Курса: Независимый проект по биологии магистерская работа

---

Факультет природных ресурсов и
Биотехнология, магистерская программа • Examensarbete/Sveriges lantbruksuniversitet,
Магистерская работа • 30 сек. • Второй цикл, A2E
Институт микробиологии: 2012:12 • ISSN 1101-8151
Уппсала 2012
Сельскохозяйственные науки
Кафедра микробиологии
Бактерии в производстве биотоплива
Афсар Али
Machine Translated by Google

---

Machine Translated by Google

---

Афсар Али
Бактерии в производстве биотоплива
Фолькмар Пассот, Шведский университет сельскохозяйственных наук,
Евгения Тюкова, Шведский университет сельскохозяйственных наук,
Кафедра микробиологии
Название курса: Независимый проект по биологии - магистерская работа
Год издания: 2012
Код курса: EX0565
Юмико Сакураги, Копенгагенский университет,
Программа/образование: Биотехнология, Магистерская программа
Кредиты: 30 гектаров
Интернет-публикация: http://stud.epsilon.slu.se
Лантбруксуниверситет Швеции
Шведский университет сельскохозяйственных наук
Ключевые слова: Rubisco, цианобактерии, оперон RBC, плазмида pDF-Trc, инфузионное клонирование,
углеродная фиксация, Lactobacillus vini, Saccharomyces cerevisiae, Dekkera bruxellensis, производство этанола,
трансформация, кокультура, толерантность к этанолу.
Супервайзеры:
Уровень: Второй цикл, A2E
Кафедра микробиологии
Экзаменатор:
Название серии: Examensarbete/Sveriges lantbruksuniversitet, Institutionen for mikrobiologi: №: 2012:12
ISSN: 1101-8151
Факультет природных ресурсов и сельскохозяйственных наук
Место издания: Уппсала
Кафедра биологии растений и биотехнологии
Упсальский биоцентр
Кафедра микробиологии
Machine Translated by Google

---

Machine Translated by Google

---

Абстрактный
трансформировали с помощью реакции инфузионного клонирования. Это могло быть
связано с используемой концентрацией плазмиды, которая была меньше рекомендуемой
концентрации. При клонировании оперона RBC путем обычной рестрикции/лигирования
были получены трансформанты E. coli, содержащие оперон.
Исследование показывает, что L. vini может переносить и выживать при более высоких
концентрациях этанола по сравнению с другими микроорганизмами. L. vini имела лучшую
скорость роста при совместном культивировании отдельно с Saccharomyces cerevisiae и
Dekkera bruxellensis , чем при совместном культивировании с обоими дрожжами.
Производство этанола в партии было относительно выше при совместном культивировании
L. vini с S. cerevisiae по сравнению с совместным культивированием с D. bruxellensis и
обоими дрожжами, что, скорее всего, связано с быстрым ростом S. cerevisiae по сравнению
с D. bruxellensis.
В данной работе бактерии рассматриваются либо как организмы-продуценты, либо как
организмы, взаимодействующие с другим организмом-продуцентом, а именно с дрожжами.
Целью использования бактерий в качестве продуцирующего организма была оптимизация
активности Rubisco путем введения дополнительных генных кассет Rubisco в цианобактерии.
Сначала оперон RBC пытались клонировать в плазмиде pDF-Trc, используя инфузионное
клонирование, но не получили трансформантов E. coli , содержащих оперон RBC, когда E. coli
Дальнейшая характеристика клонированного оперона не могла быть выполнена в ходе
этого проекта. Во второй части проекта исследовали толерантные к этанолу молочнокислые
бактерии Lactobacillus vini , уделяя особое внимание их взаимодействию с продуцирующими
этанол организмами, Saccharomyces cerevisiae и Dekkera bruxellensis. Более низкие
концентрации этанола не оказывали существенного влияния на рост L. vini. Однако при
более высокой концентрации этанола наблюдалось постоянное снижение количества
клеток L. vini .
Machine Translated by Google

---

Machine Translated by Google

---

Содержание
2.1. Материалы (как прод. Организм)
11
12
2.3.1. Штаммы
2.3.2. СМИ 2.3.3.
Условия культуры
19
19
19
19
20
21
2.4. Методы (как взаимодействующий Организм)
2. Материалы и методы
2.4.1. Прекультура 2.4.2.
Ответ Л.вини 2.4.3. Совместная
культура 2.4.4. аналитические
методы
17
1. Введение 1.1.1.
Бактерии как организм-продуцент 1.1.2. Развитие
биотопливных ресурсов 1.1.3. Биотопливо из
фотосинтезирующих микроорганизмов 1.1.4. Биология цианобактерий
1.1.5. Рубиско 1.2. Бактерии как взаимодействующий организм 1.2.1.
Биотопливо: Производство этанола 1.2.2. Дрожжи для производства
этанола 1.2.3. Молочнокислые бактерии 1.2.4. Среда производства этанола
7
7
8
8
9
9
10
10
11
17
17
17
18
18
18
18
18
18
2.2. Методы (как прод. Организм)
2.2.1. Проверка плазмиды 2.2.2.
Разработка инфузионного праймера 2.2.3.
Трансформация 2.2.4. Жидкая культура 2.2.5.
Миниподготовка 2.2.6. Амплификация
оперона Рубиско 2.2.7. Гелевая очистка
продукта ПЦР 2.2.8. Рестрикционное расщепление
для линеаризации плазмиды 2.2.9. Инфузионное
клонирование 2.2.10. Обычное клонирование 2.2.11. ПЦР-
амплификация оперона RBC 2.2.12. Рестрикционное
расщепление плазмидной ДНК 2.2.13. Очистка продукта ПЦР и
расщепленной плазмиды 2.2.14. Тепловая инактивация
рестриктаз 2.2.15. Лигирование 2.2.16. Преобразование 2.2.17.
ПЦР колоний 2.3. Материалы (как взаимодействующий Организм)
3. Результаты
3.1. Бактерии как продуктивный организм 3.1.1.
Верификация плазмиды 3.1.2.
Линеаризация плазмиды 3.1.3. Очищенная
плазмида 3.1.4. ПЦР-амплификация
оперона RBC
13
13
13
13
14
14
14
14
15
15
15
15
15
16
16
16
16
16
17
Machine Translated by Google

---

4. Обсуждение
4.1. Бактерии как продуктивный организм
4.1.1 Необходимо выполнить работу
5. Благодарности
3.2.2.1. Совместное культивирование L.vini с S.cerevisiae
3.2.2.2. Совместное культивирование L.vini с D. bruxellensis
3.2.2.3. Совместное культивирование L. vini с S. cerevisiae и
22
23
24
25
26
26
28
28
29
6. Ссылки
Д. брюссельский
32
4.2. Бактерии как взаимодействующий организм
3.2.1. Влияние этанола на рост L. vini 3.2.2. Совместное
культивирование L. vini с S. cerevisiae и D. bruxellensis
21
4.2.1. Влияние этанола на рост L. vini 4.2.2.
Совместное культивирование L. vini с S. cerevisiae и D. bruxellensis
30
30
31
31
31
31
3.1.5. Очищенный оперон RBC 3.1.6.
Амплифицированный оперон RBC с использованием праймеров,
интегрированных в сайты рестрикции 3.1.7. Линеаризованная
плазмида и очищенный оперон RBC 3.1.8. Гель-очищенный оперон RBC и
линеаризованный вектор 3.1.9. ПЦР колоний 3.2. Результаты (Бактерии как
взаимодействующий организм)
32
30
Machine Translated by Google

---

1. Введение
По оценкам Международного энергетического агентства (МЭА), восемьдесят пять процентов
мировых запасов ископаемого топлива используются только для сжигания. Каждый день
Европейский Союз импортирует нефть на сумму около 1 миллиарда евро, чтобы покрыть часть
этого потребления. По оценкам Управления энергетической информации США (EIA), глобальное
потребление энергии увеличивается примерно со скоростью 1 ГВт в день.
Выбросы CO2 при сжигании ископаемого топлива также представляют серьезную угрозу для
глобальной устойчивости. Различные технологии, доступные в настоящее время для удаления
CO2, включают закачку в глубоководные и геологические пласты, физико-химические абсорбенты
и усиленную биологическую фиксацию. Адсорбирующие материалы, такие как LiOH, не
возобновляемы и требуют большого пространства для хранения.
Чтобы удовлетворить этот растущий спрос на энергию только за счет ядерных технологий, нам
необходимо строить по одной новой электростанции каждый день. Поэтому развитие производства
возобновляемого топлива очень важно в глобальном и локальном масштабе. Уже существуют
зрелые и крупномасштабные технологии производства возобновляемой электроэнергии, но самой
большой проблемой является устойчивое производство топлива (1).
Биомасса, преобразованная в транспортное топливо, является альтернативой обычному
ископаемому топливу. Эти возобновляемые виды топлива известны как биотопливо. Увеличение
производства биотоплива и использование его для транспорта может значительно снизить
зависимость от нефти. Создание значительных запасов биотоплива гарантировало бы безопасное
и процветающее будущее; а также сыграет важную роль в уменьшении глобального потепления
за счет уменьшения количества загрязняющих веществ, которые являются причиной кислотных
дождей и смога (2).
Другие абиотические процедуры основаны на закачке CO2 непосредственно в глубины океана,
старые угольные шахты, геологические пласты, соленые водоносные горизонты или нефтяные
скважины и минеральную карбонизацию CO2. Эти методы представляют собой большие проблемы
из-за потенциальной утечки CO2 и больших требований к пространству. Таким образом,
биологическая фиксация углерода является единственной технологией, которая является
экономически целесообразной и экологически устойчивой в долгосрочной перспективе. Фиксация
углерода не обеспечивает полного удаления CO2, а вместо этого опирается на цикл, в котором
углерод поглощается во время фотосинтеза, и дополнительный CO2 не образуется , что способствует
устойчивому производству энергии и использованию питательных веществ (3).
Зависимость от традиционных ископаемых видов топлива как единственного значимого источника
энергии для транспорта может создать риск упадка экономики, нарушения поставок топлива и
привлечения силы и вооруженных сил для защиты доступа к нефти.
В этой работе бактерии рассматриваются либо как организмы-продуценты, либо как организмы,
взаимодействующие с другим организмом-продуцентом, а именно с дрожжами. Как
производственный организм, цель состояла в том, чтобы генетически манипулировать
цианобактериями, чтобы повысить их способность фиксировать CO2 за счет оптимизации
активности Rubisco. Целью использования бактерий в качестве взаимодействующего организма
было изучение влияния L. vini на продукцию этанола, влияние условий культивирования и
повышения концентрации этанола на его рост, а также изучение влияния дрожжей на рост L. vini
в совместная культура.
7
1.1. Бактерии как производственный организм (генетическая манипуляция
цианобактериями)
Machine Translated by Google

---

Некоторые из потенциальных преимуществ, связанных с использованием биотоплива,
полученного из фотосинтезирующих микроорганизмов: они могут производиться круглый
год; поэтому их культуры превосходят по урожайности лучшие масличные культуры (8). Они
растут в жидких средах, но им требуется меньше воды, чем наземным культурам, и поэтому
они могут снизить нагрузку на источники пресной воды (9). Их можно выращивать на
непахотных землях и в солоноватой воде, и они могут не претерпевать изменений в
землепользовании и, таким образом, сводить к минимуму воздействие на окружающую
среду (10) без ущерба для производства продуктов питания, кормов и других продуктов растениеводства (11).
Экономически и технически осуществимый ресурс биотоплива должен стоить столько же
или меньше, чем нефтяное топливо, использовать минимальную площадь земли, улучшать
атмосферный воздух (фиксация углерода), а также требовать меньше воды (7). Поэтому с
развитием технологий и современными знаниями биотопливо третьего поколения,
специально извлекаемое из микроорганизмов, считается технически осуществимым и
может использоваться в качестве альтернативного источника энергии, минуя основные
проблемы, связанные с биотопливом предыдущих поколений (4).
1.1.2. Биотопливо из фотосинтезирующих микроорганизмов
Производство биомассы фотосинтезирующими организмами также может влиять на
биофиксацию отходов CO2 , когда речь идет о поддержании и улучшении качества воздуха (11).
1.1.1. Развитие ресурсов биотоплива
Определенные проблемы препятствуют развитию технологии биотоплива
фотосинтезирующих организмов, чтобы она стала коммерчески осуществимой и позволила
обеспечить его устойчивое производство и использование. К ним относятся, например,
выбор видов, которые должны уравновешивать потребность в производстве биотоплива и
извлечении других важных побочных продуктов (12), постоянное развитие технологии для
повышения эффективности фотосинтеза (13), разработка технологии испарения сокращение,
выращивание отдельных видов и потери диффузии CO2 (14).
В последнее время во всем мире наблюдается быстрый рост использования жидкого
топлива в транспортном секторе, что обусловлено политикой, направленной на достижение
энергетической безопасности и сокращение выбросов парниковых газов. Биотопливо
первого поколения в основном производилось из масличных и пищевых культур, включая
рапсовое масло, сахарную свеклу, сахарный тростник, кукурузу, животные жиры и
растительное масло, с использованием традиционной технологии. Прогнозируется, что
производство и потребление биотоплива будет продолжать расти, но его роль в
удовлетворении энергетических потребностей в транспортном секторе останется
ограниченной из-за конкуренции с производством продуктов питания и волокна для
пахотных земель, высоких потребностей в воде и удобрениях, отсутствия колодцев.
управляемые методы ведения сельского хозяйства и требование сохранения
биоразнообразия (4). Были разногласия, связанные с использованием биотоплива первого
поколения, в основном из-за его влияния на мировой продовольственный рынок и
продовольственную безопасность, что вызвало серьезные вопросы относительно его
потенциала в качестве заменителя ископаемого топлива и его устойчивого производства
(5). Начало производства биотоплива второго поколения направлено на производство
топлива из цельного растительного материала специальных энергетических культур или
отходов лесозаготовок, сельскохозяйственных отходов или отходов деревообработки, а не
из пищевых культур (5). Однако технология преобразования этих культур в биотопливо не была разработана в масштабах коммерческого использования (7).
8
Machine Translated by Google

---

Преобразование фотосинтетической энергии у цианобактерий связано с действием
двух разных фотосистем: фотосистемы I и фотосистемы II. Эти две системы связаны
в ряд и взаимодействуют через цепь переноса электронов.
Он постепенно изменил раннюю восстановительную атмосферу на окислительную,
что способствовало развитию аэробного образа жизни в мире. Кислородный
фотосинтез, развившийся у цианобактерий и, по-видимому, унаследованный
зелеными растениями, является наиболее важным процессом захвата световой
энергии солнца на Земле (15). Химическая энергия и восстановитель, образующиеся
в световых реакциях, используются для связывания СО2 . Фотосинтез является
основным фактором циклического преобразования кислорода и углерода и
поддержания очень важного газового состава атмосферы (15).
Рубиско — один из самых распространенных белков в природе; этот фермент
катализирует первую стадию цикла Кальвина, который превращает атмосферный
CO2 в органические соединения, такие как глюкоза, в процессе фотосинтеза.
Рубиско считается особенно неэффективным из-за его способности катализировать
как карбоксилирование, так и оксигенацию RuBP. Карбоксилирование RuBP дает
две молекулы фосфоглицерата, которые вступают в цикл Кальвина, в конечном
итоге образуя крахмал и сахарозу и регенерируя RuBP. Оксигенация рибулозо-1,5-
бисфосфата дает по одной молекуле фосфоглицерата и фосфогликолята (16).
В основном клеточная организация цианобактерий характеризуется наличием
массивных внутриклеточных мембран, тилакоидов, которые составляют
фотосинтетический аппарат и удерживают фотосинтетические пигменты.
Цитоплазма содержит различного рода зернистые включения с разнообразными
функциями и составом цитоплазмы. Планктонные формы цианобактерий содержат
в своих клетках газовые вакуоли, которые обеспечивают плавучесть клеток и
позволяют цианобактериям занимать определенное положение в водоеме (15).
Фикобилипротеины (аллофикоцианин, фикоцианин и фикоэритрин), которые
являются основными светособирающими пигментами и вносят вклад в окраску
цианобактерий, организованы в виде комплексов, называемых фикобилисомами,
и прикреплены к мембранам тилакоидов регулярными рядами. Энергия возбуждения
передается через фикобилипротеины к хлорофиллу а в реакционных центрах (15).
1.1.3. Биология цианобактерий
Реакция Рубиско с кислородом конкурирует с реакцией карбоксилирования, в
которой фиксируется углекислый газ, и поддерживает путь, называемый
фотодыханием. Фотодыхание приводит к потере до 25% углерода, связанного
реакцией карбоксилирования. Ожидается, что в будущем убытки возрастут из-за
Ассимиляция СО2 (фотоавтотрофия) на свету является основным и важным способом
метаболизма у цианобактерий. Основным путем усвоения углерода является цикл
Кальвина, в котором участвуют два наиболее важных фермента фосфорибулокиназа
и рубиско (рибулоза-1,5-бисфосфаткарбоксилаза/оксигеназа) (15).
9
Цианобактерии, также называемые сине-зелеными бактериями, являются грамотрицательными
фотосинтетическими прокариотами и являются одним из самых древних организмов,
существующих на Земле; они, по-видимому, являются первым организмом, способным к
оксигенному фотосинтезу, используя воду в качестве источника электронов для образования
восстановителя при фотосинтезе. Попутный выброс кислорода был одним из важнейших событий в истории планеты.
1.1.4. Рубиско
Machine Translated by Google

---

В США почти весь топливный этанол производится путем ферментации кукурузного крахмала, а в
Бразилии — сахарозы сахарного тростника. В настоящее время разработана технология
производства этанола из непищевых источников, так что крупномасштабное производство этанола
из таких источников станет реальностью через несколько лет (23).
В 1970-е годы мировые топливные кризисы заставили многие страны осознать свою
восприимчивость к перехвату и нехватке нефти. Большое внимание было сосредоточено на
альтернативных источниках топлива с особым упором на этанол. В последнее время экономика
производства этанола стала более осуществимой, и теперь он может конкурировать со стандартным
дизельным топливом. Одним из важных факторов, делающих этанол более привлекательным в
качестве топлива, является то, что это возобновляемый ресурс (20).
10
Недавно было показано, что шаперон RbcX способствует сборке субъединиц RbcL из ряда видов
цианобактерий. Это белок массой 15 тыс. Да, и он действует как гомодимер в форме дуги, который
связывает карбоксиконцевую последовательность (EIKFEFD) RbcL в центральной гидрофобной
щели (18).
Агентство по охране окружающей среды (EPA) в Соединенных Штатах сделало обязательным
использование кислородосодержащего топлива в определенных районах, чтобы соответствовать
стандартам качества воздуха для угарного газа (21).
Цианобактерии отвечают за почти 70% ассимиляции CO2 в водной среде. Цель проекта состояла
в том, чтобы оптимизировать активность Rubisco путем введения дополнительных генных кассет
Rubisco в цианобактерии, чтобы увеличить их способность фиксировать CO2 и увеличить выход
конечного продукта, т.е. углевода. Ранее было показано, что активность Rubisco была увеличена
до 45% при введении дополнительной кассеты генов RbcL и RbcS в сконструированную
цианобактерию Synechococcus elongatus (19). Мы намеревались еще больше повысить активность
Rubisco, введя дополнительную кассету гена RbcX вместе с RbcL и RbcS в цианобактерии.
Преобразование биомассы в биотопливо является областью очень интенсивных исследований с
1970-х годов. Из-за опасений по поводу глобальной энергетической безопасности, изменения
климата и поставок нефти эта работа приобрела значительный научный и политический импульс.
Прогнозируется, что в следующие два десятилетия глобальное потребление энергии увеличится
почти в два раза, а производство биотоплива может стать углеродно-нейтральным и устойчивым
источником энергии (22).
1.2.1. Биотопливо: производство этанола
повышение температуры из-за глобального потепления, что, вероятно, способствует оксигенации,
а не карбоксилированию. Каталитическая скорость Rubisco очень низкая, поскольку он фиксирует
только от трех до десяти молекул углекислого газа в секунду на молекулу фермента. Было
предпринято много попыток повысить эффективность Rubisco с помощью генетических
манипуляций, но они потерпели неудачу. Одна из проблем заключается в том, что Rubisco
цианобактерий и растений представляет собой большой олигомер, состоящий из восьми больших
(RbcL, 50 кДа) каталитических субъединиц, связанных с восемью небольшими (RbcS, 15 кДа)
структурными
субъединицами. При изоляции большие субъединицы образуют друг с другом нерастворимые и
нефункциональные агрегаты. Вот почему Rubisco никогда не удается успешно преобразовать в
активный фермент in vitro из его развернутых субъединиц (17).
1.2. Бактерии как взаимодействующий организм (ЛАБ в производстве этанола)
взаимодействие с дрожжами)
Machine Translated by Google

---

Производство промышленно важных соединений с использованием микробных систем
значительно увеличилось за последнее десятилетие благодаря геномной революции.
Дальнейшие исследования и достижения в области регуляции генов, синтетической биологии,
белковой инженерии, метаболической инженерии и переносимости путей будут
способствовать разработке экономичных систем для производства биотоплива (22).
1.2.3. Молочнокислые бактерии (Lactobacillus vini)
1.2.2. Дрожжи для производства этанола
Молочнокислые бактерии (МКБ) часто используются в различных процессах ферментации в
промышленных масштабах. Это грамположительные кокки, кислотоустойчивые, с низким
содержанием GC и не дышащие. МКБ связаны общими физиологическими и метаболическими
характеристиками. Их можно найти в продуктах, содержащих молочную кислоту, и в
разлагающихся растениях, производящих молочную кислоту как основной метаболический
продукт ферментации углеводов. Их особая характеристика, проявляющая высокую
устойчивость к низкому диапазону pH, отличает их от других видов бактерий (31).
Дрожжи были наиболее часто используемыми микроорганизмами на протяжении всей
истории для производства этанола. S. cerevisiae может производить этанол до концентрации
18% ферментационного бульона, и это предпочтительные микроорганизмы для большинства
ферментаций этилового спирта. Его можно выращивать на простых сахарах, а также на
дисахариде сахарозе. Он признан безопасным и используется в качестве пищевых добавок в
пищу человека, поэтому также пригоден для производства хлеба и алкогольных напитков.
Он использует путь Эмбдена-Дудорова (ЭД) для метаболизма глюкозы (23).
Дрожжи, которые могут накапливать этанол даже в присутствии кислорода, например,
Schizosaccharomyces pombe и Saccharomyces cerevisiae , известны как Crabtree-положительные
дрожжи, тогда как другие, известные как Crabtree-отрицательные дрожжи, разлагают сахар
до углекислого газа в аэробных условиях (24). Этот эффект Crabtree у Saccharomyces
обеспечивает основу для стратегии «производить, накапливать-потреблять» (25). Это помогает
сахаромицетам конкурировать с другими микроорганизмами в естественной среде обитания
(26).
МКБ следуют двум схемам ферментации, т.е. гомоферментации и гетероферментации. При
избытке глюкозы при ограниченном доступе кислорода
В ряде обзоров и отчетов показана способность микроорганизмов производить этанол путем
ферментации, и сообщалось, что некоторые микроорганизмы, такие как дрожжи, бактерии и
грибы, используются для производства этанола (23).
11
Dekkera bruxellensis, который отделился от линии Saccharomyces более 200 млн лет назад,
также является положительным по Крэбтри и факультативным анаэробом (26), его часто
выделяют на винодельнях и называют винными дрожжами (27). На заводе по производству
этанола с рециркуляцией дрожжевых клеток было показано, что D. bruxellensis является
продуктивным организмом (28), производящим этанол, альдегиды и другие побочные
продукты (29). Он превзошел исходный инокулянт штамм S. cerevisiae , не влияя на
продуктивность или выход этанола. Аналогичным образом, его присутствие также было
зарегистрировано в промышленных процессах по производству биоэтанола в Бразилии,
которые работают непрерывно с рециркуляцией клеток, как на шведском заводе по производству этанола (30).
Machine Translated by Google

---

12
Виды Lactobacillus адаптированы к пищевым и алкогольным условиям процесса ферментации
этанола. Это может создать проблему флокуляции дрожжей во время спиртового брожения.
Молочная кислота, вырабатываемая лактобациллами , ингибирует метаболизм дрожжей и
снижает выход этанола (34).
Lactobacillus vini представляют собой грамположительные, подвижные и не образующие спор
бактерии палочковидной формы. Они встречаются в виде одиночных клеток, парами и в виде
коротких цепочек (35). Они физиологически универсальны, обладают способностью сбраживать
пентозы и гексозы до молочной кислоты, имеют факультативный анаэробный
гомоферментативный метаболизм и могут расти при температуре от 25° C до 45° C (36). Dekkera
bruxellensis и Lactobacillus vini могут стать потенциальным стабильным консорциумом для
промышленного производства биоэтанола (28).
гомоферментативные LAB превращают одну молекулу глюкозы в две молекулы пирувата,
используя путь Эмбдена Мейергофа (EMP). Гетероферментативные МКБ, использующие
пентозофосфатный путь, дегидрируют одну молекулу глюкозо-6-фосфата в 6-фосфоглюконат и
затем декарбоксилируют ее до одной молекулы диоксида углерода, восстанавливая пентозо-5-
1.2.4. Среда производства этанола
фосфата до одной молекулы глицеральдегидфосфата (ГАФ) и одной молекулы ацетилфосфата.
Фосфат глицеральдегида далее расщепляется до лактата, а ацетилфосфат восстанавливается до
этанола с образованием ацетил-КоА и ацетальдегида в качестве промежуточных продуктов (32).
Обычно, когда концентрация этанола в ферментере увеличивается, у большинства
микроорганизмов происходит повреждение мембраны, и реакция на этаноловый стресс связана
с типом липидов клеточной мембраны (37). Было показано, что рН не оказывает существенного
влияния на этаноловое брожение, в то время как концентрация субстрата и температура
оказывают значительное влияние на этаноловое брожение, а способность к брожению
значительно снижается при более высоких температурах (38). Кроме того, некоторые метаболиты,
такие как уксусная кислота, ацетальдегид и жирные кислоты со средней длиной цепи, также
могут оказывать негативное воздействие на S. cerevisiae, которые являются основными
дрожжами в спиртовом брожении (39). Процесс ферментации этанола обеспечивает экосистему,
в которой дрожжи могут создавать взаимодействия дрожжей-дрожжей и дрожжей-бактерий.
Различными видами взаимодействия между микроорганизмами являются комменсализм,
нейтрализм, синергизм, антагонизм, паразитизм или хищничество и конкуренция. При
этанольном брожении дрожжи могут влиять на рост других дрожжей или бактерий с помощью
ряда механизмов. Ранний рост дрожжей может уменьшить содержание питательных веществ,
что сделает их менее благоприятными для роста других микроорганизмов, а также может
производить ряд метаболитов, которые могут быть токсичными для других видов. Производство
двуокиси углерода может устранять или уменьшать содержание кислорода и, таким образом,
ограничивать рост аэробных видов. Некоторые виды могут производить ингибирующие белки,
ферменты или пептиды, которые могут уничтожать другие виды, разрушая их клеточную стенку.
Однако существуют также многочисленные механизмы, которые могут положительно влиять,
например, на рост других микроорганизмов; дрожжи производят биомассу и умирают во время
ферментации, высвобождая витамины и аминокислоты, которые могут быть полезны для роста
других видов позже в процессе (40).
Ученый предположил, что Lactobacillus обладают свойствами положительно влиять на процессы
ферментации промышленного этанола (33). Было замечено, что pH процесса ферментации
снижается при добавлении молочнокислых бактерий в ферментер, содержащий отдельные
виды дрожжей. Некоторые из
Machine Translated by Google

---

сайт рестрикции
5`-AGGTCGACTCTAGAGTTAGTAACGGCCTTGG-3`
Штаммы: цианобактерии Synechocystis штамм PCC 6803, Escherichia coli
В качестве отрицательных контролей использовали праймеры 537 F и 1177 R.
5`-GGGGGGGAATTCATGGTACAAGCCAAAGCA-3`
Компетентные клетки TOPO 10 (Invitrogen), плазмидный вектор pDF-Trc, спектомицин, чашки
с 1,5% агара LB: 1,0% триптон (Invitrogen), 0,5% дрожжевые экстракты (Invitrogen), 1,5% агар
(Invitrogen), 1,0% NaCl.
Форвард Праймер
Вливание вперед 5`-GGAAACAGACCATGGTACAAGCCAAAGCA-3`
В данной работе мы изучаем влияние условий культивирования на рост L.vini. Среду YPD с
различной концентрацией этанола использовали для изучения влияния этанола на рост L.vini.
Кроме того, L.vini культивировали совместно с дрожжами S.cerevisiae и D.bruxellensis для
изучения специфического взаимодействия бактерий с обоими дрожжами, влияния этих двух
дрожжей на рост L.vini и на общее производство этанола.
сайт рестрикции
Таблица 1: показывает праймеры и их последовательности, использованные в этом эксперименте.
5`-GGTTCCGGCAATGATTCTGCAGGGGGGG-3`
Настой обратный
13
Грунтовка
Последовательность
На заводе по производству этанола было замечено, что D. bruxellensis не является
загрязнителем при ферментации этанола, а вместо этого является производственным
организмом и не нарушает производственный процесс. Также было замечено, что L. vini
образует стабильный консорциум с D. bruxellensis , и его функция может заключаться в
стабилизации популяции и производства этанола в ферментере (28).
Обратный грунт
с Pst1
с EcoR1
Праймеры:
2.2.1. Проверка плазмиды pDF-Trc с помощью рестрикционных ферментов
Реакционную смесь готовили с использованием 1 мкл 1242,13 нг/мкл плазмидной ДНК, по 2
мкл 20 ед/мкл рестриктаз BsrG1 и Sac1.
2.1. Материалы
2.2. Методы
2. Материал и методы (Бактерии как продуктивный и
взаимодействующий организм)
Таблица 1: Праймеры, использованные в этом эксперименте.
Machine Translated by Google

---

(Invitrogen), 3 мкл 10X NEB Buffer 4, 3 мкл 10X BSA и общий объем доводили до 30 мкл 19 мкл
дистиллированной воды. Реакцию инкубировали в течение пяти часов при 37°С.
Компетентные клетки TOPO 10 трансформировали им в соответствии с протоколом химической
трансформации: к компетентным клеткам E. coli добавляли 2 мкл плазмиды , клетки помещали на лед на
30 минут, а затем подвергали тепловому шоку при 42oC в течение 30 секунд. Клетки снова немедленно
помещали на лед и добавляли к ним 250 мкл среды LB, и, наконец, клетки встряхивали в течение одного
часа при 250 об/мин и 37 oC. 150 мкл раствора для трансформации высевали на чашки с агаром LB,
содержащим 30 мкг/мл антибиотиков (спектомицин), и инкубировали в течение ночи при 37 oC (41).
2.2.2. Разработка инфузионного праймера с использованием мастерской CLC
2.2.5. Miniprep (на основе процедуры Qiagen Miniprep) с использованием изопропанола
2.2.4. Жидкая культура
4 мл клеточной культуры из ночной культуры центрифугировали на максимальной скорости в
настольной центрифуге и ресуспендировали в 300 мкл раствора P1 (Qiagen) с добавлением РНКазы плюс
лизоцим (10 мг/мл). Затем добавляли по 300 мкл каждого Р2 и Р3 и перемешивали, каждый раз
переворачивая пробирки. Затем пробирки центрифугировали в течение 30 минут на максимальной
скорости в настольной центрифуге и 800 мкл супернатанта переносили в новые пробирки. К нему
добавляли 600 мкл изопропанола, перемешивали переворачиванием и смесь центрифугировали в
течение 15 минут при максимальной скорости в настольной центрифуге. Супернатант сливали,
добавляли 1 мл 70% этанола и центрифугировали пробирки в течение 5 минут на максимальной
скорости в настольной центрифуге. Супернатант сливали и пробирки центрифугировали еще две минуты
для удаления остаточного супернатанта. Осадок оставляли сушиться на воздухе в течение 10 минут.
Наконец, осадок ресуспендировали в 30 мкл элюирующего буфера (Qiagen).
Прямой праймер был сконструирован таким образом, что его 5'-конец содержал последовательность из
11 пар оснований непосредственно перед сайтом рестрикции EcoR1 вектора, а 3'-конец содержал
последовательность из 18 пар оснований оперона Rbc, включая стартовый кодон.
14
5 мл среды LB в культуральной пробирке, содержащей 30 мкг/мл спектомицина, инокулировали
колониями E. coli из чашек с антибиотиками и инкубировали в течение ночи при 37 oC при встряхивании
со скоростью 250 об/мин.
2.2.3. Трансформация
Точно так же обратный праймер был сконструирован таким же образом, за исключением того, что 5'-
конец содержит последовательность из 15 пар оснований сразу после сайта рестрикции BamH1 вектора,
а его 3'-конец содержит 16 оснований, комплементарных оперону Rbc, включая стоп-кодон. Все праймеры
были приобретены у Integrated DNA Technologies (IDT), Левен, Бельгия.
pDF-Trc представляет собой низкокопийную плазмиду. Для получения запаса плазмиды кишечной палочки
Machine Translated by Google

---

Продукт ПЦР подвергали гель-очистке с использованием набора Qiagen Gel Purification Kit в
соответствии с процедурой, описанной в руководстве, прилагаемом к набору. Для подтверждения
размера фрагмента 5 мкл раствора ДНК анализировали методом гель-электрофореза.
2.2.10. Обычное клонирование
2.2.8. Рестрикционное переваривание для линеаризации плазмиды
2.2.6. Усиление оперона Рубиско
Для обычного клонирования новые праймеры были сконструированы таким образом, что сайты
рестрикции EcoR1 и Pst1 были введены в прямой и обратный праймеры соответственно с выступающим
GGGGGG в обоих праймерах. Прямой праймер был сконструирован таким образом, что он имел
короткую специфическую для гена последовательность из 16 п.н., включая стартовый кодон, тогда как
обратный праймер имел участок из 16 п.н., специфичный для гена в обратном направлении.
Плазмидную ДНК линеаризовали с использованием рестрикционных ферментов BamH1 и EcoR1
(Invitrogen) для использования в инфузионном клонировании. Реакцию переваривания ставили для
плазмидных минипрепаратов с изопропанолом. Реакцию устанавливали следующим образом: 5 мкл
плазмиды, 1 мкл BamH1 (20 единиц/мкл), 1 мкл EcoR1 (20 единиц/мкл), 3 мкл буфера NEB2, 3 мкл BSA
(10X) и окончательный объем доводили до 30 мкл дистиллированной водой и реакционную смесь
инкубировали при 37 oC в течение 5 часов. Продукты анализировали с помощью гель-электрофореза,
чтобы подтвердить линеаризацию плазмиды.
Оперон Rubisco был амплифицирован с помощью ПЦР для использования в инфузионном
клонировании. ПЦР готовили следующим образом: 5 мкл 5 мкМ прямого праймера для инфузии, 5 мкл
5 мкМ обратного праймера для инфузии, 5 мкл 10 мкМ dNTP, 10 мкл буфера X5, реакцию проводили
для 5 реакций, каждая с различным объемом матрицы, т.е. мкл, 2 мкл, 3 мкл и 4 мкл и один
положительный контроль с разными прямыми и обратными праймерами, отличными от инфузионных,
0,5 мкл phusion полимеразы (Clontech) и общий объем доводили до 50 мкл 23,5 мкл дистиллированной
воды. ПЦР была запрограммирована на 95 °C в течение 2 минут, 30 циклов 95 °C в течение 30 секунд,
56 °C в течение 30 секунд и 7 °C в течение трех минут. Окончательное удлинение проводили при 72 oC
в течение 10 минут.
15
2.2.9. Инфузионное клонирование
2.2.7. Гелевая очистка продукта ПЦР
Очищенную ПЦР-вставку и линеаризованный вектор смешивали вместе в молярном соотношении 2:1,
и реакцию инфузионного клонирования устанавливали следующим образом: 5X реакционный буфер
In-Fusion 2 мкл, фермент In-Fusion 1 мкл, вектор (50 нг/мкл) 3 мкл, вставка для ПЦР (36 нг/мкл) 4 мкл.
Также была установлена отрицательная реакция: 5 буферов для реакции In-Fusion 2 мкл, фермент In-
Fusion 1 мкл, вектор (50 нг/мкл) 3 мкл, и общий объем был доведен до 10 мкл с помощью 4 мкл
дистиллированной воды и реакции были смешанные. Их сначала инкубировали при 37 °С в течение
15 минут, затем инкубировали при 50 °С в течение 15 минут, а затем помещали на лед. Реакционные
объемы доводили до 50 мкл буфером ТЕ и хорошо перемешивали. 2,5 мкл этого 50-мкл раствора брали
для последующей трансформации E. coli , а затем к оставшимся 47,5 мкл раствора добавляли 50 мкл ТЕ-
буфера и общий объем доводили до 97,5 мкл, также 2,5 мкл этого раствора брали для трансформировать
кишечную палочку.
Machine Translated by Google

---

Pst1 (Инвитроген)
Амплифицированный продукт ПЦР и расщепленную плазмидную ДНК очищали от примесей и
фона с использованием набора для очистки ПЦР QIAquick и следуя протоколу, описанному в
руководстве, прилагаемом к набору.
2.2.12. Рестрикционное расщепление плазмидной ДНК
Плазмидную ДНК расщепляли рестрикционными ферментами EcoR1 и Pst1. Реакцию пищеварения
задавали так:
Были проведены две реакции лигирования; один с использованием термоинактивированной
расщепленной плазмидной ДНК, а другой без термоинактивированной расщепленной плазмидной
ДНК. С ПЦР-очищенным расщепленным продуктом ПЦР также устанавливалась отрицательная
реакция для каждой реакции лигирования. Реакцию лигирования устанавливали следующим
образом: 6 мкл продукта ПЦР, по 1 мкл термоинактивированной и неинактивированной нагреванием
плазмиды, 1 мкл (10X) буфера ДНК-лигазы Т4, 1 мкл ДНК-лигазы Т4, и общий объем доводили до 10
мкл с помощью 1 мкл дистиллированной воды, отрицательная реакция была такой же, за
исключением того, что в ней не было продукта ПЦР, и объем был доведен до 10 мкл добавлением 7 мкл
2.2.14. Тепловая инактивация ферментов рестрикции
10 мкл плазмидной ДНК
Для инактивации ферментов рестрикции образец инкубировали при 80 oC в течение 20 минут
во избежание дальнейшей деградации плазмидной ДНК.
Конечный объем доводили до 30 мкл добавлением 12 мкл дистиллированной воды;
реакцию выдерживали при 37 oC в течение 5 часов. Плазмидную ДНК экстрагировали с
использованием набора для гель-экстракции QIAquick в соответствии с протоколом, прилагаемым
к набору, и растворяли в геле.
2.2.11. ПЦР-амплификация оперона RBC
Оперон RBC амплифицировали методом ПЦР с использованием новых праймеров. ПЦР проводили
для 4 реакций и проводили, как описано ранее.
2.2.13. Очистка продукта ПЦР и расщепленной плазмидной ДНК
3 мкл NEB3
комплементарная последовательность. Жидкую культуру проводили так же, как и ранее, инокулируя
среду LB, содержащую (30 мкг/мл) спектомицина, с pDF-Trc, и инкубировали в течение ночи при 37
oC при встряхивании при 250 об/мин. Минипрепарат выполняли с использованием ночной жидкости
с помощью набора Qiagen с использованием изопропанола, и ДНК ресуспендировали в 50 мкл ТЕ +
РНКаза (20 мкг/мл).
3 мкл (10X) BSA
16
2.2.15. Лигирование
1 мкл каждых 20 единиц/мкл рестрикционных ферментов EcoR1 и
Machine Translated by Google

---

штамм L. vini .
2.2.17. Колония ПЦР
На чашке было 16 колоний, все колонии переносили в пробирку, добавляли 10 мкл воды
и нагревали в течение 1 мин, эту воду, инокулированную одной колонией, использовали
в качестве матрицы в ПЦР колоний. ПЦР проводили для каждой из 16 колоний отдельно.
ПЦР проводили и проводили, как описано ранее.
II. Агаровая среда YPD: Агаровую среду YPD готовили, взвешивая 20 г пептона
(OXOIDE); 20 г глюкозы (OXOIDE); 10 г дрожжевого экстракта (OXOIDE) и 10 г
агара. Конечный объем доводили до одного литра дистиллированной
водой и автоклавировали. III. Жидкая среда MRS: 52 грамма бульона MRS
(OXOIDE)
v. MM + 20 г/л пептона (OXIODE). ви. ММ со
всеми двадцатью аминокислотами в концентрации 100 мг/л. vii. ММ со
всеми аминокислотами кроме цистеина в концентрации 100 мг/л
взвешивали и добавляли к дистиллированной воде, доводили объем до
одного литра и автоклавировали.
Минеральная среда (MM): Минеральную среду готовили путем
взвешивания 10 г экстрактов дрожжей (OXOIDE), 10 г глюкозы
(OXOIDE) и 10 г соли, а конечный объем доводили до 1 литра
дистиллированной водой и автоклавировали.
я.
2.2.16. Трансформация
Компетентные клетки TOP 10 (химически) трансформировали растворами реакции
лигирования следующим образом: к компетентным клеткам добавляли 2,5 мкл 10 мкл
общих растворов лигирования. Клетки выдерживали на льду в течение 30 мин, а затем
подвергали тепловому шоку в течение 30 с при 42 oC, после теплового шока клетки
немедленно переносили на лед на несколько минут и в каждую пробирку добавляли по
250 мкл среды LB. Затем клетки выдерживали на шейкере в течение часа при 37 oC и 300
об/мин. 290 мкл каждой реакции наносили на чашки со спектромицином и инкубировали
в течение ночи при 37 oC (41).
Жидкая среда YPD: жидкую среду YPD готовили, взвешивая 20 г пептона
(OXOIDE); 20 г глюкозы (OXOIDE) и 10 г дрожжевого экстракта (OXOIDE).
Конечный объем доводили до одного литра дистиллированной водой и
автоклавировали.
2.3.2. Среда дрожжевой пептон-декстроза (YPD), жидкая среда MRS, агар MRS
дистиллированная вода. Смеси для лигирования инкубировали при комнатной температуре в
течение двух часов (42).
среда и минеральная среда (ММ).
каждого.
VIII. ММ с цистеином в концентрации 100 мг/л. икс. Этанольная
среда YPD: YPD с различными концентрациями этанола, т.е. 10 г/л, 50 г/л и 100 г/л.
17
IV.
2.3.1. Штаммы Штаммы дрожжей D. bruxellensis, S. cerevisiae и бактериальные
2.3. Материал
Machine Translated by Google

---

2.3.3. Условия культуры
2.4. Методы
L. vini, D. bruxellensis и S. cerevisiae. Второй триплет содержал L. vini и D. bruxellensis , а
третий триплет содержал L. vini и S. cerevisiae. Культуры инокулировали 1 мл прекультур
с исходной оптической плотностью 1 и рН 5. Образцы брали через разные промежутки
времени, т.е. 0 ч, 12 ч, 24 ч, 36 ч, 48 ч, 72 ч, 96 ч и 120 ч для подсчет жизнеспособности
с использованием разведений 10-4 и анализа ВЭЖХ.
Lactobacillus vini (L. vini): L. vini инокулировали в жидкую среду MRS и инкубировали
при 30 oC при непрерывном встряхивании в течение трех дней.
18
Совместное культивирование триплетов проводили путем инокуляции флаконов,
содержащих 200 мл среды MRS. Первые три флакона содержали все три микроорганизма, т.е.
2.4.3. Совместная культура
Дрожжи: S. cerevisiae и D. bruxellensis инокулировали в жидкую среду YPD и инкубировали
в течение трех дней при 30 oC при постоянном встряхивании.
2.4.1. Предварительная культура
ОП, подсчет жизнеспособности, анализ ВЭЖХ на содержание сахара, кислоты и
этанола выполнялись сотрудниками кафедры микробиологии СЛУ.
Триплетные культуры L. vini выращивали в периодической культуре путем инокуляции
флаконов, содержащих 100 мл среды YPD с тремя различными концентрациями этанола,
т.е. 10 г/л, 50 г/л и 100 г/л. рН доводили до 5 с помощью рН-метра, и культуру
инокулировали 1 мл прекультуры, имеющей начальную ОП 1. Образцы брали через
разные промежутки времени, т.е. 0 ч, 24 ч, 48 ч, 72 ч и 96 ч для определения
жизнеспособности. подсчет с использованием разведений 10-4, 10-5 и 10-6 и для
анализа ВЭЖХ.
2.4.4. аналитические методы
2.4.2. Ответ L. vini
Образцы культур D. bruxellensis и S. cerevisiae хранили во флаконах при ограниченной
аэрации при 30 oC, а образцы культур с клетками L. vini - в анаэробных условиях при
30 oC.
Machine Translated by Google

---

3. Результаты
Плазмиду pDF-Trc расщепляли рестрикционными ферментами BsrG1 и Sac1. Фрагменты разделяли
на 1,5% агарозном геле. pDF-Trc представляет собой плазмиду размером 9227 п.н., и размер
фрагмента, составляющий приблизительно 9000 п.н. (фиг . 1), указывает на то, что это pDF-Trc.
Есть несколько дополнительных фрагментов длиной примерно 5000 п.н., 1650 п.н. и 1000 п.н.,
что связано с тем, что pDF-Trc представляет собой суперскрученную плазмиду. Затем проверенную
плазмиду подвергали минипрепарации и линеаризовали для последующего процесса.
3.1.2. Линеаризация плазмиды
Плазмиду pDF-Trc линеаризовали с использованием рестрикционных ферментов BamH1 и EcoR1.
Присутствовали некоторые примеси и неожиданные фрагменты разной длины, и причиной этого
могла быть сверхспиральная природа плазмиды.
3.1.1. Плазмидная проверка
19
Плазмида была линеаризована, чтобы ее можно было использовать в качестве вектора для
инфузионного клонирования. Фрагменты разделяли на 1,5 % агарозном геле. Имеется фрагмент
длиной примерно 9 т.п.н., равный размеру pDF-Trc 9227 п.н., этот фрагмент был извлечен из геля
и очищен (рис . 2).
3.1. Бактерии как производственный организм
Рисунок 1: Проверка плазмиды pDF-Trc с рестрикционным расщеплением. В гель
наносили 1 т.п.о. плюс лестницу в 1- м месте и плазмиду pDF-Trc в лунки, обозначенные как 1 и 2.
Machine Translated by Google

---

Рисунок 2: Линеаризация плазмиды pDF-Trc. В гель загружали 1 т.п.о. плюс ладдер в 1- ю
лунку и плазмиду pDF-Trc в лунки, обозначенные как 1, 2 и 3. Желаемый фрагмент
соответствует отметке 9 т.п.н. на ладдере. Фрагменты соответствуют отметке 5 кб. 2,5 кб не
являются нужными фрагментами.
Рисунок 3: Гель очищенная плазмида. Гель загружали 1 т.п.о. плюс лейдер в 1- ю лунку и
очищенную от геля плазмиду в лунки, обозначенные как 3 и 4. Размер фрагмента
соответствует отметке 9 т.п.н. на ладдере.
На рис. 3 показана плазмида pDF-Trc после очистки плазмиды от геля.
Размер фрагментов соответствует отметке 9 т.п.н. на лестнице, указывающей, что это
желаемая плазмида pDF-Trc, так как размер этой плазмиды составляет 9227 п.н. Позже эту
очищенную плазмиду использовали для инфузионного клонирования.
20
3.1.3. Очищенная плазмида
Machine Translated by Google

---

3.1.4. ПЦР-амплификация оперона RBC
На рис. 5 показан продукт ПЦР, очищенный в геле. Оперон RBC имеет размер 2427 п.н.; результат
показывает, что очищенный продукт ПЦР представляет собой оперон RBC. Фрагмент
соответствует области между отметками 2 КБ и 3 КБ на лестнице и показывает, что это фрагмент
ожидаемой длины.
3.1.5. Очищенный оперон RBC
Примечание: этот очищенный оперон эритроцитов и очищенный вектор pDF-Trc (рис . 3)
использовали для трансформации компетентных клеток TOP 10 с использованием метода
инфузионного клонирования, трансформированные клетки распределяли на чашках с
антибиотиками и инкубировали в течение ночи при 37oC . На следующий день на чашках с
антибиотиками появились колонии. Для увеличения плотности клеток колонии из этих чашек
использовали для инокуляции среды LB в культуральные пробирки и инкубировали в течение
ночи при 37 oC с непрерывным встряхиванием при 250 об/мин, но на следующий день роста в
культуральных пробирках не наблюдалось. Эксперимент был повторен, но снова он не
увенчался успехом, поэтому мы решили использовать обычный метод клонирования, т.е.
лигирование и трансформацию, используя новые праймеры с интегрированными сайтами рестрикции.
21
На рис. 4 показан амплифицированный с помощью ПЦР оперон эритроцитов с использованием
инфузионных праймеров. Для ПЦР-амплификации использовали разные объемы матричной
ДНК, т.е. 1, 2, 3 и 4 мкл. Результат показывает наличие фрагментов разной длины, оперон RBC
имеет размер 2427 п.н. и длина одного фрагмента соответствует этому размеру. Присутствуют
фрагменты неожиданной длины размером примерно 1300 п.н. и меньше по неизвестной
причине.
Рисунок 4: ПЦР-амплифицированный оперон RBC. Гель загружали 1 т.п.о. плюс лестница в 1- м
Фрагмент, который соответствует отметке выше 2 кб и немного ниже отметки 3 кб на лестнице,
является фрагментом ожидаемой длины. Фрагмент, который соответствует отметке чуть выше 1 кб,
и другие фрагменты светлого цвета длиной менее 1 кб являются неожиданными фрагментами.
ну, отрицательный контроль во 2- й лунке. Продукты ПЦР с различными объемами матричной
ДНК, т.е. 1 мкл, 2 мкл, 3 мкл и 4 мкл, загружали в 3- ю, 4-ю, 5 -ю и 6-ю лунки соответственно.
Machine Translated by Google

---

Рисунок 5: Извлеченный из геля и очищенный оперон RBC. В гель загружали 1 т.п.о.
плюс лэддер в 1- ю лунку и очищенный продукт ПЦР во 2- ю лунку. Фрагмент длиной
приблизительно 2400 п.н. является ожидаемым фрагментом.
На рис. 6 показан амплифицированный с помощью ПЦР оперон эритроцитов с использованием
праймеров, интегрированных в сайты рестрикции. Фрагменты разделяли на 1,5% агарозном
геле. Продукт ПЦР амплифицировали с использованием четырех наборов реакций, каждый с
разными объемами матричной ДНК, т.е. 1 мкл, 2 мкл, 3 мкл и 4 мкл. Результат показывает, что
длина фрагмента, амплифицированного с 1 мкл матричной ДНК, соответствует размеру оперона
RBC, в то время как с остальными продуктами амплификации мы не получили фрагментов
ожидаемой длины.
3.1.6. Амплифицированный оперон RBC с использованием интегрированных праймеров с сайтами рестрикции
22
Machine Translated by Google

---

Рисунок 6: ПЦР-амплифицированный оперон эритроцитов с использованием интегрированных
праймеров с сайтами рестрикции. В гель загружали 1 т.п.о. плюс лейдер в 1-ю лунку, отрицательный
контроль (NC) во 2- ю лунку. Продукты ПЦР, амплифицированные с использованием различных объемов
матричной ДНК, т.е. 1 мкл, 2 мкл, 3 мкл и 4 мкл, загружали в 3- ю, 4-ю, 5 -ю и 6-ю лунки соответственно.
Длина фрагмента, полученного с продуктом ПЦР в 3- й лунке, является ожидаемой и не дает ожидаемого
результата с остальными продуктами ПЦР.
23
3.1.7. Линеаризованная плазмида и очищенный оперон RBC
Линеаризованную плазмиду pDF-Trc и очищенный оперон RBC разделяли с помощью
гель-электрофореза (фиг . 7). Плазмиду линеаризовали с помощью рестрикционных
ферментов EcoR1 и Pst1 . Результат показывает, что, хотя были получены фрагменты
плазмидной ДНК и оперона RBC ожидаемой длины, все же имеется некоторый фон и
примеси, и продукты нуждаются в дальнейшей очистке.
Machine Translated by Google

---

Рисунок 7: Очищенный оперон RBC и линеаризованная плазмида pDF-Trc. Гель загружали
лестницей в 1- ю лунку и линеаризованной плазмидой во 2-ю , 3- ю, 4 -ю и 5 -ю лунку. Продукт
ПЦР загружали в 6- ю лунку.
3.1.8. Очищенный гель оперон RBC и линеаризованный вектор
На фигуре 8 показаны линеаризованная плазмида pDF-Trc и очищенный в геле оперон
RBC, разделенные с помощью гель-электрофореза. Были проведены две реакции
расщепления для линеаризации плазмиды pDF-Trc с помощью EcoR1 и Pst1. Одну из
реакций расщепления нагревали для инактивации фермента расщепления, а вторую
реакцию очищали с использованием набора для очистки. Результат показывает четкий
фрагмент ожидаемой длины, соответствующий отметке 9 т.п.н. на лестнице, с нагретой
реакцией расщепления. В то время как есть очень светлая и нечеткая полоса с очищенной
реакцией пищеварения. Результат также показывает ожидаемую длину фрагмента в
случае оперона RBC, очищенного гелем. Позже этот оперон, очищенный гелем, и
ожидаемый линеаризованный вектор с реакцией расщепления при нагревании
использовали в реакции лигирования и для трансформации E. coli.
24
Machine Translated by Google

---

лунку и гель-очищенный оперон эритроцитов в 5-й лунке. Фрагмент, полученный с нагретой расщепленной
плазмидой в 3- й лунке, который соответствует отметке 9 т.п.н. на лестнице, является фрагментом ожидаемой
длины, а также длина фрагмента с очищенным гелем опероном, который соответствует отметке чуть выше 2 т.п.н.
ожидаемый результат.
Рисунок 8: Линеаризованная плазмида и гель-очищенный оперон RBC. Гель загружали лестницей в 1-ю лунку,
термоинактивированной расщепленной плазмидой в 3-ю лунку, очищенной расщепленной плазмидой в 4- ю лунку.
На чашке было шестнадцать колоний (трансформированные клетки), все колонии
переносили в пробирку, добавляли 10 мкл воды и пробирку нагревали в течение 1 минуты,
этот инокулянт использовали в качестве матрицы в ПЦР колоний.
25
3.1.9. Колония ПЦР
Продукты ПЦР колоний разделяли на геле для электрофореза (Фигура 9). Результат
показывает, что амплифицированный продукт представляет собой оперон RBC. Длина
фрагментов составляет примерно 2400 т.п.н., что соответствует размеру оперона
эритроцитов (2427 т.п.н.) и, следовательно, указывает на успешное клонирование.
Machine Translated by Google

---

Рисунок 9: На рисунке выше показаны продукты ПЦР колоний ПЦР. Гель загружали 1
т.п.н. плюс лейдер в первую лунку и продукты ПЦР колоний ПЦР с каждой из шестнадцати
колоний в следующие шестнадцать лунок, размер фрагмента указывал на то, что это
оперон RBC.
3.2. Результаты (Бактерии как взаимодействующий организм)
Влияние этанола на рост L. vini оценивали в периодической культуре с
использованием среды YPD с различными концентрациями этанола.
Использовали три разные концентрации этанола, т.е. 10 г/л, 50 г/л и 100 г/л с
начальным рН, доведенным до 5.
26
3.2.1. Влияние этанола на рост L.vini
Концентрация этанола 10 г/л не оказала существенного влияния на рост L. vini
(рис . 10). Количество клеток увеличивалось, как только культуру инокулировали
с начальным количеством клеток от 3× 107 до более чем 7×107 в конце
эксперимента. Потребление глюкозы и производство лактата также указывают
на то, что L. vini присутствует в культуре, потребляя глюкозу и производя лактат.
Machine Translated by Google

---

Рисунок 10: Влияние 10 г/л этанола на рост L. vini. Количество жизнеспособных клеток показано в
виде треугольников в разные моменты времени. Ромбами и прямоугольниками показано
потребление глюкозы и производство лактата соответственно в граммах на литр [г/л], а время указано в часах [ч].
Рисунок 11: Влияние 50 г/л этанола на рост L. vini. Количество жизнеспособных клеток показано в
виде треугольников в разные моменты времени. Ромбами показано потребление глюкозы, а
прямоугольниками — производство лактата в граммах на литр [г/л]. Время отображается в часах [ч].
Концентрация этанола 50 г/л по сравнению с концентрацией этанола 10 г/л оказала
незначительное негативное влияние на рост L. vini (рис . 11). Количество клеток
увеличивалось со временем, как только культуру инокулировали L. vini с исходным
числом клеток от 3х107 до более 7х107 в конце эксперимента, что было таким же, как
и в случае с концентрацией 10 г/л, но потребление глюкозы и производство лактата
были относительно низкими по сравнению с 10 г/л этанола.
Концентрация этанола 100 г/л оказала значительное влияние на рост L. vini по
сравнению с концентрациями этанола 10 г/л и 50 г/л (рис . 12).
27
Количество жизнеспособных клеток постоянно уменьшалось в разные моменты
времени и, наконец, снизилось ниже уровня обнаружения через 100 часов. Это
сопровождалось снижением потребления глюкозы и продукции лактата.
Machine Translated by Google

---

Рисунок 12: Влияние 100 г/л этанола на рост L. vini в периодической культуре. Номера
жизнеспособных клеток показаны треугольниками; потребление глюкозы и производство лактата
показаны ромбами и прямоугольниками соответственно в граммах на литр [г/л]. Время указано в часах [ч].
3.2.2.1. Совместное культивирование L. vini с S. cerevisiae
3.2.2. Совместное культивирование L. vini с S. cerevisiae и D. bruxellensis
28
L. vini совместно культивировали с S. cerevisiae и D. bruxellensis по отдельности и с обоими в
другом эксперименте, чтобы оценить влияние этих микроорганизмов на рост друг друга,
поскольку они активно конкурируют за источник энергии и производят разные метаболиты.
Результат (рис. 13) показывает, что количество обоих микроорганизмов непрерывно росло
до тех пор, пока была доступна глюкоза, но переходило в стационарную фазу, как только
глюкоза истощалась, что сопровождалось остановкой производства этанола и лактата.
Количество клеток L. vini и S. cerevisiae , наконец, достигло 7×107 и 4,5 ×107 соответственно
перед стационарной фазой. Концентрация этанола достигла концентрации 6 г/л до остановки
его производства. Вначале наблюдалось небольшое увеличение продукции лактата, но затем
оно начало снижаться ниже уровня обнаружения. Были также некоторые другие определенные
метаболиты, такие как глицерин и ацетат в концентрации ниже уровня обнаружения.
Machine Translated by Google

---

Рисунок 13: Совместное культивирование L. vini и S. cerevisiae , продуцирующих различные
метаболиты. Числа жизнеспособных клеток L. vini и S. cerevisiae показаны точками вверху и
второй сверху соответственно. Концентрация этанола и концентрация лактата в граммах на литр
показаны крестиками и двойными крестиками соответственно. Время эксперимента указано в
часах [ч].
Рисунок 14: Совместное культивирование L. vini и D. bruxellensis. Числа жизнеспособных клеток
L. vini и D. bruxellensis показаны точками вверху и второй сверху соответственно. Концентрация
этанола и концентрация лактата в граммах на литр показаны крестиками и двойными крестиками
соответственно. Время эксперимента указано в часах [ч].
3.2.2.2. Совместное культивирование L.vini с D.bruxellensis
Результат (рис. 14) показывает, что количество обоих микроорганизмов
постоянно увеличивалось, пока глюкоза была доступна для потребления, но
оба организма прекращали рост численности и переходили в стационарную
фазу, как только глюкоза истощалась. Это также сопровождалось остановкой
производства метаболитов, включая лактат и этанол. Количество клеток L. vini
и D. bruxellensis достигло конечного значения 7×107 и 5×107 соответственно
перед стационарной фазой. Концентрация этанола достигла концентрации 5 г/
л до остановки его производства. Вначале наблюдалось незначительное
увеличение продукции лактата, но затем его продукция прекратилась, не было
увеличения или уменьшения концентрации лактата, и была достигнута
конечная концентрация примерно 2,5 г/л. Были также некоторые другие
определенные метаболиты глицерин и ацетат в концентрации ниже уровня обнаружения.
29
Machine Translated by Google

---

Возможными причинами неудачи инфузионного клонирования может быть концентрация
используемой плазмиды (50 нг/мкл), которая была меньше рекомендованной концентрации,
т.е. 100 нг/мкл. pDF-Trc представляет собой плазмиду с низким числом копий, и это также
может способствовать или привести к неудаче, поскольку клонирование методом слияния
30
Результат (рис. 15) показывает, что L. vini в этом случае рос относительно медленно по
сравнению с тем, когда его культивировали совместно с D. bruxellensis и S. cerevisiae.
Целью этого проекта была оптимизация активности Rubisco путем введения дополнительных
генных кассет Rubisco в цианобактерии. Мы намеревались увеличить способность
цианобактерий фиксировать CO2 и увеличить выход конечного продукта, т. е. углеводов.
отдельно, на что указывает подсчет жизнеспособности, который в данном случае составляет
примерно 5,4x107 по сравнению с 7x107 в более ранних случаях. S. cerevisiae и D. bruxellensis
также росли, пока присутствовала глюкоза, и входили в стационарную фазу, когда глюкоза
истощалась. Количество клеток обоих видов дрожжей, т.е.
Сначала мы попытались трансформировать E. coli векторной конструкцией pDF-Trc
методом клонирования слиянием, но нам это не удалось. Затем мы использовали обычный
метод клонирования, т.е. лигирование и трансформацию E. coli с реакцией лигирования, и
нам удалось успешно трансформировать E. coli опероном RBC, как показано на рисунке 9.
S. cerevisiae и D. bruxellensis достигли финальных размеров 3,5x107 и 2,8x107 соответственно.
Этанол был произведен до конечной концентрации 5 г/л, а лактат был получен до конечной
концентрации примерно 2 г/л.
3.2.2.3. Совместное культивирование L.vini с S.cerevisiae и D.bruxellensis
4.1. Бактерии как продуктивный организм
Рисунок 15: Совместное культивирование L. vini с D. bruxellensis и S. cerevisiae. Числа
жизнеспособных клеток L. vini, S. cerevisiae и D. bruxellensis показаны точками вверху, второй
сверху и третьей сверху соответственно. Концентрация этанола и концентрация лактата в
граммах на литр [г/л] показаны крестиками и двойными крестиками соответственно. Время
эксперимента указано в часах [ч].
4. Дискуссия
Machine Translated by Google

---

Результаты совместного культивирования показывают, что L. vini имеет лучший рост при
совместном культивировании отдельно с S. cerevisiae и D. bruxellensis по сравнению с
культивированием совместно с обоими дрожжами. Микроорганизмы демонстрируют
увеличение числа клеток до тех пор, пока в периодической культуре не появится глюкоза,
и перейдут в стационарную фазу, когда глюкоза будет истощена, что отрицательно
доказывает гипотезу о том, что эти микроорганизмы могли взаимодействовать таким
образом, что они продуцируют некоторые вторичные метаболиты и способствуют росту. друг друга.
Дальнейшая работа, которую необходимо выполнить, заключается в трансформации
Synechocystis PCC 6803 с помощью конструкции и оценке экспрессии Rubisco и способности
связывать углерод с помощью анализа активности Rubisco и характеристики биомассы.
4.2.1. Влияние этанола на рост L. vini
не так эффективен с плазмидами с низким числом копий. Возможное объяснение того,
что мы получили колонии на чашках с антибиотиком, но клетки не росли в жидкой
культуре, может заключаться в том, что при приготовлении чашек антибиотик не
полностью перемешивался в чашках, и клетки образовывали колонии на чашках с
минимальным содержанием антибиотика или без него. концентрации, а при
культивировании клеток в жидкой среде с равномерно смешанным антибиотиком они не
росли из-за высокой чувствительности к антибиотику.
Мы использовали различные концентрации этанола для оценки его влияния на рост L.
vini; мы пришли к выводу, что более низкие концентрации, т.е. 10 г/л и 50 г/л, не оказывали
значительного влияния на рост L.vini, поскольку количество клеток постоянно
увеличивалось, потребление глюкозы и производство лактата также свидетельствовали о
том, что L.vini все еще растет . . Однако при более высокой концентрации этанола 100 г/л
наблюдалось непрерывное снижение количества клеток L. vini , близкое к пределу
обнаружения. Исследование показывает, что L. vini может переносить и выживать при
высокой концентрации этанола по сравнению с другими микроорганизмами. Было
показано, что Lactobacillus sp. могут переносить и расти при концентрации этанола до 16
% (43). Также было показано, что виды Lactobacillus способны расти при концентрации
этанола от 150 г/л до 200 г/л и могут выживать при концентрации 250 г/л (44). Точный
механизм этого неизвестен, но это может быть связано с этанолом. -индуцированные
изменения жирнокислотного состава липидов плазматической мембраны, приводящие к
более «жидкой» мембране. Это псевдоожижение можно объяснить как противовес физико-
химическому действию этанола на плазматическую мембрану (45).
Однако, если мы сравним продукцию этанола, мы придем к выводу, что она относительно
одинакова в случаях совместного культивирования L. vini с D. bruxellensis и
Успешное клонирование с помощью обычного метода, на что указывает ПЦР колоний, предполагает,
что обычное клонирование является методом выбора для клонирования низкокопийных плазмид, а
также инактивация нагреванием после рестрикционного расщепления, по-видимому, позволяет избежать
дальнейшей деградации плазмиды и оказывает положительное влияние на реакцию клонирования.
31
4.2.2. Совместное культивирование L. vini с S. cerevisiae и D. bruxellensis
4.1.1. Работа должна быть сделана
4.2. Бактерии как взаимодействующий организм
Machine Translated by Google

---

Наконец, я передаю привет Лизе Росгаард, Кристиану, Кэтрин, Анне, Марии,
Касперу, Майсе, Ризвану, Тарику, Исхаку и Халеду, которые поддерживали меня в
любом отношении во время завершения проекта.
с обоими дрожжами, но относительно выше в случае, когда L. vini
32
И последнее, но не менее важное: я хотел бы поблагодарить своих любящих родителей за их
безусловную любовь и постоянную поддержку на протяжении всей моей жизни.
культивировали с S. cerevisiae, предполагая, что S. cerevisiae - это быстрорастущие
дрожжи, потребляющие глюкозу быстрее и делающие ее менее доступной для L.
vini. Кривые роста обоих видов дрожжей также показывают, что рост S. cerevisiae
не влиял на их совместное культивирование с L. vini отдельно или вместе с D.
bruxellensis, однако рост D. bruxellensis был относительно ниже при был
сокультивирован с двумя другими микроорганизмами, чем тот, где он
культивировался с L. vini, что может быть связано с тем, что D. bruxellensis
медленно растет по сравнению с S. cerevisiae и что S. cerevisiae быстрее потребляет
глюкозу по сравнению с D. .. bruxellensis, что делает D. bruxellensis менее
доступным для быстрого роста числа клеток.
Я благодарен от всего сердца моему экзаменатору и супервайзерам Фолькмару
Пассоту (SLU), Юмико Сакураги (KU) и Евгении Тюковой, чья поддержка, контроль
и поддержка от предварительного до заключительного уровня позволили мне
развить понимание проект.
6. Ссылки
5. Благодарности
1. Патрик, Р. Прямое биологическое преобразование солнечной энергии в летучее углеводородное топливо с
помощью искусственных цианобактерий, прямое топливо,
http://www.directfuel.eu/DFrenewFuel3.html .
4. Бреннан Л., Овенде П. (2010). Биотопливо из микроводорослей — обзор технологий производства, переработки
и извлечения биотоплива и побочных продуктов, с. Renew Sustain Energy Rev. 14, 557-577.
7. Ван, Б., Ли, Ю., Ву, Н., и Лан, CQ (2008). Биосмягчение выбросов CO2 с помощью микроводорослей.
Прикладная микробиология Биотехнология. 79(5), 707-18.
Текущее мнение в области биотехнологии. 19, 235-240.
5. Мур, А. (2008) Биотопливо мертво: да здравствует биотопливо (?) - часть первая. Новый
Биотехногил. 25(1): 6-12.
6. ФАО. (2008). Состояние продовольствия и сельского хозяйства, 2008 г. Нью-Йорк: продовольствие и сельское хозяйство.
3. Кумар А., Эргас С., Юань К., Саху А., Чжан К., Девульф Дж., Малката Ф.Х. и ван Лангенхове Х. (2010). Улучшенная
фиксация CO(2) и производство биотоплива с помощью микроводорослей: последние разработки и
будущие направления. Тенденции биотехнологии. 28, 371-
9. Дисмукес Г.К., Каррьери Д., Беннетт Н., Ананьев Г.М., Позевиц М.С.
(2008) Водные фототрофы: эффективные альтернативы наземным культурам для производства биотоплива.
380.
(доступ 5 октября 2011 г.).
2. Energy Future Coalition, Energy Future Coalition,
http://
www.energyfuturecoalition.org/biofuels/index.html
(по состоянию на 13 октября 2011 г.).
8. Шенк П., Томас-Холл С., Стивенс Э., Маркс У., Массгнаг Дж., Постен С. и др.
(2008). Биотопливо второго поколения: высокоэффективные микроводоросли для производства
биодизеля. Биоэнергетические исследования., 1 (1): 20–43.
Организация.
Machine Translated by Google

---

Характеристики штаммов Dekkera bruxellensis . Прикладная микробная и клеточная биология.
19. Ацуми С., Хигасиде В. и Ляо Дж. К. (2009). Прямая фотосинтетическая переработка углекислого газа в
24. Пискур Дж., Розпедовска Э., Полакова С., Мерико А. и Компаньо К. (2006) Как Saccharomyces
эволюционировали, чтобы стать хорошим пивоваром? Тенденции Жене. 22, 183-186.
30. Бломквист Дж., Эберхард Т., Шнурер Дж. и Пассот В. (2010). Ферментация
59:123– 52.
E. Sharpe, and JG Holt (eds.), (1986) Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, vol. 2, 9 издание. Уильямс
и Уилкинс, США. (стр. 1063-1065).
12. Оно, Э., Куэльо, Дж, Л. (2006). ТЭО технологии секвестрации углекислого газа микроводорослями с
фотобиореактором и солнечным коллектором. Биосистемы, Инженерия. 95(4):597–606.
Тенденции биотехнологии. 26(7), 375-381.
18. Лю С., Янг А.Л., Старлинг-Виндхоф А., Брахер А., Зашенбрекер С., Рао Б.
Lactobacillus vini образуют стабильный консорциум по производству этанола в коммерческом
процессе производства спирта. Прикладная микробиология окружающей среды. 73, 4354-4356.
Микробиологический обзор. 56(2), 340-373.
из факультативных анаэробов и петит-положительных дрожжей Dekkera bruxellensis содержит гены
субъединицы НАДН-дегидрогеназы. FEMS Yeast Res. 10(5), 545-557.
21. Myers, RL, (2007). 100 наиболее важных химических соединений. Гринвуд
214-224.
87, 1487-1497.
15. Фэй, П. (1992). Кислородные отношения азотфиксации у цианобактерий.
20. Хансен, А.С., Чжан, К., и Лайн, П.В. (2005). Смеси этанола с дизельным топливом
Генетика природы. 37, 630-635.
14. Угву, К.У., Аояги, Х., и Учияма, Х. (2008). Фотобиореакторы для массового выращивания
водорослей. Биоресурсная технология. 99(10), 4021-4028.
изобутиральдегид. Природная биотехнология. 27(12), 1177-1180.
В., Рао К.В., Бернингхаузен О., Мильке Т., Хартл Ф.У., Бекманн Р. и Хайер Хартл М. (2010). Парное
действие сопровождающего при складывании и сборке шестигранного Rubisco. Природа. 463(14),
197-202.
13. Пульц О., Шейнбенбоган К. (1998). Фотобиореакторы: дизайн и характеристики по отношению к
подводимой световой энергии. Достижения в области биохимической инженерии / биотехнологии.
23. Лин Ю. и Танака С. (2006). Ферментация этанола из ресурсов биомассы: современное состояние и
перспективы. Прикладная микробиология и биотехнология .69, 627-642.
29. Dato, MCF, JM Pizauro и MJR Mutton. (2005). Анализ вторичных соединений, продуцируемых Saccharomyces
cerevisiae и штаммами диких дрожжей при производстве «кашасы». Бразильский журнал
микробиологии. 36:70–74.
28. Пассот В., Блумквист Дж. и Шнурер Дж. (2007). Dekkera bruxellensis и
33. Кандлер О. и Вайс Н., Род Lactobacillus,. В, PHA Sneath, NS Mair, M.
11. Чисти, Ю. (2007). Биодизель из микроводорослей. Биотехнологические достижения. 25(3), 294-306.
165.
22. Фортман Дж. Л., Чабра С., Мукхопадхьяй А., Чоу Х., Ли Т. С., Стин Э. и Кислинг Д. Д. (2008). Биотопливные
альтернативы этанолу: прокачка микробной скважины.
Издательская группа, США.
27. Хеллборг, Л., и Пискур, Дж. (2009). Сложная природа генома винных дрожжей Dekkera bruxellensis.
Эукариотическая клетка 8(11), 1739-1749.
10. Searchinger, T., Heimlich, R., Houghton, RA, Dong, F., Elobeid, A., Fabiosa, J., Tokgoz, S., Hayes, D., and Yu,
TH (2008) Использование Пахотные угодья США для производства биотоплива увеличивают
выбросы парниковых газов за счет выбросов в результате изменений в землепользовании.
Наука.319, 1238-1240.
17. Эллис, Р. Дж. (2010). Биохимия: борьба с неразумным замыслом. Природа . 463(14), 164-
32. Ljungh.Å, Wadström.T., (2009). Молекулярная биология Lactobacillus: от геномики до пробиотиков,
Caister Academic Press. Норфолк, Великобритания. (стр. 14-18).
16. Кебейш Р., Ниссен М., Тирувиди К., Бари Р., Хирш Х. Дж., Розенкранц Р., Стаблер Н., Шонфельд Б.,
Кройцалер Ф. и Петерхансель С. (2007). Хлоропластный фотодыхательный шунт увеличивает
фотосинтез и производство биомассы у Arabidopsis thaliana. Природная биотехнология. 25(5),
593-599.
обзор. Биоресурсная технология. 96, 277-285.
26. Прохазка Э., Полакова С., Пискур Дж. и Суло П. (2010). Митохондриальный геном
31. Готтшалк, Г. (1986). Бактериальный метаболизм. Нью-Йорк: Springer-Verlag, издание 2.
25. Томсон Дж.М., Гоше Э.А., Бурган М.Ф., Де Ки Д.В., Ли Т., Арис Дж.П. и Беннер С.А. (2005). Воскрешение
предковых алкогольдегидрогеназ дрожжей.
33
Machine Translated by Google

---

технологические параметры непрерывного производства спирта в биореакторе с
иммобилизованными клетками, Bioprocess Engineering. 6. 141-144.
,
36. Лусена БТЛ, Дос Сантос Б.М., Морейра Х.Л.С., Морейра А.П.Б., Нуньес А.С., Азеведо В.,
41. Протокол трансформации, описанный в руководстве Invitrogen, прилагаемом к набору.
42. http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/References/protocols/cloning/ligation protocol/cloning-
of-a-tailed-pcr-fragments-using-conventional-ligase-method.html 43. Голд Р.С., Мигер М.М.,
Хаткинс Р., Конвей Т. (1992). Толерантность к этанолу и углеводный обмен у лактобацилл, Journal
of Industrial Microbiology, 10. 45-
45. Couto, JA, Rozes, N., Hogg, T. (1996) Вызванные этанолом изменения жирных кислот.
54.
Миёси А., Томпсон Ф.Л., Мораис М.А. (2010). Разнообразие молочнокислых бактерий
биоэтанольного процесса. BMC Микробиология 10:298.
44. Джонс Р.П. (1989) Биологические принципы воздействия этанола; Ферментный микроб.
39. Тория, М.Дж., Белтран, Г., Ново, М., Поблет, М., Гийамон, Дж.М., Мас, А., Розес, Н., (2002) Влияние
температуры ферментации и видов Saccharomyces на клеточную жирную кислоту состав и
наличие летучих соединений в вине, Международный журнал пищевой микробиологии. 85.
127–136.
35. Rodas AM, Chenoll E, Macian MC, Ferrer S, Pardo I, Aznar R. (2006) Lactobacillus vini sp. nov., винная
молочнокислая бактерия, гомоферментативная по пентозам. Int J Syst Evol Microbiol
56:513-517.
40. Fleet, GH (2003) Взаимодействие дрожжей и вкус вина. Международный журнал пищевой
микробиологии. 86, 11-22.
37. Залдивар, Дж., Нильсен, Дж., и Олссон, Л. (2001) Производство топливного этанола из
34. Олива-Нето П.; Yokoya F. (2001) Восприимчивость Saccharomyces cerevisiae и молочнокислых
бактерий алкогольной промышленности к нескольким противомикробным соединениям;
Бразильский журнал микробиологии. Том 32 (1).
38. С.В. Рамакришна, Т.С. Ратнакумари и П.С.Т. Сай, (1991) Оптимизация
состав Lactobacillus hilgardii, его влияние на текучесть плазматической мембраны и
взаимосвязь с толерантностью к этанолу, Journal of Applied Bacteriology, 81. 126-132.
Техн., вып. 11 (март), 130-153.
лигноцеллюлоза: вызов для метаболической инженерии и интеграции процессов. Прикладная
микробиология Биотехнология. 56, 17-34.
34
Machine Translated by Google