Mavzu: dnk restriksion tahlil usuli

Mavzu:DNK restriksion tahlil usuli

Tabiatda biror mikroorganizm hujayrasiga tashqaridan yot gentik material kirsa, u darhol hujayradagi nukleaza fermentlari ishtirokida parchalab tashlanadi.

DNK molekulasini mayda bo’laklarga buluvchi fermentlar endonukleazalar yoki restriktazalar deb ataladi. Har bir restriktaza to’rt yoki ko’proq maxsus nukleotid juftlarni tanib olib bloklanadi va DNK molekulasini kesadi. Ayrim restriktazalar DNK qo’sh zanjirini qaychi singari shartta ikki bo’lakka bo’ladi. Bunday restriktazalarga A1u I, Vga I, Nae III, Nra I, YesoKV, Ninc II, Pvu II, Rsa I, Ssa I, Sma I va boshqalarini misol qilib keltirish mumkin.

SHu bilan birga qo’sh zanjir DNK molekulasini "yopishqoq" uchlar hosil qilib kesuvchi restriktazalar ham mavjud (Aat II, Ass III, Ara I, Vam HI, Yeso RI, Nind III va boshqalar). Bu restriktazalar vazifasi jihatdan transpozazaga o’xshashligi ko’rinib guribdi. SHuning uchun ham bu restriktazalar hosil qilgan "yopishqoq" uchlardan foydalanib, har xil DNK bo’laklarini bir-biriga bog’lash soddalashadi. Ana shu xususiyati tufayli bu xil restriktazalar gen muxandisligida keng qo’llaniladi. Hozirgi kungacha 500 dan ortiq xilma xil restriktazalar tozalanib olingan va o’rganilgan.

Odatda mikroorganizm irsiy moddasining xromosomasi bir nechta million nukleotid juftlari izchilligidan iborat. O’simlik yoki hayvon genomi bir necha yuz milliondan to 1 milliardgacha nukleotid juftlari izchilligidan tuzilgan. Bunday buyuk molekulani yuqorida qayd qilingan xilma-xil restriktsion endonukleazalar ishtirokida ko’plab parchalarga bo’lish mumkin. Endonukleaza ishtrokida parchalangan DNK bo’laklari elektroforez moslamasida maxsus molekulyar "elak" teshiklaridai yuqori kuchlanishli elektr maydoni ta’sirida molekulaning zaryadi va o’lchamiga binoan ajratiladi. DNK bo’laklarini maxsus bo’yoq bilan bo’yash natijasida ultra binafsha nurlari yordamida oddiy ko’z bilan ko’riladi. DNK ning mayda bo’laklari elektr maydonida gel kovaklaridan yirik bo’laklarga nisbatan tez harakat qilgani uchun ularning startdan bosib o’tgan masofasini o’lchab DNK bo’lagining katta kichikligi aniqlanadi. Elektroforez moslamasida bir-biridan faqat bir nukleotid kam yoki ko’pligi bilan farqlanuvchi DNK bo’laklarini ajratish mumkin. Restriktsion endonukleaza fermentlarining ochilishi va elektroforez moslamasida DNK bo’laklarini o’ta aniqlik bilan bir-biridan ajratishning takomillashuvi gigant DNK molekulasidan istalgan DNK bo’lagini ajratib olish imkonini beradi.

Sun’iy sharoitda rekombinant DNK olish va genlarni klonlash ilk bor 1972 yilda AQSH olimlari Boyer va Koen tomonidan amalga oshirilgan. Bu olimlar E.coli bakteriyasining xromosoma DNKsiga va shu bakteriya plazmidasiga aloxida idishlarda EcoRI restriktaza fermenti bilan ishlov berganlar.

Plazmida tarkibida faqat 1 dona EcoRI restriktaza fermenti tanib kesadigan maxsus nukleotidlar izchilligi bo‘lganligi sababli ferment plazmidaning xalqasimon DNK qo‘sh zanjirini faqat bir joydan kesib, plazmidani «yopishqoq« uchli ochiq xolatga o‘tkazadi. Xromosoma DNK molekulasida EcoRI restriktaza fermenti taniy oladigan maxsus nukleotidlar izchilligi qancha bo‘lsa, bu molekula shuncha bo‘lakka bo‘linadi.

Turli xil o‘lchamga ega bo‘lgan DNK molekulasi elektroforez uslubi yordamida ajratib olinadi. Ajratib olingan «yopishqoq« uchli xromosoma DNKsi bo‘lagi ochiq xolatdagi «yopishqoq« uchli plazmid DNKsi bilan aralashtirilib ligaza fermenti yordamida tikiladi (ulanadi). Natijada plazmid tarkibiga xromosoma DNK bo‘lagi kiritiladi. SHu boisdan rekombinant DNK ga quyidagicha tarif berish mumkin: Har qanday tirik organizm irsiy molekulasining istalgan bo‘lagini vektor molekulalariga birikishdan xosil bo‘lgan sun’iy DNK rekombinant DNK deyiladi.

Rekombinant DNK olishning 3 ta usuli bor

• 
  Konnektor
  

Rekombinatsiyada ishtirok etuvchi DNK bo‘lagining 3’ uchiga dezoksinukleotidil-transferaza fermenti yordamida ma’lum uzunlikdagi oligo segmenti ulanadi. Bu DNK bo‘laklari aralashtirilganda dA va dT segmentlarning vodorod bog‘lari asosida komlementar birikishi tufayli xalqasimon DNK strukturasi hosil bo‘ladi. Hosil bo‘lgan DNK dagi bir zanjirli bo‘sh joylar DNK-polimeraza I fermenti yordamida to‘ldiriladi.

• 
  Restriktaza-ligaza
  

Restriktaza-ligaza usuli eng sodda va oson rekombinant DNK olish usuli xisoblanadi. Bu usulda DNK molekulasi va vektor plazmida «yopishqoq« uchlar xosil qiluvchi restriktaza bilan qirqiladi va aralashtirilgan xolda ma’lum sharoitda biriktiriladi. Komplementarlik xususiyatiga ko‘ra DNK molekulalari o‘zaro vodorod bog‘lari yordamida birikib xalqasimon struktura xosil qiladi va DNK zanjirining birikmagan joylari DNK-ligaza fermenti yordamida ulanadi.