Idealan fiksativ treba da omogući : Idealan fiksativ treba da omogući :
a. dobru očuvanost morfoloških detalja
b. da spreči procese autolize i truljenja c. da ne uništi reaktivnost antigena
Povratak tkivne antigenosti Povratak tkivne antigenosti U nekim slučajevima, imunohistohemijska bojenja nisu uspevala ili su davala slabe rezultate. Aldehidi koji se koriste u fiksaciji mogu maskirati tkivne antigene formiranjem metilenskih mostova između proteina. Takve su promene reverzibilne do izvesnog stupnja, pa se u praksi nalazi nekoliko metoda kojima se ovakvi problemi mogu prevazići: jedna je posredovana proteolitičkim enzimima (najčešće se koristi TRIPSIN, 37oC i pH7.8) , a u drugoj se koristi zagrevanje (0.1 M citratni pufer, pH 6). Obe metode služe da se razbiju metilenski mostovi, da se izlože antigena mesta i omogući vezivanje antitela.
Blokiranje nespecificnih mesta Blokiranje nespecificnih mesta Immunohistohemijska bojenja mogu biti specifična i ne -specifična. Neadekvatna ili produžena fiksacija moze dati lažno pozitivne rezultate usled pasivnog preuzimanja proteina ili difuzijom antigena. Ovakvi rezultati se mogu javiti kada je tkivo koje se bojilo bilo preveliko. Antitela, posebno poliklonska mogu ponekad biti kontaminirana sa drugim antitelima usled nedovoljno čistog antigena koji je korišćen za imunizaciju životinje domaćina. Glavni uzrok ne-specifičnog bojenja je ne-imunološko vezivanje specifičnog imunskog seruma hidrofobnim ili elektrostatičkim silama na odredjenim mestima u tkivu. Tada se formira pozadinsko bojenje koje je uniformno i izbegne se blokiranjem sa normalnim serumom. Aktivnost endogene peroksidaze je značajno izrazena u mnogim tkivima i može se uočiti na fiksiranim presecima tkiva u reakciji sa DAB supstratom. Da bi se izbeglo nespecifično bojenje zbog endogene peroksidaze, sekcije tkiva se pretretiraju sa vodonik-peroksidom pre inkubacije sa primarnim antitelom. Ukoliko se zna da tkivo poseduje aktivnost endogene alkalne fosfataze, tada se tkiva blokiraju u levamizolu, ukoliko se AP koristi kao boja i supstrat bojenja. Tkiva, kao jetra ili bubreg imaju endogeni biotin. Da bi se izbeglo neželjeno vezivanje endogenog biotina u reakciji avidin-biotin kompleks, potrebno je pretretirati sekcije sa ne-konjugovanim avidinom koji se posle zasiti sa biotinom. Neka tkiva poseduju autofluorescencu. Ukoliko je to slučaj, pregledati tkivo na fluorescentnom mikroskopu i izbeći ovaj nacin bojenja.
Primarni sloj - antitelo koji specifično prepoznaje antigen i vezuje se za njega Fab fragmentima Primarni sloj - antitelo koji specifično prepoznaje antigen i vezuje se za njega Fab fragmentima Sekundarni sloj – sekundarno antitelo koje se vezuje jednim Fab fragmentom za Fc fragment primarnog sloja, a drugim Fab fragmentom za takozvani PAP kompleks Tercijerni sloj PAP kompleks – peroksidaza antiperoksidaza - solubilni imunokompleksi molekula peroksidaze i antitela visokog titra na peroksidazu. Peroksidaza je obeleživač koji reakcijom sa odgovarajućim hromogenom daje obojene precipitate i na taj način omogućava visuelizaciju cele reakcije odnosno nastalih imunih kompleksa
Ova tehnika se od PAP tehnika razlikuje samo u tercijernom sloju. Ova tehnika se od PAP tehnika razlikuje samo u tercijernom sloju. Sekundarno antitelo-konjugovano sa alkalnom fosfatazom.Supstrat za alkalnu fosfatazu-FAST-RED-komercijalno se nabavlja (rastvorljiv u alkoholu) boja ljubicasto-plava
Jednostavna, dvostepena procedura Jednostavna, dvostepena procedura Sekundarni sloj predstavlja dekstranski polimer na koji su konjugovana sekudarna antitela (protiv miša IgG ili protiv zeca IgG) i molekuli peroksidaze. Po dvadeset molekula sekundarnih antitela i po sto molekula peroksidaze je konjugovano na jednom molekulu polimera. Ovaj univerzalni reagens može da detektuje bilo koje primarno antitelo mišjeg ili zečjeg porekla. Omogućava višestruku amplifikaciju signala.
Sekundarno antitelo na Fc fragmentu obeleženo je biotinom. Sekundarno antitelo na Fc fragmentu obeleženo je biotinom. Poslednji sloj je kompleks avidina i peroksidaze odnosno streptavidina i peroksidaze koji se specifično vezuju za biotin na sekundarnom antitelu. Obeleživač je peroksidaza.
Hoechst ili DAPI bojenje pripada familiji fluorescentnih boja koje se koriste da boje DNK. Hoechst boja po hemijskoj stukturi pripada bis-benzimidima i ekscitira se na oko 350 nm i emituje plavu fluorescentnu boju, kao i DAPI. Hoechst bojenje se pobudjuje upotrebom xenon ili živinom lampom ili UV laserom (DAPI). Intenzitet bojenja zavisi od rastvaraca i njegovog pH. Hoechst i DAPI boja je rastvorljiva u vodi i organskim rastvaračima, kao što su dimetilformamide ili dimetil sulfoxide (DMSO). Štok boje je u obično u koncentraciji od 5 mg/ml. Vodeni rastvor ove boje se čuva na tamnom i stabilan je na 2-6 °C šest meseci. Za dužu upotrebu, rastvori se zamrzavaju na ≤-20 °C. Radni rastvor Hoechst boje je 1 g/ml, a DAPI 300mM i ćelije se boje od 1-30 minuta na RT i isperu se od viška boje. Hoechst ili DAPI bojenje pripada familiji fluorescentnih boja koje se koriste da boje DNK. Hoechst boja po hemijskoj stukturi pripada bis-benzimidima i ekscitira se na oko 350 nm i emituje plavu fluorescentnu boju, kao i DAPI. Hoechst bojenje se pobudjuje upotrebom xenon ili živinom lampom ili UV laserom (DAPI). Intenzitet bojenja zavisi od rastvaraca i njegovog pH. Hoechst i DAPI boja je rastvorljiva u vodi i organskim rastvaračima, kao što su dimetilformamide ili dimetil sulfoxide (DMSO). Štok boje je u obično u koncentraciji od 5 mg/ml. Vodeni rastvor ove boje se čuva na tamnom i stabilan je na 2-6 °C šest meseci. Za dužu upotrebu, rastvori se zamrzavaju na ≤-20 °C. Radni rastvor Hoechst boje je 1 g/ml, a DAPI 300mM i ćelije se boje od 1-30 minuta na RT i isperu se od viška boje.Hoechst i DAPI boja se vezuju za mali žljeb dvostruke zavojnice., posebno za sekvence koje su bogate adeninom i timinom. Iako se može vezati za sve nukleinske kiseline, AT domeni pojačavaju intenzitet boje, značajno. Hoechst boja je lipofilna boja i nesmetano prolazi kroz ćelijsku membranu i vezuje se za DNK u živim ili fiksiranim ćelijama. Ovo bojenje se naziva supravitalno bojenje, što znači da ćelije mogu da prežive tretman sa ovom bojom. DAPI se uglavnom koristi za fiksirane ćelije, jer sporo prolazi kroz membranu.Obe boje su kancerogene i potencijalni mutageni, pa se savetuje rad u rukavicama.
Faloidin je izolovan iz gljive ludare i vezuje se za subjedinice aktina u filamentu na njihovim dodirnim površinama, “zaključava” ih i stabiliše, što ga čini jednim od najviše korišćenih supstanci za izučavanje aktinskih filamenata, jer će se fluorescescentno-obeleženi faloidin vezivati isključivo za F-aktin. Tako ćemo biti u mogućnosti da ga kvalitativno “razdvojimo" od G-aktina i pratimo u različitim ćelijskim procesima. Faloidin je izolovan iz gljive ludare i vezuje se za subjedinice aktina u filamentu na njihovim dodirnim površinama, “zaključava” ih i stabiliše, što ga čini jednim od najviše korišćenih supstanci za izučavanje aktinskih filamenata, jer će se fluorescescentno-obeleženi faloidin vezivati isključivo za F-aktin. Tako ćemo biti u mogućnosti da ga kvalitativno “razdvojimo" od G-aktina i pratimo u različitim ćelijskim procesima.
Prednost imunoenzimskih tehnika nad imunofluorescentnim: Prednost imunoenzimskih tehnika nad imunofluorescentnim: korišćenje svetlosnog mikroskopa, pored bojenja vidi se i morfologija ćelija na grubom ćelijskom nivou.
Hematologija Hematologija diagnostika hematoloških oboljenja subklasifikacija leukemijaAspiraciona citologijaPatologija klasifikacija neoplazmi fenotip – primarni ili metastatski prognostički i terapeutski značaj MikrobiologijaIdentifikacija i klasifikacija mikroorganizama
http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/immunohistochemistry.html http://www.sumanasinc.com/webcontent/animations/content/immunohistochemistry.html
Do'stlaringiz bilan baham: |
