Gerbitsidlarga chidamli transgen o‘simliklar olish reja

O‘simliklar transformatsiyasining dalillari. O‘simliklar transformatsiyasi vektorlari tarkibiga funksional gendan tashqari selektiv nishon genlari kiradi. Bu gen odatda antibiotiklar kanamitsin (prtII -geni) yoki gigromitsin (prtII- geni) ga chidamlilik genlarini kodirlaydi, shuning uchun transgen o‘simliklarni dastlabki tanlov ishlarini tegishli antibiotiklar saqlovchi oziqa muhitlarida olib boriladi. Bunday muhitda genomi tarkibida selektiv nishon geni bo‘lgan o‘simliklargina regeneratsiya qila oladi. Biroq selektiv muhitda o‘sa olish xususiyatining o‘zi o‘simlikning transgen tabiatini isbotlovchi yagona dalil bo‘la olmaydi.
T-DNK ketma-ketliklari borligini to‘liq isbotlashda polimeraza zanjir reaksiyasi (PZR) tahlili va T-DNK bo‘lagini radioaktiv zond sifatida qo‘llash orqali transgen o‘simlik xromosoma DNK sining blot – gibridizatsiyasiga asoslangan molekulyar tahlili o‘tkaziladi. Bunday tahlillarni o‘tkazish juda qimmat tursa-da, olingan natijalar transformatsiya amalga oshganligi, T-DNK – konstruksiyalarning qanchasi o‘simlik genomiga o‘rnasha olganligi to‘g‘risida ishonchli ma’lumot olish imkonini beradi. Bundan tashqari, funksional gen ekspressiyasining qo‘shimcha tahlilini tegishli mRNK yoki oqsilni aniqlash usullari orqali amalga oshiriladi.
O‘simlik genomiga begona genlarning ekspressiyasi
Begona genlarning o‘simlik genomiga ekspressiyasi natijasida bir qator muammolar kelib chiqadi. Birinchi marta o‘simliklar transformatsiyasi uchun foydalaniladigan genlar bakteriyalardan ajratib olingan bo‘lib, ularni o‘simlik hujayralari transformatsiyasi uchun to‘g‘ridan –to‘g‘ri ishlatib bo‘lmasdi.
Bakteriya genlari eukariot hujayralarda transkripsiya bo‘lishi uchun ularning promotor ketma-ketliklarini o‘simlik genlari promotorlari yoki boshqa o‘simlik hujayrasida transkripsiyani initsatsiya qila oladigan prmotorlariga almashtirish lozim bo‘ladi. Bundan tashqari, bakterial genning 3 - qismiga poliadenillanish signalini saqlovchi fragmentni ulash lozim. Bunday modifikatsiyalar eukariot RNK – polimerazaning bakterial ketma-ketlikni transkripsiyalashi va undan so‘ng mRNK o‘simlik hujayrasida bakterial oqsilni translyasiya qilish uchun kerak bo‘ladi.
Bakterial genlarning ekspressiyasi uchun promotor sifatida ko‘pincha gulkaramning mozaika virusi (SaMV)ning 35S – RNK promotoridan foydalaniladi. Bunday tanlov bir vaqtning o‘zida ikki xil muammoni hal etish imkonini beradi: birinchidan, ikki pallali o‘simliklar promotorlari bir pallalilar genomida ko‘p hollarda faoliyat yuritolmaydi, aksincha, 35S SaMV promotori har qanday o‘simlik genomida transkripsiyani ta’minlaydi. Ikkinchidan, ko‘pgina eukariot promotorlari ancha kuchsiz bo‘lib, SaMV ning 35S promotori uning nazoratidagi genning yuqori darajagi ekspressiyasini ta’minlaydi. Ko‘pgina hollarda o‘simlik hujayrasiga o‘simlik genini transformatsiya qilishda oqsil mahsuloti ajralib chiqishini oshirish uchun uning promotorini juda kuchli bo‘lgan SaMV ning 35S promotori bilan almashtiriladi. CaMV 35S-promotori konstitutiv bo‘lib, transgen o‘simlikning barcha to‘qimalarida uning nazoratidagi genning kuchli ekspressiyasini ta’minlaydi. Aynan shuning uchun CaMV 35S-promotori o‘simliklar transformatsiyasida qo‘llaniladigan vektor konstruksiyalar ichida eng ko‘p qo‘llaniladi. Keyingi yillarda ba’zan CaMV 35S ketma-ketligini ikki karra ko‘paytirilgan nusxasi, sun’iy olingan MAC - promortoridan ham foydalanilmoqda.
So‘nggi paytlarda o‘simlik genlarining to‘qimaga xos promotorlari katta ahamiyat kasb etmoqda. Bu promotorlarning CaMV 35S promotoridan afzalligi shundaki, bunday promotorlar nazoratidagi genlar ma’lum bir to‘qimalardagina ekspressiya bo‘ladi. Masalan, patatin promotori nazoratidagi har qanday gen faqat kartoshka o‘simligi tuganagiga ekspressiya bo‘ladi, chunki patatin oqsili – kartoshka tuganaklari zahira oqsili bo‘lib, uning genlari faqat tuganaklardagina ekspressiyalanadi. To‘qimaga xos promotorlar begona oqsil o‘simlikning ma’lum bir a’zolari uchun zarur bo‘lgan hollarda qo‘llaniladi. Masalan, o‘simliklar ildizini ba’zi bir tuproq patogenlaridan himoya qilishda ildizga xos promotorlardan foydalanish qulay, chunki ular o‘simliklarning patogenlar bilan munosabatga kirishuvchi faqat er osti qismidagina himoya oqsili sintezlanishiga olib keladi. O‘simliklar uchun bunday promotorlardan foydalanish birmuncha qulaydir.
SHuningdek indutsibel promotorlardan ham foydalaniladi. Konstitutiv CaMV 35S promotoridan farqli ravishda bunday promotorlar nazoratidagi genlar har doim ham ekspressiya bo‘lavermasdan, faqat ma’lum sharoitlardagina ekspressiya bo‘ladi. Masalan, jarohatlanishda indutsirlanadigan promotorlar, metall ionlari (mis, temir, va h.k.) ishtirokida yuzaga chiqadigan metall-indutsibellarini keltirish mumkin. SHunday qilib, bunday promotorlar nazoratidagi genlarning «kiritilishi va o‘chirilishi» oson boshqariladi. Indutsibel promotorlar nafaqat o‘simliklarda, balki, umuman, gen muhandisligida keng qo‘llaniladi. To‘qimaga xos va indutsibel promotorlarning kamchiligi ularning faolligining pastligidadir.
Promotorlardan tashqari transgenning ekspressiyalanishga uning o‘simlik genomiga integratsiya bo‘lish joyi ham ta’sir ko‘rsatadi. T-DNK ketma-ketligi genomning istalgan qismiga o‘rnasha oladi deb hisoblansa-da, ko‘plab tadqiqotlarda bu hodisa tasodifan amalga oshmasligi isbotlangan. Ko‘pincha T-DNK gen ekspressiyasi amalga oshmaydigan geteroxromatin uchastkalariga o‘rnashadi va transgen har qanday kuchli promotor ta’sirida ham transkribirlanmaydi. Buni takroriy transformatsiyalar orqali ham anglab olish mumkin.
Transgen o‘simliklar olishning ilk bosqichlarida begona genlar eksperessiyasining nishon belgilari – reporter genlardan foydalaniladi. Odatda, reporter genlarning mahsulotlari oddiy usullar bilan oson aniqlanadi. GUS deb nomlanuvchi reporter genidan keng foydalaniladi, u - glyukuronaza fermentini kodirlaydi va substratga qo‘shilganda uni och havo rangli birikmaga qadar parchalaydi. Bundan tashqari gfp retseptor geni ekspressiya bo‘lganda oson aniqlanadigan fluoressent oqsilni hosil qiladi. Odatda, retseptor genning ekspressiyasi transgen o‘simlikda funksional gening ekspressiyalanish darajasi bilan o‘zaro mos keladi.