Design of temperature-sensitive mutants solely from amino acid sequence Ghadiyaram Chakshusmathi*, Kajari Mondal*, G. Santosh Lakshmi*, Guramrit Singh*, Ankita Roy*, Ravindra Babu Ch


Download 143.62 Kb.

Sana24.05.2018
Hajmi143.62 Kb.

Design of temperature-sensitive mutants solely from

amino acid sequence

Ghadiyaram Chakshusmathi*, Kajari Mondal*, G. Santosh Lakshmi*, Guramrit Singh*, Ankita Roy*, Ravindra Babu Ch.*,

S. Madhusudhanan*, and Raghavan Varadarajan*

†‡

*Molecular Biophysics Unit, Indian Institute of Science, Bangalore 560012, India; and

Chemical Biology Unit, Jawaharlal Center for Advanced Scientific



Research, Jakkur P.O., Bangalore 560004, India

Communicated by Peter S. Kim, Merck Research Laboratories, West Point, PA, March 31, 2004 (received for review September 18, 2003)



Temperature-sensitive (Ts) mutants are a powerful tool with which

to study gene function in vivo. Ts mutants are typically generated

by random mutagenesis followed by laborious screening proce-

dures. By using the Escherichia coli cytotoxin CcdB as a model

system, simple procedures for generating Ts mutants at high

frequency through site-directed mutagenesis were developed.

Putative buried, hydrophobic residues are selected through anal-

ysis of the protein sequence. Residue burial is confirmed by

ensuring that substitution of the residue by Asp leads to protein

inactivation. At such sites, a Ts phenotype can typically be gener-

ated either by (i) substitution of two predicted, buried residues

with the 18 remaining amino acids or (ii) introduction of Lys, Ser,

Ala, and Trp at three to four predicted buried sites. By using these

design strategies, 17 tight Ts mutants of CcdB were isolated at four

predicted buried sites. The rules were further verified by making

several Ts mutants of yeast Gal4 at residues 68, 69, and 70. No Ts

mutants of either protein have been previously reported. Such Ts

mutants of Gal4 can be used for conditional expression of a variety

of genes by using the well characterized upstream-activating-

sequence–Gal4 system.

T

emperature-sensitive (Ts) mutants of a gene are ones in

which there is a marked drop in the level or activity of the

gene product when the gene is expressed above a certain

temperature (restrictive temperature). Below this temperature

(at so-called permissive temperatures), the activity or phenotype

of the mutant is very similar to that of the WT. Ts mutants

provide an extremely powerful tool for studying protein function

and assembly in vivo and in cell culture (1–4). These mutants

provide a reversible mechanism to lower the level of a specific

gene product at any stage in the growth of the organism simply

by changing the temperature of growth. Although there are

other excellent inducible systems for gene expression (5, 6), Ts

mutants have several unique advantages over such systems,

including fast temporal response, high reversibility, and the

applicability to any tissue type or developmental stage of an

organism. Ts mutants are currently generated by random mu-

tagenesis, typically with a chemical mutagen, often followed by

laborious screening of large numbers of progeny (7). In an

alternate approach in yeast, the elegant work of Varshavsky and

colleagues (8) has shown that Ts mutants can also be generated

by fusion to a heat-sensitive degron (9). It was previously shown

(1) that it was possible to accurately predict a subset of buried

hydrophobic residues in a protein structure from analysis of the

protein sequence. Values of two sequence based parameters, the

average hydrophobicity, and the hydrophobic moment were used

for the prediction. The average hydrophobicity is calculated over

a seven-residue window centered around the residue of interest.

The hydrophobic moment is a vectorial sum of hydrophobicities

calculated over a nine-residue window, with a phase angle

optimized for detection of amphiphilic helical structures, which

typically would not have a high average hydrophobicity. Strin-

gent cutoffs for these two parameters ensured that it was possible

to predict buried hydrophobic residues with an accuracy

Ͼ80%

(1). To obtain Ts mutants, it was suggested that a set of five



stereochemically diverse substitutions at three to four predicted

buried positions be made. The logic was that at least one of this

small set of mutants would destabilize the protein to exactly the

appropriate extent to generate a Ts phenotype. The method was

found to predict several known Ts mutants in systems in which

large numbers of such mutants had been made. It should be

noted that the method does not attempt to predict either all

buried residues or all possible Ts mutants. Ts mutants can be

produced at noncore residues and at surface positions that may

be important for folding, proteolytic sensitivity, or interaction

with other proteins. Rather, our method is designed to yield Ts

mutants at sufficiently high frequencies to be experimentally

useful in systems in which it is not feasible to screen large

numbers of progeny generated by random mutagenesis. In this

work, experimental tests of the algorithm were carried out on the

CcdB toxin of Escherichia coli to further refine and improve the

method. The only modification made from the published algo-

rithm was that Cys residues are not currently considered candi-

date sites for mutation because they might be involved in

disulfide bonds or metal ion coordination, and, if so, mutation

would inactivate the protein.

CcdB is a 101 residue, homodimeric protein of F

Ј plasmid. The

protein is a poison of DNA gyrase and is a potent cytotoxin (10,

11). We chose the protein as a model system to carry out studies

on the generation of Ts mutants for four reasons: (i) cytotoxicity

facilitates screening for Ts mutants; (ii) it is a small, globular

protein amenable to detailed biochemical and biophysical char-

acterization; (iii) at the time this work was initiated, the tertiary

structure of the protein was not known; and (iv) to date, no Ts

mutants of this protein have been isolated. Transformation of

normal E. coli strains (such as Top10) with plasmids containing

the CcdB gene results in cell death. However, if the protein is

inactivated through mutation, cells transformed with such mu-

tant genes will survive. Cells transformed with a Ts mutant of

CcdB survive at high (restrictive) temperatures but not at lower

(permissive) temperatures. We report the successful isolation of

a large number of Ts mutants of CcdB. Based on these results,

we suggest simple rules for the design of Ts mutants of globular

proteins. These rules were further validated by making Ts

mutants of the yeast transcriptional activator Gal4. Gal4 binds to

a sequence called UAS (upstream activating sequence consisting

of tandem 17-bp, imperfect repeats) and activates transcription

of genes downstream of this sequence (12–14). Gal4 is absent in

higher eukaryotes. However, if expressed, in many instances

Gal4 is functional and able to activate transgene expression of

genes downstream of UAS. If Gal4 is expressed under control of

a tissue or developmental stage-specific promoter, then the gene

placed downstream of UAS will be expressed in a Gal4-

dependent pattern. The UAS–Gal4 system is widely used in cell

Abbreviations: Ts, temperature-sensitive; miniGal4, functional minimized Gal4; UAS, up-

stream activating sequence; SC-U, synthetic complete media without uracil; SC-UAH, SC-U

without histidine and adenine.

To whom correspondence should be addressed. E-mail: varadar@mbu.iisc.ernet.in.



© 2004 by The National Academy of Sciences of the USA

www.pnas.org

͞cgi͞doi͞10.1073͞pnas.0402222101

PNAS


͉ May 25, 2004 ͉ vol. 101 ͉ no. 21 ͉ 7925–7930

BIOCHEMISTRY



culture and in a variety of live organisms, including yeast,

fruitflies, zebrafish, mice, and frogs (10, 15–20). No Ts mutants

of Gal4 have currently been reported. However, such mutants

would be very useful, because they would permit reversible,

conditional expression of the very large number of UAS con-

structs that have already been made.

Methods

Plasmids, Host Strains, and Mutagenesis.



Bacterial strains and

media: The E. coli strain used for cloning experiments was

DH5

␣[supE44⌬lacU169(␾80lacZ ⌬M15)hsdR17recA1endA1-



gyrA96thi-1relA1].

LB media was from High Media (Mumbai, India) and has been

supplemented with 100

␮g͞ml ampicillin (Sigma). The commer-

cially available plasmid pZErO2 from Invitrogen was used as the

template for all of the initial mutagenesis studies. In pZErO2,

CcdB is expressed as a lacZ fusion under control of the lac

promoter. The fusion does not affect the activity of the protein

(21), and it serves as a convenient tool for checking that the

mutation does not significantly perturb transcription of the gene.

To study the effect of expression level on the Ts phenotype, the

CcdB gene was cloned under control of the arabinose P

BAD

promoter in the vector pBAD24 (22) to yield the construct



pBAD24CcdB. Three E. coli host strains were used: TOP10,

XL1Blue, and CSH501. TOP10 is sensitive to the action of CcdB.

XL1Blue is able to support low levels of CcdB protein because

of the presence of the antidote CcdA, which is coded for by the

resident F

Ј plasmid. CSH501 is completely resistant to the action

of CcdB because the strain harbors the GyrA462 mutation in its

chromosomal DNA. DNA gyrase is the target for CcdB and this

mutation causes the gyrase to become insensitive to CcdB.

CSH501 was kindly provided by M. Couturier (Universite Libre

de Bruxelles, Belgium). Site-directed mutagenesis was carried

out by using Stratagene’s QuikChange site-directed mutagenesis

protocol. After mutagenesis, putative mutants were transformed

into XL1Blue. Mutant plasmids were isolated, and in all of the

cases, the mutation was confirmed by sequencing of the entire

gene.


Yeast strains, transformations, and media: The yeast strain used

was PJ69-4A Mat

␣trp1–901 leu2–3,112 ura3–52his3–200,gal4⌬,

gal80


⌬ LYS2::GAL1-HIS3GAL2-ADE2 met2::GAL7-lacZ (23).

Media was prepared as described (24). All yeast transformations

were done by using the high efficiency lithium acetate method as

described (25). Gap repair cloning was done by following the

protocol as described (26).

Screening for Ts Phenotype of Mutant CcdB.

Mutants of pZero2

were isolated and transformed into TOP10 and plated on

LB

͞kan plates. Even in the absence of induction, sufficient



amounts of WT protein are produced to cause cell death. Plates

were incubated at 42°C and 37°C. To examine the dependence

of the Ts phenotype on expression level, the arabinose inducible

plasmid pBAD24CcdB and its mutant derivatives were used.

Plasmids were transformed into Top10 in the presence of 0.2%

glucose and examined for survival at 37°C in ampicillin plates

containing LB alone or LB plus 0.2% arabinose. For mutants in

which an inactive phenotype was observed in the absence of

arabinose but an active phenotype was observed in the presence

of 0.2% arabinose, a screen for a Ts phenotype was carried out.

Competent cells were transformed in the presence of 0.2%

glucose and plated in the presence of intermediate concentra-

tions of arabinose ranging from 0.0% to 0.2% at both 42°C and

37°C.


Construction of Functional Minimized Gal4 (MiniGal4).

A construct

that carried miniGal4 and was compatible with the selectable

markers and Gal4-specific reporters of PJ69-4 host strain was

made by cloning the activation domain of Gal4 into pGBDU-C1

(23) as a 3

Ј fusion to the Gal4 DNA-binding domain. HindIII at

position 410 of pGBDU-C1 is a convenient restriction site to

clone back the DNA-binding domain of Gal4 after mutagene-

sis. Hence, the additional HindIII site at position 1158 of

pGBDU-C1 was removed by site-directed mutagenesis by using

the Stratagene QuikChange site-directed mutagenesis protocol,

which yielded pXGBDU-C1. The activation domain (amino

acids 840–881) of Gal4 was amplified from pRJR295 (27) and

cloned into the BamHI

͞SalI sites of pXGBDU-C1 to yield

pGBA.

Construction of Full-Length Gal4.



Full-length Gal4 was subcloned

into the NotI site of pZEro2. The subclone was further digested

with XhoI and MluI and ligated to XhoI

͞MluI-digested pGBA to

obtain a derivative of pGBA with full-length Gal4 designated as

pGBA1.


Site-Directed Mutagenesis of Gal4.

Predicted buried residues in the

N-terminal 150 aa of Gal4 were selected for mutagenesis.

Primers were designed to replace each of the predicted, buried

residues individually by all 20 amino acids by replacement of the

WT codon by NNK (where N

ϭ A͞C͞G͞T and K ϭ G͞T).

Mutagenesis was carried out by using overlap PCR. In addition

to the mutant primers, two outside primers that bound to regions

upstream of the binding domain and downstream of the activa-

tion domain, respectively, were used to ensure that the overlap

PCR product had at least 150-bp homology at each end with

restriction enzyme-digested pGBA vector. Overlap PCR prod-

ucts were transformed along with HindIII

͞EcoRI-digested

pGBA (in the case of miniGal4) or along with HindIII

͞MluI-

digested pGBA (in the case of full-length Gal4) into the yeast



strain PJ69-4A for cloning by gap repair. Transformants (Ura

ϩ

)



were obtained in synthetic complete media without uracil

(SC-U) plates. These were subsequently screened for induction

of His-3, Ade2, and LacZ reporters.

Random Mutagenesis of MiniGal4.

Random mutagenesis of the

entire miniGal4 gene was carried out by using error prone PCR

in limiting dATP

͞dGTP conditions, where 0.2 mM of three of

the dNTPs and 0.04 mM dATP

͞dGTP (limiting) was used (28).

MiniGal4 was amplified in these conditions, and the mutant

HindIII

͞EcoRI-digested PCR product was cloned into HindIII͞



EcoRI-digested pGBA plasmid. Ligated product was trans-

formed, the resulting colonies were pooled, and the plasmid

DNA was extracted and subsequently transformed to PJ69-4A.

In a second approach, the mutant PCR product was transformed

along with the HindIII

͞EcoRI-digested pGBA into PJ69-4A for

cloning by gap repair. In all cases, transformants were screened

for a Ts phenotype as described below.

Screening for Temperature Sensitivity of Mutant Gal4.

Colonies in

the master plate (Ura

ϩ

) were replica plated onto three different



plates made of SC-U without histidine and adenine (SC-UAH),

and incubated at 21°C, 30°C, and 37°C, respectively. Putative Ts

mutant colonies were then picked up from the master plate and

streaked onto SC-UAH plates, and the Ts phenotype was further

confirmed by repeating the above procedure. Strong Ts mutants

were ones that grew normally at 21°C, very slowly at 30°C, and

did not grow at 37°C. Mild Ts mutants grew at 21°C and 30°C but

not at 37°C. Subsequently, colony plasmid rescue was done from

yeast as described (29). Plasmids were sequenced to identify the

mutation. A LacZ filter lift assay (www.sacs.ucsf.edu

͞home͞

herskowitzlab



͞protocols͞bgal1.html) was also used to examine

expression of the LacZ reporter in cells grown on replica plates

at 21°C, 30°C, and 37°C, respectively.

7926

͉ www.pnas.org͞cgi͞doi͞10.1073͞pnas.0402222101

Chakshusmathi et al.


Results and Discussion

Asp Substitutions Can Be Used to Locate Buried Residues.

The CcdB

sequence was analyzed by using the procedure described in ref

1. Based on values of the average hydrophobicity and hydro-

phobic moment, 10 residues were predicted to be

Ͼ80% buried.

Introduction of charged amino acids into the protein interior is

known to be highly destabilizing and may lead to protein

inactivation. Hence, this method may be useful for experimen-

tally confirming whether a predicted buried residue is actually

buried. Hence, each of the 10 predicted buried residues was

substituted by Asp. At eight of 10 positions, Asp substitution

leads to protein inactivation (Table 1). While this work was in

progress, the crystal structure of CcdB was solved (30). In

agreement with the mutational data, eight of 10 predicted buried

residues are

Ͼ90% buried, whereas Val-53 and Leu-96 are 80%

and 75% buried, respectively. Asp substitutions at all of the eight

highly buried positions inactivated the protein, whereas Asp

substitutions at the two partially buried positions were tolerated.

This level of prediction accuracy is comparable to that observed

previously with many other proteins (1).

Mutations at Buried Sites Result in a Ts Phenotype.

At each of the

highly buried sites in Table 1, there is at least one active (WT)

and one inactive (Asp) sequence. It was therefore of interest to

examine whether at least one of the remaining 18 substitutions

at a buried site would be Ts. Hence, four of the eight highly

buried positions were randomly selected for further mutagenesis.

These buried positions are Phe-17, Val-33, Ile-34, and Met-97

(Fig. 3, which is published as supporting information on the

PNAS web site, and Table 2). At least one Ts mutant was

obtained at each of these four positions. F17K, F17R, V33W,

I34S, M97A, and M97V are Ts (Fig. 4, which is published as

supporting information on the PNAS web site). At each position,

substitution of negatively charged residues Asp and Glu invari-

ably resulted in an inactive phenotype. The fraction of inactive

mutants at each position varied from 21% at position 17 to 53%

at position 34. Surprisingly, the large positively charged residues

Lys and Arg were much better tolerated than Asp and Glu. Pro

was the only other amino acid that was not tolerated at any of the

four positions, because introduction of Pro leads to a loss of a

main-chain hydrogen bond. In addition, the

␾ dihedral angle of

Pro is restricted to a small region around

Ϫ60°, which was

incompatible with the existing

␾ values at three of the four

positions. Although charged residues were clearly destabilizing,

there was no simple correlation of phenotype with substitution

for the remaining residues. In most cases, substitution of a

buried, hydrophobic residue with a smaller hydrophobic residue

was well tolerated.

Effect of Expression Level on Ts Phenotype.

To examine the effect

of protein expression level on the Ts phenotype (31), all 76

single-site mutants at positions 17, 33, 34, and 97 were intro-

duced into the pBAD24-CcdB construct. In this vector, CcdB is

expressed under control of the arabinose P

BAD

promoter. Arab-



inose and glucose act as inducer and repressor, respectively, in

this system. This vector allows for tightly regulated, dose-

dependent, protein expression by varying the amount of inducer

(arabinose) added (22), as shown in Fig. 5, which is published as

supporting information on the PNAS web site. Thirty-five of a

total of 76 single-site mutants (46%) were inactive when grown

on LB plates. Of these 35, 19 (54%) showed an active phenotype

in the presence of LB plus 0.2% arabinose (Table 3). Of these

19, 17 (89%) showed a Ts phenotype when grown in the presence

of intermediate concentrations of arabinose. Table 3 lists these

mutants and the arabinose concentration where a Ts phenotype

is observed. Fig. 1 and show data for two such mutants,

M97F and L50D. The data suggest that any mutant of CcdB that

shows an active phenotype when expressed at a certain level will

show a Ts phenotype when expressed at a lower level. Hence,

Table 1. Substitution of predicted buried residues in CcdB with

aspartic acid typically leads to protein inactivation

Mutant


Burial (crystal

structure), %

Phenotype

(LB)


Phenotype (LB plus 0.2%

arabinose)

F17D

100


Ϫ

Ϫ

V18D



100

Ϫ

Ϫ



V33D

99

Ϫ



Ϫ

I34D


100

Ϫ

Ϫ



L50D

92

Ϫ



ϩ

V53D


80

ϩ

ϩ



V54D

100


Ϫ

Ϫ

L96D



75

ϩ

ϩ



M97D

100


Ϫ

Ϫ

F98D



100

Ϫ

Ϫ



Ϫ, protein is inactive. ϩ, protein is active.

Table 2. Phenotypes of mutants at four positions in CcdB

Mutation


Phe 17

Val 33


Ile34

Met 97


Gly

ϩ

ϩ



Ϫ

Ϫ

Ala



ϩ

ϩ

ϩ



Ts

Cys


ϩ

ϩ

ϩ



ϩ

Val


ϩ

WT

ϩ



Ts

Met


ϩ

ϩ

ϩ



WT

Leu


ϩ

ϩ

ϩ



ϩ

Ile


ϩ

ϩ

WT



ϩ

Phe


WT

ϩ

Ϫ



Ϫ

Tyr


ϩ

ϩ

Ϫ



ϩ

Trp


Ϫ

Ts

ϩ



Ϫ

Pro


Ϫ

Ϫ

Ϫ



Ϫ

His


ϩ

ϩ

Ϫ



ϩ

Ser


ϩ

ϩ

Ts



Ϫ

Thr


ϩ

ϩ

ϩ



Ϫ

Asn


ϩ

Ϫ

Ϫ



ϩ

Gln


ϩ

ϩ

Ϫ



ϩ

Asp


Ϫ

Ϫ

Ϫ



Ϫ

Glu


Ϫ

Ϫ

Ϫ



Ϫ

Arg


Ts

ϩ

ϩ



ϩ

Lys


Ts

Ϫ

Ϫ



Ϫ

All CcdB mutants were expressed without induction as LacZ fusions in

plasmid pZero2.

ϩ, active phenotype. Ϫ, inactive phenotype.



Table 3. Inactive mutants often show active or Ts phenotypes

when overexpressed

Inducer concentration,

% arabinose

Ts mutants

Fraction of

Ts sites


0.02

F17R, V33K, I34S

3

͞4

0.04



V33N, M97K

2

͞4



0.06

V33R, M97F, M97W

2

͞4

0.08



F17E, V33W, I34F, M97G

4

͞4



0.1–0.2

I34G, I34Y, I34H, I34K, M97P

2

͞4

The above mutants show inactive phenotypes in LB, active phenotypes



when induced with 0.2% arabinose, and Ts phenotypes at the intermediate

concentrations of arabinose indicated in the table. Dose-dependent CcdB

expression (Fig. 5) is seen in the inducer range 0.02– 0.08%. The following

mutants were not active even when induced with 0.2% arabinose: F17W,

F17P, F17D, V33P, V33D, V33E, I34P, I34N, I34Q, I34D, I34E, I34R, I34W, M97S,

M97D, and M97E. In only two cases (F17K and M97T), mutants were inactive

in LB and active in LB plus 0.2% arabinose but did not show a Ts phenotype at

intermediate concentrations of arabinose.

Chakshusmathi et al.

PNAS


͉ May 25, 2004 ͉ vol. 101 ͉ no. 21 ͉ 7927

BIOCHEMISTRY



even the WT protein should show a Ts phenotype when ex-

pressed at an appropriate level. To confirm this prediction, WT

CcdB under control of the P

BAD


promoter was transformed into

strain XL1Blue (see Methods). As shown in Fig. 1C, in the

presence of concentrations of arabinose

Ͻ0.06%, cells survive at

both 37°C and 42°C, because the small amounts of CcdB present

are titrated by its inhibitor CcdA, which is present in the

XL1Blue host strain. At higher inducer concentrations when

excess CcdB is produced, cells die at both temperatures, but at

0.06% arabinose, a Ts phenotype is seen even with the WT

protein. The possible explanation for this finding is as follows.

Phenotype is a function of expression level. Below some thresh-

old level, the amount of CcdB will be too small to show a

phenotypic effect. In addition, the steady-state level of the

protein is likely to be lowered at 42°C relative to 37°C because

of enhanced proteolysis associated with the heat shock response.

Hence, at expression levels that are just above the threshold at

37°C, increasing the temperature to 42°C will result in an inactive

phenotype. It will be interesting to see whether the results seen

for CcdB also hold for other proteins.

Strategies for Design of Ts Mutants.

The data in Table 1 and Table

2 show that introduction of Asp, Glu, and Pro at predicted buried

positions consistently results in inactivation of the protein,

whereas Lys causes inactivation at three of four sites. Suprisingly,

Arg is tolerated much better than Lys. Asp is poorly tolerated at

buried positions, because it is small, rigid, and charged. Burial of

a charged group in the nonpolar protein is expected to be highly

destabilizing. In contrast, Lys and Arg both have long, flexible

side chains that can potentially reach the exterior of the protein.

Replacement by aliphatic, hydrophobic amino acids typically

have little effect, whereas replacement by bulky aromatic amino

acids (especially Trp) and polar amino acids sometimes inacti-

vates the protein. At sites where there is at least one inactive

mutant, in

Ϸ50% of the cases (Table 2 and Table 3) at least one

of the remaining 18 substitutions often results in a Ts phenotype.

Furthermore, if overexpression of an inactive mutant results in

an active phenotype, almost invariably an intermediate level of

expression results in a Ts phenotype. The screening procedure

used in the present work is extremely stringent. A narrow

temperature range is used for selection, and a digital readout of

conditions, such as cell survival (rather than enzyme activity), is

used. Hence, we anticipate that the results will be generally

applicable to the design of Ts mutants in other systems where

lower levels of stringency are required.

The data in Table 1 and ref. 1 demonstrate that accurate

prediction of buried residues from sequence is possible and that

mutations at such positions often result in a Ts phenotype (32).

This finding suggests the following alternative strategies for the

design of Ts mutants of globular proteins: (i) Introduce Asp at

two predicted buried sites. If the resulting mutants are inactive,

then examine the remaining 18 mutants at each position for Ts

behavior. (ii) Introduce positively charged, polar, small and large

hydrophobic residues (Lys, Ser, Ala, and Trp) at four predicted

buried sites. The data in Table 2 and Table 3 show that this subset

of substitutions is energetically diverse enough to generate Ts

mutants with high frequency over a range of protein expression

levels. (iii) Express WT protein or a destabilized mutant in an

appropriate inducible system. If an active phenotype is seen at

high inducer concentrations for any protein that was inactive at

low inducer concentrations, it will be possible to obtain a Ts

phenotype at an intermediate inducer concentration. One caveat

is that this methodology is applicable primarily to single-domain

proteins or known functional domains in a multidomain protein.

This work shows that by combining an inducible system with

destabilizing mutations, it is straightforward to generate a Ts

phenotype and emphasize the intimate relation between protein

levels and the Ts phenotype. In organisms with long generation

times and for which simple, plate-based assays do not exist, this

simple site-directed mutagenesis-based strategy will be a useful

approach for isolation of Ts mutants. Even in the case that simple

plate-based assays do exist, making a limited collection of

mutants at a few selected sites is much more efficient than

screening large numbers of colonies generated by random

mutagenesis. To further test the above design rules, we at-

tempted to make Ts mutants in a biologically relevant system for

which no previous Ts mutants existed. We choose the yeast

transcriptional activator Gal4 for reasons described in the in-

troductory section.

Construction of MiniGal4.

Gal4 is an 881-aa protein that functions

as a transcriptional activator in Saccharomyces cerevisiae. Func-

tions assigned to various regions of Gal4 include DNA binding

(residues 1–65), dimerization (residues 50–94), and activation

(residues 94–106, 148–196, and 768–881) (33). It has previously

Fig. 1.

Active mutants show a Ts phenotype when expressed at an appro-

priate level. Phenotypes of M97F (A), L50D (B), and WT CcdB (C) as a function

of inducer concentration are shown. A Ts phenotype is seen in the presence of

0.06% arabinose in each case. M97F and L50D are expressed in the E. coli strain

Top10 and WT in XL1Blue.



7928

͉ www.pnas.org͞cgi͞doi͞10.1073͞pnas.0402222101

Chakshusmathi et al.


been shown that constructs consisting of residues from DNA

binding and dimerization domains linked to the residues 840–

881 from the C-terminal activating domain are sufficient to

activate transcription of reporter genes in yeast. To simplify the

construction of Ts Gal4, we have designed a functional truncated

Gal4 (miniGal4). To make miniGal4, the activation region

(residues 840–881) was PCR-amplified from pRJR295 (27) and

fused to a construct expressing residues 1–147 (that included the

DNA-binding domain) (23) at the C terminus by using a

7-residue linker. This construct is expressed under control of the

alcohol dehydrogenase 1 promoter in the plasmid pGBA.

PJ69-4A is deleted for Gal4 and contains chromosomal copies

of reporter genes for histidine biosynthesis, adenine biosynthesis,

and


␤-galactosidase placed downstream of the Gal1, Gal2, and

Gal7 promoters, respectively. Transcription from all these pro-

moters can be activated by Gal4. Expression of the histidine and

adenine reporters can be examined by growing transformants in

the absence of histidine and adenine, respectively. Expression of

LacZ is examined by lysing cells in the presence of the chromo-

genic substrate X-Gal as described (www.sacs.ucsf.edu

͞home͞


herskowitzlab

͞protocols͞bgal1.html)

Site-Directed Mutagenesis of MiniGal4 and Full-Length Gal4.

Putative


buried, hydrophobic residues with potential to give rise to Ts

mutants when mutated were selected through analysis of

protein sequence by using the procedure described in ref. 1.

Residues 68, 69, 70, 71, and 80 are the only residues in the

region 1–150 that are predicted to be buried at the 90%

confidence level. Of these five sites, residues 68, 69, and 70

were arbitrarily chosen for further analysis. These three sites

were mutated to Ala, Ser, Trp, and Lys. In a separate set of

experiments each predicted, buried residue was also individ-

ually randomized in both miniGal4 and in full-length Gal4. All

mutagenesis were carried out by overlap PCR. The overlapped

PCR fragment having mutation in the above residues and some

sequence homologous at both ends with that of the digested

vector (pGBA) was then transformed along with the digested

vector into yeast (PJ69-4A). Recombination between the

homologous sequences on the vector and the insert inside the

yeast cell then results in a clone of the desired mutant (26).

Screening for Ts Mutants of MiniGal4 and Full-Length Gal4.

Trans-

formants obtained after gap repair were replica plated on



selection media (SC-UAH) and incubated at 21°C, 30°C, and

37°C. The clones that showed normal growth at 21°C and 30°C

but not at 37°C were designated as mild Ts mutants. Clones

growing normally at 21°C only, greatly reduced growth with

reddish colonies at 30°C, and no growth at 37°C were designated

as strong Ts mutants (Fig. 2 and Fig. 6, which is published as

supporting information on the PNAS web site, and Table 4).

Plasmid rescue of putative Ts mutants was done. Rescued

plasmids were sequenced to identify the exact mutation. Mu-

tated plasmids were again transformed to PJ69-4A to reconfirm

their Ts phenotype. The Ts nature of the clones was further

confirmed by using the plate-based LacZ filter lift assay, for

which similar results were obtained (data not shown). A total of

eight Ts mutants were obtained at these three sites in case of

miniGal4. Of those mutants, four were also isolated as Ts

mutants in the screen with full-length Gal4. The maximum

number of Ts mutants was obtained at position 68. While this

work was in progress, the NMR structure of the isolated Gal4

dimerization domain (residues 50–106) was reported (34). NMR

spectra as a function of pH and temperature revealed the

presence of several temperature-dependent, noncooperative

changes, indicating a flexible and dynamic structure. Spectra

were best at pH 7.5 and 35°C, and the final reported structure

was determined under these specific conditions. In this NMR



Fig. 2.

Verification of the Ts phenotype of Gal4 mutants at 21°C, 30°C, and 37°C on SC-UAH plates. Plates are sectioned into six cultures. (A) From section 1 to

section 6 (clockwise) are WT, inactive (L62P, E76G double mutant), F68K, F68R, F68E, and F68P grown at 21°C, 30°C, and 37°C. F68K and F68R are mild Ts mutants,

and F68E and F68P are strong Ts mutants. (B) From section 1 to section 6 (clockwise) are WT, inactive (L62P, E76G double mutant), F68Q, F68D, L69P, and L70P

grown at 21°C, 30°C, and 37°C. F68Q, L69P, and L70P are mild Ts mutants, and F68D is a strong Ts mutant.

Table 4. Phenotype of site-directed mutants of Gal4 in plasmid

pGBA, host strain PJ69-4A

Position


Mutation

Ala


Ser

Lys


Trp

Random


Phe68

ϩ

ϩ



Ts

ϩ

Ts*



Leu69


ϩ

ϩ

ϩ



ϩ

Ts*


Leu70

ϩ

ϩ



ϩ

ϩ

Ts*



ϩ, active.

*Substitutions F68P, F68R, F68Q, F68E, F68D, F68K, L69P, and L70P in miniGal4

were Ts.


Substitutions F68R, F68D, F68K, and L70P in full-length Gal4 were Ts.

Chakshusmathi et al.

PNAS


͉ May 25, 2004 ͉ vol. 101 ͉ no. 21 ͉ 7929

BIOCHEMISTRY



structure, all three predicted, buried residues are solvent acces-

sible. Accessibilities are 48%, 112%, and 61% for residues 68, 69,

and 70, respectively. However, residue 68 points away from the

exterior surface of the protein. (Fig. 7, which is published as

supporting information on the PNAS web site). The finding that

these predicted buried residues are exposed is quite surprising,

especially in view of the fact that it is very rare to find exposed

tripeptides of hydrophobic residues in protein structures (1). The

fact that Ts mutants could be obtained at all three predicted

buried positions suggests that these residues are buried in the

intact protein (the NMR structure is only of the isolated

dimerization domain). Alternatively, these residues could be

part of a hydrophobic protein: protein interaction surface. By

using the fusion of amino acids 50–97 of Gal4 with the DNA-

binding domain of lexA, it was previously shown (34) that amino

acids 50–97 of Gal4 contain a region capable of transcriptional

activation and Gal11P binding. Residues 69 and 70 were impli-

cated in both these activities, and replacement with Ala at these

positions leads to loss of both transcriptional activation and

Gal11P binding. Gal11P is a mutant version of Gal11, a com-

ponent of the RNA-polymerase II holoenzyme. Both binding

and activation are only seen in cells bearing the Gal11P mutation

and not in cells with normal Gal11 protein. Ala scanning

mutagenesis over the entire 50–97 regions revealed that pre-

dominantly hydrophobic residues (L69, L70, I71, F72, L86, L89,

L92, L93, L96, and F97) were important for both transcriptional

activation and Gal11P binding (34). It is very unlikely that so

many hydrophobic residues could be part of a binding site, and

we suggest instead that these residues are buried in intact Gal4.

Random Mutagenesis of MiniGal4.

The entire region of miniGal4

was subjected to random mutagenesis as described in Methods.

Over 20,000 transformants were obtained on SC-U plates. These

were replica plated onto SC-UAH plates at 21°C, 30°C, and 37°C

as described above. Although several active and inactive trans-

formants were obtained, not a single Ts mutant could be

isolated. A few mutants were obtained that grew normally at

21°C and 30°C but showed light pink colonies at 37°C, indicating

slightly diminished activity at this temperature. This finding

demonstrates that even in situations for which simple, plate-

based assays exist, it can be easier to obtain Ts mutants

through our site-directed procedure than by conventional

random mutagenesis.

The CSH501 strain was kindly provided by Dr. M. Couturier, and the

plasmid pRJR295 was provided by Dr. A. Ansari (University of Wis-

consin, Madison). We thank Dr. A. Ansari for helpful suggestions. We

acknowledge use of the DNA sequencing facility at Indian Institute of

Science, which is supported by the Department of Biotechnology,

Government of India. This work was sponsored by grants from the

Departments of Biotechnology and Science and Technology, Ministry of

Science and Technology, Government of India, and the Wellcome Trust

(to R.V.). G.C. is a Council of Scientific and Industrial Research Fellow.

R.V. is a recipient of the Swarnajayanthi Fellowship (Government of

India) and a Senior Research Fellowship from the Wellcome Trust.

1. Varadarajan, R., Nagarajaram, H. A. & Ramakrishnan, C. (1996) Proc. Natl.

Acad. Sci. USA 93, 13908–13913.

2. Fried, M. (1965) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53, 486–491.

3. Goldenberg, D. P., Smith, D. H. & King, J. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA

80,

7060–7064.

4. Schuler, B. & Seckler, R. (1998) J. Mol. Biol. 281, 227–234.

5. Gossen, M. & Bujard, H. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5547–5551.

6. Gossen, M., Freundlieb, S., Bender, G., Muller, G., Hillen, W. & Bujard, H.

(1995) Science 268, 1766–1769.

7. Suzuki, D. T., Grigliatti, T. & Williamson, R. (1971) Proc. Natl. Acad. Sci. USA

68,

68–93.


8. Dohmen, R. J., Wu, P., Varshavsky, A., Kanemaki, M., Sanchez-Diaz, A.,

Gambus, A. & Labib, K. (1994) Science 263, 1273–1276.

9. Kanemaki, M., Sanchez-Diaz, A., Gambus, A. & Labib, K. (2003) Nature 423,

720–724.


10. Bernard, P., Kezdy, K. E., Van Melderen, L., Steyaert, J., Wyns, L., Pato, M. L.,

Higgins, P. N. & Couturier, M. (1993) J. Mol. Biol. 234, 534–541.

11. Steyaert, J., Van Melderen, L., Bernard, P., Thi, M. H., Loris, R., Wyns, L. &

Couturier, M. (1993) J. Mol. Biol. 231, 513–515.

12. Bram, R. J. & Kornberg, R. D. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 43–47.

13. Fedor, M. J., Lue, N. F. & Kornberg, R. D. (1988) J. Mol. Biol. 204,

109–127.

14. Giniger, E., Varnum, S. M. & Ptashne, M. (1985) Cell 40, 767–774.

15. Andrulis, E. D., Neiman, A. M., Zappulla, D. C. & Sternglanz, R. (1998) Nature

394,

592–595.


16. Rahner, A., Scholer, A., Martens, E., Gollwitzer, B. & Schuller, H. J. (1996)

Nucleic. Acids Res. 24, 2331–2337.

17. Brand, A. H. & Perrimon, N. (1993) Development (Cambridge, U.K.) 118,

401–415.

18. Hartley, K. O., Nutt, S. L. & Amaya, E. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99,

1377–1382.

19. Ornitz, D. M., Moreadith, R. W. & Leder, P. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA



88,

698–702.


20. Scheer, N. & Camnos-Ortega, J. A. (1999) Mech. Dev. 80, 153–158.

21. Gabant, P., Dreze, P. L., Van Reeth, T., Szpirer, J. & Szpirer, C. (1997)



BioTechniques 23, 938–941.

22. Guzman, L. M., Belin, D., Carson, M. J. & Beckwith, J. (1995) J. Bacteriol. 177,

4121–4130.

23. James, P., Halladay, J. & Craig, E. A. (1996) Genetics 144, 1425–1436.

24. Rose, M. D., Winston, F. & Hieter, P. (1990) Methods in Yeast Genetics (Cold

Spring Harbor Lab. Press, Plainview, NY).

25. Gietz, R. D., Schiestl, R. H., Willems, A. R. & Woods, R. A. (1995) Yeast 11,

355–360.


26. Orr-Weaver, T. L., Szostak, J. W. & Rothstein, R. J. (1983) Methods Enzymol.

101,

228–245.


27. Wu, Y., Reece, R. J. & Ptashne, M. (1996) EMBO J. 15, 3951–3963.

28. Leung, D. W., Chen, E. & Goeddel, D. V. (1989) Technique 1, 11–15.

29. Polaina, J. & Adam, A. C. (1991) Nucleic Acids Res. 19, 5443.

30. Loris, R., Dao-Thi, M. H., Bahassi, E. M., Van Melderen, L., Poortmans, F.,

Liddington, R., Couturier, M. & Wyns, L. (1999) J. Mol. Biol. 285, 1667–1677.

31. Cruz-Vera, L. R., Toledo, I., Hernandez-Sanchez, J. & Guarneros, G. (2000)



J. Bacteriol. 182, 1523–1528.

32. Alber, T., Sun, D. P., Nye, J. A., Muchmore, D. C. & Matthews, B. W. (1987)



Biochemistry 26, 3754–3758.

33. Marmorstein, R., Carey, M., Ptashne, M. & Harrison, S. C. (1992) Nature 356,

408–414.

34. Hidalgo, P., Ansari, A. Z., Schmidt, P., Hare, B., Simkovich, N., Farrell, S.,

Shin, E. J., Ptashne, M. & Wagner, G. (2001) Genes. Dev. 15, 1007–1020.

7930

͉ www.pnas.org͞cgi͞doi͞10.1073͞pnas.0402222101



Chakshusmathi et al.


Do'stlaringiz bilan baham:


Ma'lumotlar bazasi mualliflik huquqi bilan himoyalangan ©fayllar.org 2017
ma'muriyatiga murojaat qiling