Ферментативные методы анализа, основаны на использовании хим р-ций с участием ферментов

Использование иммобилизованных ферментов. Недостатки Ф. м. а. обусловлены рядом особенностей ферментов: потерей функциональной активности и стабильности ферментов под воздействием разл. факторов; высокой стоимостью из-за невозможности многократного использования растворимых ферментов и трудности их выделения и очистки. Применение иммобилизованных ферментов расширило возможности Ф. м. а. Более высокая стабильность и возможность многократного использования иммобилизованных ферментов позволили снизить стоимость анализов, повысить экспресс-ность, проводить хим. анализ в потоке и автоматизировать ферментативные методы. Впервые иммобилизованные ферменты в хим. анализе применили в сер. 60-х гг. 20 в. Для обнаружения фосфорорг. пестицидов в воздухе использовали холинэстеразу, включенную в крахмальный гель, нанесенный на полиуретановую пластинку. С помощью глюкозооксидазы или лактатдегидрогеназы, включенных в полиакриламидный гель, определяли соотв. глюкозу или молочную к-ту.
Помимо единичных иммобилизованных ферментов, в хим. анализе используют соиммобилизованные ферментные системы, позволяющие повышать чувствительность и селективность определения. При этом все чаще применяют иммобилизованные клетки микроорганизмов, содержащие естественный набор ферментов. Преимущество такой иммобилизации состоит в том, что исключаются стадии выделения, очистки и иммобилизации ферментов, увеличивается их стабильность. Иммобилизацию используют не только для ферментов, но и для субстратов, коферментов и эффекторов.
Предложены разнообразные реакторы с иммобилизованными ферментами- колонки, трубки, полые нити. Для заполнения колонок применяют обычно ферменты, ковалентно связанные с аминированным стеклом, акриловыми полимерами, агарозой, сефарозой, найлоновым порошком, силикагелем и т. д. Один из лучших носителей для колоночных реакторов - ссфароза, активированная бромци-аном. На ней успешно иммобилизовали и полиферментные системы. Так, для определения 2-20 мкМ триптофана анализируемую смесь пропускали через колонку, содержащую соиммобилизованные на бромциан-сефаразе триптофаназу и лактатдегидрогеназу.
В трубчатых реакторах фермент ковалентно иммобилизуется на внутр. пов-сти найлоновой трубки, длина к-рой варьирует от 1 до 3 м. С помощью таких реакторов, прокачивая через них анализируемый р-р, определяют, напр., в сыворотке крови мочевину, мочевую к-ту, аминокислоты, глюкозу, лактозу, мальтозу, пенициллин.
Разработан метод включения ферментов внутрь полых волокон триацетатцеллюлозы в момент их формования. Фермент оказывается включенным во внутр. полость, куда могут проникать только низкомол. субстраты. Эти нити накручивают в виде катушек, заключают в стеклянную оболочку и через такой бобинный ферментный реактор пропускают анализируемую смесь, напр., при определении пенициллина, мочевины или глюкозы.
Скорость пропускания потока смеси р-ров, содержащих анализируемую пробу и реагенты, через реакторы устанавливают такой, что после прохождения через ферментный реактор р-ция либо заканчивается (при анализе по конечному продукту), либо протекает до определенной глубины (скорость обычно определяют способом фиксированного времени).