Курсовая работа по биотехнологии на тему: " гибридомная технология" Студент курса группы фвм

Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И.Скрябина.


Курсовая работа по биотехнологии
на тему:
“гибридомная технология”


Выполнила:
Студент 5 курса 2 группы ФВМ
(заочное отделение)
Кузуб А.В.
Москва 2007

Гибридомная технология
Современная наука достигла такого этапа развития, когда для исследования необходимы реактивы, способные взаимодействовать с индивидуальными молекулами либо с различными участками макромолекул, что обеспечивает точность качественного и количественного анализа. Этим критериям идеально соответствуют молекулы иммуноглобулинов. Так как данные реагенты необходимы в большом количестве, перед исследователями была поставлена задача наладить производство антител одной специфичности (моноклональных) в промышленном масштабе. Было предпринято множество попыток, из которых следует отметить методики получения моноклональных антител из опухолей лимфоидных тканей и производства поликлональных антисывороток. Предложенные методы имели целый ряд недостатков и не удовлетворяли предъявляемым требованиям. Было невозможно получить опухоли, синтезирующие антитела на интересующие исследователя антигены, а поликлональные антисыворотки обладали перекрестной реактивностью и содержали низкое количество моноклональных антител. В связи с этим революционным достижением послужила разработка методики получения лимфоидных гибридом, позволяющая получать моноклональные антитела практически на любой антиген в необходимых количествах.
Лимфоидные гибридомы — это бессмертные клеточные клоны, продуцирующие антитела одной специфичности (моноклональные). Гибридомы получают посредством слияния раковой клетки лимфоидного ряда и «нормального» зрелого лимфоцита. От раковой клетки гибридома наследует способность к неограниченной пролиферации, а от «нормального» лимфоцита — способность синтезировать антитела. Гибридомы синтезируют на основе банка клеток-носителей (линий раковых клеток), клон лимфоцитов, в принципе, можно получить практически на любой интересующий антиген. На данный момент в мире существует более 50 тыс. гибридом. Получены гибридомы на основе клеток мышей, крыс, золотистого и китайского хомячков, клеток человека и т.д. Первоначально были получены гибридомы на основе клеток мыши линии balb/c, технология получения которых была разработана ранее. В настоящее время банк гибридом пополняется посредством получения гибридом на интересующие исследователей антигены. Гибридомная технология на данном этапе является единственной технологией, позволяющей получать моноклональные антитела в необходимом количестве, и занимает ведущее место в коммерческом обороте продуктов биотехнологии.
Технология лимфоидных гибридом была разработана в 1975 году Мильштейном и Келлером, и уже к 1977 году ими было получено 16 типов гибридом, синтезирующих различные типы моноклональных антител. Первоначально гибридомная технология строилась на основе следующих разработок: имелись линии миеломных клеток мышей balb/c (дефектные по некоторым ферментам метаболизма нуклеиновых кислот, что являлось необходимым условием для селекции получаемых гибридом), полученные в результате развития методов получения миелом, посредством введения инертного пластика и минеральных масел в виде подкожных инъекций мышам; разработаны методы слияния клеток с помощью вирусов (вирус Сендай) и полиэтиленгликоля; разработаны методики избирательной селекции клеток с помошью среды ГАТ. Главной заслугой Мильштейна и Келлера явилась непосредственно разработка методики, а также возможность использования получаемых гибридом для широкомасштабного производства моноклональных антител. Возможности гибридомной технологии были оценены по достоинству, и в 1984 году Келлер и Мильштейн были удостоены Нобелевской премии. В последующие годы были получены другие линии клеток-носителей, в том числе и линии клеток человека, однако наиболее распространенным типом гибридом являются гибридомы на основе мышиных клеток. Следует заметить, что, несмотря на огромную практическую значимость гибридомная технология решила и ряд теоретических затруднений, в частности это был окончательный и, вероятно, самый весомый довод в пользу клонально-селективной теории синтеза антител.
Гибридомная технология, в ее классическом варианте, выполняется в несколько этапов. В качестве предпосылок, необходимо иметь линию раковых клеток-носителей, дефектных по одному из ферментов (тимидинкиназе (ТК) или гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазе (ГГФРТ)), что само по себе определяет выбор способа селекции образующихся гибридом; разработанную процедуру слияния клеток; антиген, антитела на который необходимо получить исследователю, методики определения продуцируемых гибридомой антител с целью клонирования необходимой линии. При наличии всего вышеперечисленного процедура получения лимфоидных гибридом выглядит следующим образом (рис 1):

1. 
   иммунизация животных выбранным антигеном и выделение «нормальных» лимфоцитов иммунизируемого животного после определения максимального титра интересующих исследователя антител;
   
2. 
   культивирование раковых клеток-носителей;
   
3. 
   проведение слияния клеток-носителей с «нормальными» лимфоцитами (в классическом варианте с помощью полиэтиленгликоля);
   
4. 
   проведение процедуры селекции образующихся гибридом с помощью среды ГАТ. Клетки, имеющие дефект по одному из перечисленных ферментов (ТК или ГГФРТ), не способны расти в ГАТ среде, содержащей гипоксантин, тимидин и аминоптерин. Аминоптерин блокирует синтез dTMP посредством ингибирования дигидрофолят-редуктазы.
   

Клетки, имеющие дефект по одному из перечисленных ферментов (ТК или ГГФРТ), не способны расти в ГАТ среде, содержащей гипоксантин, тимидин и аминоптерин. Аминоптерин блокирует синтез dTMP посредством ингибирования дигидрофолят-редуктазы. Следовательно, в среде, содержащей аминоптерин, синтез пиримидинов может происходить только из готовых предшественников (из тимидина в данном случае). Клетки, содержащие дефектную ТК не способны расти в ГАТ среде. Клетки, содержащие дефектную ГГФРТ, способны синтезировать пурины из предшественников, но не из готовых продуктов (из гипоксантина в данном случае), следовательно, в ГАТ-среде данные клетки погибнут. В том случае, если произойдет слияние клеток таким образом, что у полученных гибридов дефектные ГГФРТ и ТК будут дополнены функциональными ферментами, то данные гибриды выживут в ГАТ-среде.

К таким клеткам относятся гибридные клетки, получившие оба фермента от родительских клеток (по одному от каждой). При слиянии миеломных клеток с лимфоцитами можно использовать опухолевые клетки, дефектные только по одному из ферментов, т.к. лимфоциты не способны размножаться в культуре и погибают через некоторое время естественным путем (полуселективный способ) (рис 2);

5. 
   проведение процедуры культивирования полученных лимфоидных гибридом и выделение клона гибридом, продуцирующего необходимые антитела (выделение клона, продуцирующего нужные исследователю антитела необходимо, т. к. только в этом случае будет происходить наращивание концентрации гибридом данного типа);
   
6. 
   проведение изучения полученных гибридом;
   
7. 
   наращивание концентрации моноклональных антител in vivo (с помощью асцитных жидкостей) или in vitro.
   

Рис. 2

Такова классическая схема получения лимфоидных гибридом, предложенная Келлером и Мильштейном. До настоящего момента основная схема существенным образом не изменилась. С учетом всех вышеперечисленных предпосылок данная методика принята во множестве лабораторий мира и вполне оправдывает себя. Изменения касаются некоторых пунктов и в основном являются результатом модификации существующей процедуры под нужды конкретной лаборатории. Следует отметить следующие изменения:

• 
  Использование в качестве клеток-носителей других линий клеток, не имеющих дефект по вышеперечисленным ферментам, приводит к необходимости изменения процедуры селекции образующихся гибридом, т. к ГАТ-среда в данном случае не работает. Таким образом, разрабатываются методы селекции, подходящие для выбранных клеток. Примером такой модификации может служить метод «интерферон-вирус», разработанный для клеток человека J-96 и мышиных клеток L929;
  
• 
  В связи с усовершенствованием методов электрослияния клеток происходит его активное внедрение в гибридомную технологию в качестве альтернативы слияния с помощью этиленгликоля, вытеснившего в свое время методику слияния с помощью вирусов (вирус Сендай);
  
• 
  В качестве клеток-носителей все чаще начинают использование клеток других типов, полученных либо от организма одного вида, либо даже от разных видов. Разработка подобных методов позволяет не только изучить особенности функционирования клеток как таковых, но и имеет колоссальный практический интерес, т.к. позволяет решить проблему получения человеческих гибридом.
  

Одной из основных трудностей, возникающих при получении лимфоидных гибридом, является наличие феномена элиминации хромосом, заключающегося в потере определенных хромосом в процессе культивирования. Данный процесс может служить причиной потери клеткой признаков, необходимых исследователю, в частности, потери способности к неограниченной пролиферации у раковых клеток и способности к синтезу иммуноглобулинов у гибридом. В данном процессе имеется корреляция между количеством хромосом и степенью их элиминации. Чем больше хромосом в клетке, тем меньше вероятность потери необходимых исследователю свойств. Следует заметить, что элиминация хромосом — процесс «направленный». Элиминации подвержены в большей мере те хромосомы, наличие которых не является необходимым клетке для выживания в данных условиях культивирования. Следовательно, изменяя условия культивирования, можно в некоторой степени направлять процесс элиминации в нужную сторону.
Для получения линии клеток-носителей необходимо следующее условие: клетки должны обладать способностью к неограниченной пролиферации и не продуцировать собственных антител (в случае, если подобные клетки являются клетками лимфоидного ряда). Этого можно достичь посредством отбора интересующего клона клеток в процессе их культивирования с целью сохранения необходимых признаков (вышеперечисленных в данном случае). Это осуществляется вследствие повышенной мутабельности раковых клеток.
При получении лимфоидных гибридом существует опасность потери способности образующейся гибридомы к синтезу антител. Этого можно избежать путем подбора соответствующей линии клеток-носителей и оптимальных условий культивирования гибридом. этот феномен также связан с феноменом элиминации хромосом и имеет те же ограничения, что и описанные выше.
Гибридомная технология позволяет получать практически неограниченное количество моноклональных антител практически на любой существующий антиген. Эта методика по своим масштабам не имеет конкуренции и является лидером по коммерческому обороту. Так как каждая гибридома может продуцировать только один вид антител, является целесообразным разработка новых типов гибридом, основанных на клетках других организмов, что позволит не только получать моноклональные антитела, идеально подходящие для работы с данными видами, но и изучить особенности функционирования клеток последних, рассмотреть вопросы, касающиеся биосинтеза антител et cetera. В связи с этим, перспективным является получение лимфоидных гибридом на основе клеток кур. Клетки кур имеют ряд преимуществ по сравнению с клетками других видов животных по ряду признаков:

• 
  наличие большого числа минихромосом дает возможность избежать элиминации необходимых исследователю признаков, как было описано выше;
  
• 
  наличие особенностей иммуногенетики кур (особенности адаптации синтеза антител к структуре антигена при более «простой» в отличие от млекопитающих структуры генов, кодирующих антитела).
  

Получение лимфоидных гибридом на основе линии клеток кур позволит получать моноклональные антитела в необходимом количестве, а также изучить ряд теоретических задач, касающихся проблем иммуногенетики кур et cetera. В качестве клеток-носителей будет использоваться линия трансформированных лимфоидных клеток кур. Структура получения гибридом на основе клеток кур такова:

1. 
   Получение суспензии клеток костного мозга суточных цыплят;
   
2. 
   Выделение из суспензии лимфоидных клеток посредством центрифугирования в градиенте плотности фиколла;
   
3. 
   Культивирование лимфоидных клеток в полужидких агаровых средах;
   
4. 
   Трансформация лимфоидных клеток с помощью химических канцерогенов;
   
5. 
   Клонирование трансформированных лимфоидных клеток;
   
6. 
   Иммунизация кур выбранным антигеном;
   
7. 
   Определение титра антител и выделение лимфоцитов при его максимальном значении;
   
8. 
   Проведение электрослияния трансформированных лимфоидных клеток с «нормальными» лимфоцитами;
   
9. 
   Клонирование полученных гибридом.
   

Проведение индивидуального электрослияния клеток позволяет избежать процедуры селекции образующихся гибридом, т.к. в данном случае отбор будет производиться непосредственно во время слияния клеток. Таким образом, получение лимфоидных гибридом на основе линии трансформированных лимфоидных клеток кур позволит получить новый тип гибридом, синтезирующих моноклональные антитела на интересующий антиген с перспективой их использования в самых различных областях — от создания диагностических наборов до использования в самых разных областях ветеринарии и сельского хозяйства.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Кеннет Р.Г., Мак-Керн Т.Дж., Бехтол К.Б.

Моноклональиые антитела: Гибридомы: новый уровень логического анализа. М.: Медицина, 1983.

2. Роит А. Основы иммунологии. М.: Мир, 1991.

3. А.Ю. Барышников, Е.Р. Полосухина. Моноклональные тела в онкологии.

4. Г.И. Абелев. Моноклональные антитела.

5. Тихонов И.В., Рубан Е.А., Грязнева Т.Н. и др. Биотехнология. , СПб.:ГИОРД, 2008

6. Тихонов И.В., Кулица М.М. Гибридомная технология. Получение моноклональных антител – М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К.И.Скрябина, 2006.