni har reaksiya siklida ikki barobarga ortishi mumkin. Bunday eksponensial oʻsish darajasi quyidagi rasmda tasvirlangan. PZR natijalarini vizual tekshirish uchun gel elektroforezdan foydalaniladi PZR reaksiyasi natijalari odatda gel elektroforez usuli yordamida vizual (koʻz bilan koʻriladigan) tahlil qilinadi. Gel elektroforez – bu DNK fragmentlarini elektr toki yordamida gel matritsasi orqali oʻtkazib, ularni hajmiga koʻra ajratadigan usul. Odatda PZR namunasidagi boʻlaklarning oʻlchamlarini aniqlash uchun standart yoki DNK chizgʻichlari kiritiladi. Bir xil uzunlikka ega boʻlgan DNK fragmentlari gelda “tasma” hosil qiladi va gel DNK bogʻlovchi boʻyoq bilan boʻyalgan boʻlsa, oddiy koʻz bilan koʻrish mumkin. Misol uchun, 400 asos jufti (aj) hosil boʻladigan PZR reaksiyasi gelda quyidagicha koʻrinishda boʻladi: Chap tomon: 100, 200, 300, 400, 500 aj tasmali DNK chizgʻichi. Oʻng tomon: PZR reaksiyasi natijasi, 400 aj tasma. DNK tasmasi DNK nishon qismining bitta yoki bir nechta nusxasini emas, balki juda koʻplab nusxasini oʻz ichiga oladi. DNK mikroskopik oʻlchamda boʻlgani sababli koʻz bilan koʻrish uchun juda koʻp nusxalar bir joyga yigʻilishi kerak. Bu PZR muhimligini koʻrsatuvchi yana bir isbot: DNK ketma-ketligi yetarlicha nusxada ishlab chiqariladi va koʻz bilan koʻrish orqali boshqariladi.
PZR dasturi
PZR orqali DNK ketma-ketligi million yoki milliard marotaba koʻpaytirilishi mumkin, hosil boʻlgan nusxalar boshqa usullar yordamida tekshiriladi. Misol uchun, DNK gel elektroforez usuli yordamida vizual tahlil qilinishi, ketma-ketlikni aniqlash uchun yuborilishi yoki restriktaza fermentlari yordamida parchalanishi va plazmidga klonlanishi mumkin. PZR koʻplab tadqiqot laboratoriyalari va sud-tibbiy ekspertizasi, genetik tadqiqot va tashxislash kabi amaliy ishlarda qoʻllanadi. Misol uchun, PZR genetik buzilishlar bilan bogʻliq genlarni (yoki prenatal testda homila DNKsini) koʻpaytirish uchun ishlatiladi. PZR tekshiruvidan inson organizmidagi bakteriya yoki virus DNKsini aniqlashda ham foydalaniladi: agar patogen mavjud boʻlsa, qon yoki toʻqima namunasidan DNK qismlarini koʻpaytirish imkoni mavjud.
Namuna muammosi: sud tibbiyotida PZR. Faraz qiling, siz sud-tibbiy ekspertiza laboratoriyasida ishlaysiz. Qoʻlingizga uchta gumonlanuvchi shaxs DNK namunasi, shu bilan birga, jinoyat joyidan olingan soch DNK namunasi kelib tushdi. Sizning vazifangiz maʼlum bir genetik markerni tekshirish va uchta gumonlanuvchidan qaysi birining soch DNKsi ushbu markerga mos kelishini aniqlashdan iborat. Marker ikkita allel yoki versiya koʻrinishida boʻladi. Bittasi bir marta takrorlangan qism (rasmda jigarrang bilan belgilangan), keyingisi ikki marta takrorlangan qismdan iborat.
Birinchi marker allel: takrorlanuvchi qismning yon tomonidagi praymerlar 200 aj DNK fragmentini hosil qiladi
Ikkinchi marker allel: takrorlanuvchi qismning yon tomonidagi praymerlar 300 aj DNK fragmentini hosil qiladi Ifa tahlili. Ferment immunoassay nima? Elishay qon testini qo'llash Elishay tahlili (enzimatik immunoassay) - bu bir qator kasalliklarning patogenlariga qondagi o'ziga xos antikorlarni aniqlashga, patologiyaning rivojlanish bosqichini va uning etiologiyasini aniqlashga qaratilgan zamonaviy diagnostika usuli. Davolash jarayoni va uning samaradorligini kuzatish usuli sifatida foydalaniladi. O'rganish jarayonida sifat va miqdoriy ko'rsatkichlar tahlil qilinadi. Elishay usuli juda informatsiondir, natijalarning aniqligi 96% dan ortiq. Diagnostika deyarli har qanday laboratoriya va tibbiy muassasada mavjud.
Asosiy ko'rsatkichlar
Jinsiy yo'l bilan yuqadigan yuqumli kasalliklar mavjudligini tasdiqlash uchun ferment immunoassay buyuriladi: trichomoniasis; xlamidiya; ureaplazmoz;
Elishay virusli kasalliklarni tashxislash uchun ham qo'llaniladi:
gerpes; 4-toifa herpes (Epstein-Barr virusi); virusli gepatit; sitomegalovirus infektsiyasi. Tadqiqot uchun biologik material qondir. Yetkazib berishdan bir necha kun oldin qabul qilish taqiqlanadi dorilar. 14 kun davomida antibiotiklar, anthelmintic va antiviral vositalardan foydalanish to'xtatiladi. Material ertalab bo'sh qoringa olinadi. Jarayondan bir soat oldin gazsiz bir stakan suv ichishga ruxsat beriladi, ovqat iste'mol qilish istisno qilinadi.
Tahlil qilish xususiyatlari Tadqiqot uchun kamida 5 ml hajmda venoz qon olinadi. Ba'zi hollarda biomaterial sifatida ishlatiladi miya omurilik suyuqligi, amniotik suyuqlik yoki tarkibi shishasimon tanasi.
Qon namunasi in'ektsiya ignasi yordamida, qat'iy ravishda och qoringa, oldini olish uchun amalga oshiriladi. noto'g'ri ijobiy natijalar. 12 soat ichida siz chekishni va ichishni to'xtatishingiz kerak spirtli ichimliklar. Dori vositalaridan foydalanganda tahlil natijalari buziladi.
Agar xulosada G, A, M immunoglobulinlarining salbiy qiymatlari ko'rsatilgan bo'lsa, bu patologik jarayonning rivojlanishining boshlang'ich bosqichini yoki uning yo'qligini ko'rsatadi. Bunday natija terapiya fonida to'liq tiklanish bilan qayd etiladi.
Salbiy IgM va IgA va ijobiy IgG yuqumli kasallik yoki emlashdan keyin immunitetni shakllantirish haqida gapiring.
IgMning ijobiy natijasi va salbiy yoki ijobiy IgG, IgA natijasi o'tkir yuqumli patologiyaning mavjudligini ko'rsatadi.
Elishay tahlili juda tez amalga oshiriladi, natijalar material olinganidan bir kun o'tgach tayyor bo'ladi.
Tarkib
Tananing qarshilik ko'rsatish qobiliyatini baholash yuqumli kasalliklar yoki patologiyaning bosqichini aniqlash Agar kishi kasallikni yuqtirgan boʻlsa, infeksiyadan keyin ma’lum vaqt ichida tanada unga qarshi ma’lum moddalar ishlab chiqarishni va qonga chiqishni boshlaydi. IFA usul orqali sizning organizmingizda OIVga qarshi reaksiya bor-yoʻqligini aniqlaydi. Ammo bu testlar “yolgʻon manfiy” va “yolgʻon musbat” natijalarni ham berishi mumkin. Bu infeksiya tanaga tushgan vaqtdan keying IFA testigacha oʻtgan vaqtga bogʻliq. Dastlabki bosqichlarda “yolgʻon manfiy” natijani olishimiz mumkin, chunki hali tanada yetarlicha OIV ga qarshi antitanachalar boʻlmasligi mumkin. “Yolgʻon musbat” natijalar ba’zida tananing juda kuchli reaksiyasini keltirib chiqaradigan kasalliklarda (masalan, tizimli qizil boʻricha, revmatoid artrit va boshqalar) paydo boʻladi.
Ekspress testlar.
Ular ham OIV infektsiyasiga qarshi ishlab chiqilgan moddalarni aniqlash uchun ishlatiladi. Bu usul qon yoki soʻlakni tekshiradi. Ushbu testlarning qulayligi ularning natijalari tez chiqishida: 15 daqiqadan 1 soatgacha.
Immunobloting usuli.
Bu usul juda sezgir hisoblanadi uchun bemorning IFA testi natijalari musbat boʻlsa, u immunoblot usuli bilan testga yuboriladi.
PZR (polimeraza zanjiri reaktsiyasi).
Bu usul bemorning qonida virusning oʻzini (uning DNK yoki RNKsini) aniqlashga qaratilganligi bilan farq qiladi. Qon olinib, virus deb gumon qilgan parchalar ajratib olinadi. Uning DNKsini ajratib olishadi va miqdori turli moddalar yordamida minglab marta koʻpaytiriladi. Keyin OIVda boʻlishi kerak boʻlgan DNK tarkibi bilan bemordan olingan DNK virusining tarkibi solishtiriladi. Agar ular bir hil chiqsa, demak, natija musbat boʻladi. Bu usul ham juda sezgir hisoblanadi.
URL manzillaridagi videorolikni tomosha diqqat bilan tomosha qiling.
Baholash mezoni:
Mavzu to’liq o’zlashtirilgan, sxematik tasvir tasvirlangan bo‘lsa «5»;
Mavzu qisman o’zlashtirilgan, sxematik tasvir tasvirlangan bo‘lsa «4»;
Mavzu to’liq o’zlashtirilgan, sxematik tasvir tasvirlanmagan bo‘lsa «3»;
Mavzu to’liq o’zlashtirilmagan, sxematik tasvir tasvirlanmagan bo‘lsa «2».