Фибриллы внеклеточного матрикса состоят из белков коллагена (до 30% массы всех белков организма), фибронектина и эластина, а также, в случае кости, из кристаллов фосфата кальция

3.7.2. Моноклональные антитела (иммуноглобулины, Ig). В организме животных в ответ на попадании в него чужеродного вещества (антигена), в качестве защитной реакции синтезируются антитела - белки сыворотки крови. Генетичекая система организма позволяет иммунной системе вырабатывать специфические антитела на огромное множество антигенов естественного и искусственного происхождения. При этом за синтез каждого из вырабатываемых антител отвечает лишь один из клонов В-лимфоцитов, который с высокой специфичностью узнает конкретный антиген. Антигенами могут быть клетки микроорганизмов, вирусы, белки, полисахариды, а также, значительно реже, нуклеиновые кислоты и низкомолекулярные вещества (антибиотики, пестициды и т.д.). Антитела образуются против определенной части на поверхности антигена, - гаптен (антигенный детерминант). В молекуле белка гаптеном является участок поверхности из около 5 аминокислотных остатков. Молекула антитела состоит из одинаковых двух легких (L-цепь, из 220 аминокислот) и двух тяжелых (H-цепь, из 440 аминокислот) пептидов, соединенных между собой ковалентными -S-S- связями. Пространственная структура антитела напоминает букву Y с двумя идентичными антигенсвязывающими участками, ответственными за процессы иммунного ответа. Антигенсвязывающий участок антитела образован из одной H и одной L-цепи, а противоположный, константный, конец молекулы Ig состоит из двух концов H-цепи (рис. 1.18). По весу, на долю антител приходится около 20% суммарного белка плазмы.

Рис. 1.18. Схема строение иммуноглобулина Ig (антитело)

Получение моноклональных антител. Основными продуцентами антител у млекопитающих являются В-лимфоциты, которые начинают их активно синтезировать в ответ на появление в крови специфического к антителу антигена. После нескольких инъекций антигена в присутствии стимуляторов иммунного ответа в сыворотке крови животных накапливаются специфические антитела. Поэтому, следующей проблемой является очистка полученных антитела от многочисленных примесных белков.

Рис. 1.19. Продукции моноклональных антител гибридомой (по Г. Фаффу, 1984). А – после инъекции антигена (4 антигенные детерминанты на поверхности) лимфоциты мыши продуцируют 4 типа антител; антисыворотка из крови мыши содержит смесь антител; Б – лимфоциты сливают с клетками миеломы; гибридомы (источник чистых антител) клонируют.

Технология получения гибридом включает в себя следующие основные этапы:

• 
  животных (например, мышей) иммунизируют антигеном;
  
• 
  из их селезенки выделяют спленоциты;
  
• 
  в присутствии полиэтиленгликоля спленоциты сливают с дефектными опухолевыми клетками (обычно дефектные по ферментам запасного пути биосинтеза гипоксантина или тиамина);
  
• 
  гибридные клетки высевают на селективную среду, где могут размножаться лишь гибридомы;
  
• 
  после отбора таких гибридом их тестируют на наличие способности к синтезу антител;
  
• 
  при положительном результате отобранный клон вводят животным с целью образования опухоли, продуцирующей антитела, либо наращивают их в культуре in vitro.
  

Нормальная иммунная система в ответ на чужеродные агенты (антигены) способна вырабатывать до миллиона различных видов антител. Напротив, злокачественная клетка синтезирует лишь один тип антител, но при этом способна неограниченно долго и достаточно быстро размножаться. Недостатком миеломных клеток является то, что они могут вырабатывать антитела лишь к определенному антигену.
Г. Кёлер и Ц Мильштейн (1975) предложили слить клетку мышиной миеломы с В-лимфоцитами из селезенки мыши, которую предварительно иммунизировали специфическим антигеном. Результатом слияния стала гибридома, которая совмещала в себе признаки обеих родительских клеток: бессмертие и способность секретировать огромное количество какого-либо одного специфичные для нее антитела.
При размножении гибридомы образуют клон из множества родственных клеток, синтезирующих моноклональные антитела, которые можно производить в неограниченных в промышленных масштабах. Особенностью моноклональных антител является их высокая специфичность по отношению к вполне конкретной антигенной детерминанте. При этом технология позволяет можно получать нескольких моноклональных антител на разные антигенные детерминанты, в том числе сложные макромолекулы.
Например, разработана технология получения моноклональных антител для идентификации различных соединений, макромолекул, самих клеток и их фрагментов и т.д. При этом моноклональные антитела нашли широкое применение:

• 
  в медицине и ветеринарии при диагностике паталогических процессов, патогенов и т.д.;
  
• 
  в экологии в процессах мониторинга загрязнений окружающей среды, при очистке среды от ксенобиотиков;
  
• 
  при разработке новых методов терапии;
  
• 
  в случаях целевой доставки лекарственных препаратов к пораженному органу;
  
• 
  в качестве зондов для определения природы молекул на поверхности клеток и клеточных органелл;
  
• 
  для детекции активности ферментов, а также происходящих в клетке биологических процессов;
  
• 
  при диагностике вирусных, бактериальных и грибных заболеваний растений;
  
• 
  при селекции и получения безвирусного посадочного материала;
  
• 
  в генной и клеточной инженерии для отбора продуцентов или трансформированных клеток.
  

Возможности использования моноклональных антител связаны и с иммунофлюоресцентным методом (А. Кунс, 1955). Суть метода заключается в связывании константного конца антитела с флюоресцирующим красителем, что позволяет визуально наблюдать за положением антител в пространстве. В модификациях этого метода вместо красителя используют ферменты (иммуноферментный анализ), радиоизотопы (радиоиммунный анализ) и т.д., что позволяет усиливать сигнал или наблюдать за взаимодействием «антитело-антиген» в реальном времени. Разнообразие ферментов (описано более двух тысяч) указывает на те возможности, которые заложены в иммуноферментном анализе. Физические методы регистрации сигнала, например, с помощью спектрофотометра позволяют определить количество биоорганических веществ с точностью до 10^-12 г/литр.
Разработанные технологии позволяют хранить гибридомы в замороженном состоянии. Например, созданы банки моноклональных антител с целью их дальнейшего производства и использования при решении разнообразных задач в разных отраслях медицины, экологии, промышленного производства и т.д.
соответствовал фенотипу донора.