Mass-spektrometriya

Matritsa yordamida lazerli desorbsiya/ionlashtirish (MALDI)
Matritsa yordamida lazerli desorbsiya/ionizatsiya massa spektrometriyasi (MALDI-MS) birinchi marta 1988 yilda Tanaka, Karas va Xillenkamp tomonidan kiritilgan. O'shandan beri u peptidlar, oqsillar va boshqa ko'plab biomolekulalar (oligonukleotidlar, uglevodlar, tabiiy mahsulotlar va lipidlar) uchun keng tarqalgan analitik vositaga aylandi. Matritsa yordamida lazer bilan induktsiyalangan desorbsiya hodisasi paytida samarali va yo'naltirilgan energiya uzatish buzilmagan tahlil qiluvchi moddaning yuqori ion rentabelligini ta'minlaydi va sub-pikomol sezgirligi bilan birikmalarni o'lchash imkonini beradi. Bundan tashqari, MALDI ning heterojen namunalarni tahlil qilish uchun foydali bo'lishi uni proteolitik hazm qilish kabi murakkab biologik namunalarni ommaviy tahlil qilish uchun juda jozibador qiladi.
1.14-rasm: MALDI hodisasi paytida UV lazer pulsining samarali va yo'naltirilgan energiya uzatishi nisbatan kichik miqdordagi namunalarni (femtomoldan pikomolga) tahlil qilish imkonini beradi. Bundan tashqari, MALDI massa spektrometriyasining heterojen namunalarni tahlil qilish uchun foydaliligi uni biologik namunalarni ommaviy tahlil qilish uchun juda jozibador qiladi.
MALDI uchun aniq desorbsiya / ionlanish mexanizmi noma'lum bo'lsa-da, odatda MALDI namuna matritsasini lazer bilan qo'zg'atish va abatsiya qilish orqali kondensatsiyalangan fazadan namunaning ionlanishi va gaz fazasiga o'tishiga sabab bo'ladi, deb ishoniladi (1.14-rasm ) . MALDI tahlilida analit birinchi navbatda matritsa birikmasining katta molyar ortiqligi, odatda UV nurini yutuvchi kuchsiz organik kislota bilan birgalikda kristallanadi. Ushbu analit-matritsa aralashmasining lazer bilan nurlanishi matritsaning bug'lanishiga olib keladi, u analitni o'zi bilan olib yuradi. Ushbu texnikada matritsa asosiy rol o'ynaydi. Ko-kristallangan namuna molekulalari ham bug'lanadi, lekin lazerdan energiyani to'g'ridan-to'g'ri o'zlashtirmasdan. Shuning uchun lazer nuriga sezgir bo'lgan molekulalar to'g'ridan-to'g'ri UV lazer qo'zg'alishidan himoyalangan.
MALDI matritsasi - uchuvchan bo'lmagan qattiq material lazer nurlanishini yutish orqali desorbsiya va ionlanish jarayonini osonlashtiradi. Natijada, matritsa ham, matritsaga kiritilgan har qanday namuna ham bug'lanadi. Matritsa, shuningdek, tushgan energiyaning katta qismini o'zlashtirib, lazer nurlanishidan namuna shikastlanishini minimallashtirishga xizmat qiladi.
Gaz fazasiga kirgandan so'ng, desorbsiyalangan zaryadlangan molekulalar MALDI ionlash manbasidan massa analizatoriga elektrostatik tarzda yo'naltiriladi. Ko'pincha ionlarni massa-zaryad nisbati (m/z) bo'yicha ajratish uchun uchish vaqti (TOF) massa analizatorlari ishlatiladi. MALDI ning impulsli tabiati bevosita TOF analizatorlariga taalluqlidir, chunki ionning dastlabki parvoz vaqti lazerning har bir impulsi bilan boshlanishi va ion detektorga yetib kelganida yakunlanishi mumkin.
MALDI tomonidan desorbsiyani tushuntirish uchun bir qancha nazariyalar ishlab chiqilgan. Termal-shpik modeli shuni ko'rsatadiki, buzilmagan molekulalarning ejeksiyonu matritsa va analit o'rtasidagi zaif tebranish birikmasi bilan bog'liq bo'lib, bu matritsadan analit molekulasining tebranish rejimlariga tebranish energiyasini o'tkazishni minimallashtiradi va shu bilan parchalanishni kamaytiradi. Bosim impulsi nazariyasi matritsadan bosim gradienti sirtga normal hosil bo'lishini va katta molekulalarning desorbsiyasi ushbu tez harakatlanuvchi matritsa molekulalari bilan to'qnashuvdan impuls o'tkazilishini kuchaytiradi. Umuman olganda, ionlanish desorbsiya jarayonida proton ko'chishi yoki kationlanish orqali sodir bo'ladi, deb hisoblashadi.
MALDI ning biomolekulalarni tahlil qilish uchun foydaliligi uning buzilmagan molekulalar haqida molekulyar og'irlik haqida ma'lumot berish qobiliyatidadir. To'g'ri ma'lumotni yaratish qobiliyati oqsillarni aniqlash va tavsiflash uchun juda foydali bo'lishi mumkin. Masalan, oqsilni ko'pincha uning tarkibidagi peptidlarning aniq massa tahlili (namunani kimyoviy yoki fermentativ davolash natijasida hosil bo'lgan) bilan aniq aniqlash mumkin.
Afzalliklar
Amaliy massa diapazoni 300 000 Da gacha. Yuqori oqim detektori yordamida ancha katta massali turlar kuzatilgan
Past femtomoldan past pikomolgacha bo'lgan odatiy sezuvchanlik. Attomol sezgirligi mumkin
Yumshoq ionlanish, parchalanish kuzatilmaydi
Millimolyar konsentratsiyalarda tuzlarning tolerantligi
Murakkab aralashmalarni tahlil qilish uchun javob beradi
Kamchiliklari
700 Da dan past bo'lgan birikmalar uchun muammo bo'lishi mumkin bo'lgan matritsa fon. Ushbu fon shovqinlari matritsa materialiga juda bog'liq
Lazerli desorbsiya/ionlash orqali fotodegradatsiya qilish imkoniyati
MALDIda qo'llaniladigan kislotali matritsa ba'zi birikmalarda degradatsiyaga olib keladi
1.15-rasm: Odatda ishlatiladigan MALDI matritsalari va matritsaning joylashishini ko'rsatuvchi MALDI plitasi. MALDI ning afzalliklaridan biri shundaki, bu ko'p namunali plastinkada ko'rinib turganidek, bir vaqtning o'zida bir nechta namunalar tayyorlanishi mumkin.
Namuna-matritsani tayyorlash protseduralari peptidlar / oqsillarning MALDI massa spektrlarining sifatiga katta ta'sir ko'rsatadi ( 1.15-rasm ). Xabar qilingan turli xil tayyorlash usullari orasida quritilgan tomchilar usuli eng ko'p qo'llaniladi. Bunday holda, to'yingan matritsa eritmasi analit eritmasi bilan aralashtiriladi va matritsaning namunaga nisbati taxminan 5000:1 ni beradi. Keyin bu aralashmaning alikvoti (0,5-2,0 mkL) namunaga qo'llaniladi, u erda quritishga ruxsat beriladi. Quyida quritilgan tomchilar usuli qanday amalga oshirilishiga misol keltirilgan:

1. 
   Namuna plastinkasiga 0,5 mL namunani pipetka bilan soling.
   
2. 
   Namuna plastinkasiga 0,5 mkL matritsani pipetka bilan soling.
   
3. 
   Namuna va matritsani birlashtirilgan tomchini pipetka ichiga va tashqarisiga chizish orqali aralashtiring.
   
4. 
   Havoda quritishga ruxsat bering.
   

• 
  Peptidlar, kichik oqsillar va ko'pgina birikmalar uchun: 0,1% TFA bilan 50:50 ACN: H2O dagi a-siyano-4-gidroksitsinamik kislotaning to'yingan eritmasi.
  
• 
  Proteinlar va boshqa yirik molekulalar uchun: 0,1% TFA bilan 50:50 ACN: H2O dagi sinapin kislotasining to'yingan eritmasi.
  
• 
  Glikopeptidlar/oqsillar va mayda birikmalar uchun: 50:50 ACN:H2O dagi 2,5-dihidroksibenzoy kislotasining (DHB) to‘yingan eritmasi.
  

Shu bilan bir qatorda, namunalar bosqichma-bosqich tayyorlanishi mumkin. Yupqa qatlam usulida maqsadda birinchi navbatda bir hil matritsa "plyonka" hosil bo'ladi, so'ngra namuna qo'llaniladi va matritsa tomonidan so'riladi. Bu usul yaxshi sezuvchanlik, hal qilish quvvati va massa aniqligini beradi. Xuddi shunday, qalin qatlamli usulda matritsa qo'shimchasi sifatida nitroselüloz (NC) ishlatiladi; maqsadda yagona NC-matritsa qatlami olingandan so'ng, namuna qo'llaniladi. Ushbu tayyorlash usuli gidroksidi qo'shimcha hosil bo'lishini bostiradi va ayniqsa, jellardan olingan peptidlar va oqsillarni aniqlash sezgirligini sezilarli darajada oshiradi. Sandviç usuli - bu toifadagi yana bir variant. Yupqa qatlamli usulda bo'lgani kabi, matritsa kristallarining yupqa qatlami tayyorlanadi, so'ngra (a) suvli 0,1% TFA, (b) namuna va (c) matritsa tomchilari qo'shiladi.