Immunoenzim tahlilining getrogen usuli

Immunoenzim tahlilining getrogen usuli.
REJA

1. 
   Immunoenzim tahlili
   
2. 
   getrogen usuli
   

Immunoenzim tahlili 60-yillarni o‘rtalarida vujudga kelib, avval, gistologik preparatda antigenni identifikatsiyalash, keyin esa immunodiffuziya va immunoelektroforez testlarida pretsipitatsiya chiziqlarini aniqlashda qo‘llanilgan. Bundan tashqari biologik suyuqliklarda antigenlar va antitelalarni miqdoriy tahlili uchun ishlatila boshlangan. Metodni geterogen usulini ishlab chiqishda E.Engvall va R.Perlmann, shuningdek, ularga bog‘liq bo‘lmagan ravishda V.K Van Veemen va A.SHuurslar 1971 yili o‘z tadqiqot ishlarini olib borganlar va ushbu usulning muallifi hisoblanadilar. 1972 yili esa E.K. Rubenshteyn o‘z shogirdlari bilan IET gomogen usulini ishlab chiqishga muvaffaq bo‘lganlar. Ushbu IET lari usullarini ishlab chiqqan mualliflar aynan, o‘z tadqiqot ishlarida va shuningdek, amaliyotda IET talablariga javob bera oladigan ferment molekulalarini va ularning kofaktorlarini nishon sifatida qo‘llab, kon’yugat olish mumkinligini isbotlaganlar. Sababi yuqorida aytib o‘tilgandek, fermentlar o‘z substratlari ishtirokida kimyoviy reaksiyani I0⁶-10¹² marotaba tezlashtirar ekanlar, shu bilan birga ular antigen va antitelalar o‘rtasida bo‘ladigan immunokimyoviy jarayonlarning sezgirligini ham bir necha bor oshirib, aniqlanishi kerak bo‘lgan modda miqdorini (pkM) juda kichkina qiymatlarda aniqlash uchun kerakli fermentativ reaksiya turini katalizlash imkoniyatga ega moddalar hisoblanadilar. SHuning uchun immunokimyoviy reaksiyalarda, faqat ferment molekulalari emas, balki ularning kofaktorlari ham maxsus markerlar sifatida IET ning turli usullarida keng qo‘llanilmoqda.
Hozirgi vaktda immunoenzim tahlili (IET) usulining xilma-xil turlari ishlab chiqilgan. IET turli xil moddalarni aniqlash uchun keng qo‘llaniladi. Jumladan, dorivor preparatlarni, gormonlarni, antitelalarni, virus va bakterial antigenlarni, oziq-ovqat toksinlarini, fitotoksinlarni, narkotik moddalarni, hamda sifiliz, malyariya taksoplazmoz, alveokok, qizilcha va gelmintlarni, salmonellezni va kasallik tug‘diruvchi mikroorganizmlarni diagnoztika qilishda keng qo‘llaniladi. Modomiki, IET antitelalarni aniqlashda ham qo‘llanilar ekan, bu esa o‘z navbatida ko‘p kasalliklarni boshlanish bosqichida oldini olish va serodiagnostika qilish imkoniyatini yaratadi.
IETning asosiy mohiyati shundan iboratki, biokatalizator molekulasi reaksiya ketadigan zonada antigen bilan yoki antitela bilan bog‘langan shaklda bo‘lishidir. Antigen yoki antitelaning ferment molekulasi bilan bog‘langan shakli kon’yugat deb yuritiladi. IETni o‘tkazish vaqtida antigen antitana molekulasi bilan bog‘langandan so‘ng, ushbu kompleksni aniqlash uchun, fermentning substrati kiritiladi va reaksiya natijasida xosil buladigan mahsulotlar aniqlanadi.
SHuni aytib o‘tish lozimki, IETda fermentativ reaksiyani deteksiya qilish hosil bo‘lgan mahsulotni aniqlash bilan chegaralanmay, balki reaksiyasi natijasida rangli o‘zgarish, issiklik ajralish yoki yutilish, flyuretsensiya, paramagnit xususiyatlarni yoki boshka fizik-kimyoviy parametrlarni o‘zgarishi natijasida aniqlashni amalga oshirish mumkin.
Hozirgi kunda qo‘llaniladigan immunoenzim tahlili metodlarining umumiy ko‘rinishini sxematik ravishda quyidagicha izohlash mumkin.
IETni o‘tkazishda immun komponentlarning tozalik darajasi muhim ahamiyatga egadir. Sababi IETning sezgirlik darajasi komponentlarga va ayniqsa unda nishon sifatida qo‘llanilayotgan ferment molekulasi faolligiga bog‘liq bo‘ladi. Antitela serologik jihatdan faol va antigenga nisbatan titri yuqori bo‘lishi uchun, antigenning immunogenlik xususiyati yuqori bo‘lishi bo‘lishi kerak. SHunda antigen kerakli antitelalarning uzluksiz sintezini amalga oshirishga qodir bo‘ladi. IETda ishlatilayotgan immun komponentlarning titri yuqori bo‘lmasa, ushbu oqsillar modifikatsiyadan so‘ng denaturatsiyalanishi hisobiga inaktivlanadi.
Ayniqsa tokcinlar holatidagi oqsil tabiatli ba’zi moddalar, viruslar, ba’zi mikroorganizmlarni faol bo‘lmagan shtammlarini antigen sifatida olish kon’yugatlarni kimyoviy sintezida ijobiy natija bermaydi. SHu sababli antigen antitelalarni ma’lum manbadan ajratish va ularni tozalash va kalibrovka egri chiziklarini tayyorlash talab etiladi. Antitelalarni tozalashda biosferik xromatografiya qo‘llaniladi. Buning uchun avvalo biospetsifik va immunosorbentlar sintezlash kerak. Ushbu immunosorbentlar IETning geterogen variantlarini ishlab chiqishda kerak bo‘ladi.Immunosorbentlar olish uchun mmobilizatsiyalangan antigenlarni sintezlash zarur. CHunki geterogen IET qattiq tashuvchi yuzasida olib boriladi.IETni qaysi usuli amalga oshmasin unda albatta nishon sifatida ferment molekulari ishlatiladi deb yuqorida aytib o‘tilgan edi. SHu sababdan avvalo antigen yoki antitela kon’yugati sintezlanadi. Buning uchun antigenga nisbatan anik spetsifik bulgan antitela tikuvchi komponent bilan modifikatsiyalanadi ya’ni antitela ferment molekulasiga kimyoviy (kovalent) bog‘lanadi. Kimyoviy sintezlangan kon’yugatlarning fermentativ va serologik faolliklari aniqlanadi. Kon’yugatlar tahlilni o‘tkazish uchun yaroqli bo‘lsa, nihoyat so‘ngi bosqichda IET o‘tkaziladi. Olingan ma’lumotlar kerakli asboblar yordamida tahlil qilinadi. Bu o‘rinda shuni qayd etish lozimki, immunoenzim tahlilini o‘tkazishda bir qancha qoidalarga rioya qilish talab etiladi.

Immunoenzim tahlilini ishlab chiqishda, yaratishda bir qator qoidalarga rioya qilish kerak. Birinchidan aniqlanayotgan moddani, ya’ni antigenni taxlil qilishda yukori darajada mos keladigan, unga o‘ta spetsifik bo‘lgan antitanalarni tanlab olish talab etiladi. Ikkinchidan shunday fermentni nishon sifatida ishlatish uchun tanlab olish kerekki, u antigen yoki antitana bilan shuningdek, tashuvchi bilan kimyoviy usulda bog‘langanda ham, o‘z xususiyatini o‘zgartirmasligi va bir vaqtning o‘zida antigen va antitana o‘rtasida kechadigan immunologik reaksiyaga ta’sir kilmasligi va ayniqsa, fermentativ faolligini saqlab qolishi kerak. Uchinchidan IETni o‘tkazishda qo‘llaniladigan reagentlar va asbob uskunalar, shuningdek immun komponentlarni immobillash uchun ishlatiladigan tashuvchilar har tomonlama qulay va iqtisodiy jihatdan talabga javob beradigan bo‘lishi lozim. Nihoyat ahamiyatli omillardan yana biri IETda komponentlarni barqarorligini ta’minlash muhimdir. Bunda yuqori barqarorlikka ega bo‘lgan komponentlarni olish uchun tikuvchi agentlar yordamida tashuvchilarga immobillash jarayonini amalga oshirish yordamida erishish mumkin. Bu o‘rinda shuni aytib o‘tish lozimki, immunoenzim tahlilini, asosan ikkita katta usulga ajratish mumkin: Geterogen va gomogen usullarga. IETning geterogen usuli qattiq tashuvchi ishtirokida olib boriladi Bunda immun kompleks tashuvchiga immobillangan antitana yoki antigen va ferment bilan nishonlangan antitana yoki antigen bilan immun kompleks hosil qiladi va immun reaksiya amalga oshgandan so‘ng, fermentativ faollikni o‘lchash orqali antigen miqdori kalibrovka chizig‘i yordamida aniqlanadi.

IETning gomogen usulida esa barcha jarayonlar suyuq muhitda, ya’ni qattiq tashuvchi ishtirok etmagan sharoitda olib boriladi. Immun kompleksni registratsiya qilish jarayoni katalitik yoki ferment reaksiyalari ketishi bilan bog‘lik o‘zgarishlar asosida amalga oshiriladi. YUqorida qayd etilgan ikkala usul uchun ham umumiy talab shundan iboratki, antigen yoki antitanalarni standart eritmalari asosida oldindan kolibrovka chizigini yaratish kerak bo‘ladi. CHunki, aniqlanayotgan modda miqdorini aniqlash, IET natijasini tahlil qilish ana shu kolibrovka asosida ko‘rsatib beriladi.

Bu usullarni xam bir kancha gruppalarga bulish mumkin. . Immebilizatsiyalangan antitela va antigen-ferment kan’yugatlarini kullash. Aniklash uchun uch boskichda olib boriladi:Birinchi boskichda anti- telaferment ken’yugatlarini ma’lum mikdori aniklanyotgan antigen bor namuna bilan aralashtiriladi./-rasm/. Keyingi boskichda immobilizatsiyalangan antitelalar bilan bu aralashmani uzaro ta’sirida ikkala antigen nishonlangan vanishonlanmagan fermentning aralashmadagi proporsional mikdori ishtirok etadi.Uchynchi boskichda substrat bilan reaksiyani ikkita usuldan birida yo boglanmagan kon’yugat molekulalari bilan, yoki immobilizatsiyalangan antitela boglangan ferment molekulasi bilan utkazish mumkin.Reaksiyani ustunli /kolonochniy/ tarzda utkazish kulay. Antitelalar bilan immobilizatsiyalangan tashuvchi mikrokolonkaga joylashtiriladi.Avvalam bor tashuvchidagi antitelalar mikdoriga ekvivalent bulgan anti­gen-antitela kon’yugatlarini mikdori aniklanadi./bu tajriba kolonka orkali fermentativ aktiv kon’yugat chikmaguncha, nishonlangan antigenning oshib boruvchi mikdori utkaziladi/.Oldindan antigenni ekvivalent mikdori topilgandan sunggina aniklashni uziga utiladi. Kolonka orkali aniklanayotgan antigen tutgan namuna utkaziladi. Sungra u yuvilgandan keyin, xuddi shu kolonka orkali antigenlarni fermentli ken’yugatlarini ekvivalent mikdoridagi eritmaga utkaziladi. Aniklanayotgan namunada antigen kancha kup bulsa, mikrokolonkadan yigilgan eritmaning ferment aktivligining kursatkichi shuncha yukori buladi.

. Immobilizatsiyalangan antitelo va antitelo-ferment kan’yugatlarini kullash. Bu metod sodda bulganligi uchun xiilma-xil maksadlar keng kullaniladi. Biror bir kulay metod yordamida antitelo immobili­zatsiyalangan xolatda utkaziladi. Bunda tashuvchini uzi reaksion teshik / yacheyka / rolini bajaradi / rasm /.Birinchi boskichda immobilizatsiyalangan antitelelarga, aniklana­yotgan antigen tutgan namuna kulishadi. Sungra antitelo bilan boglanmagan barcha birikmalar yuviladi. Keyingi boskichda peaksion muxitga antitelolarni fermentli ken’yugatlari solinadi. Nishonlangan antitelolar xam antigenlar bilan boglanadi va ularning mikdori binobarin fer­ment aktivligi xam namunadagi antigen mikdoriga proprsional buladi. Boglanmagan kon’yugatlarni yuvgandan sung substrat kushiladi.⁶