Micropatterning of Nanoengineered Surfaces to Study Neuronal Cell Attachment in Vitro


Download 0.87 Mb.
Pdf ko'rish
bet6/8
Sana01.10.2017
Hajmi0.87 Mb.
#16919
1   2   3   4   5   6   7   8

7

As x decreases, the



protein D

e

is decreased because the protein has an increasing



probability of encountering a polymer chain rather than freely

diffusing in solution. For example, Cruise et al. found that the

diffusion coefficient of myoglobin in PEG hydrogels with mesh

sizes of 58 A

˚ or 34 A˚ was decreased two or four orders of

magnitude, respectively, compared to the D

e

of myoglobin in



water.

8

Another network parameter that affects the D



e

of

a protein in a hydrogel is the charge, which can be controlled in



protein-releasing hydrogels by varying the number of ionized

groups present on the network backbone at physiological pH.

For example, when Gu et al. encapsulated vascular endothelial

growth factor (VEGF) (pI

¼ 8.5) in alginate hydrogels (pI ¼ 3.5)

there was significant electrostatic attraction between the protein

and the hydrogel, and only

$10% of the total loaded VEGF was

released over five days. Addition of CaCl

2

to the buffer



surrounding the alginate hydrogels disrupted the electrostatic

interaction between VEGF and alginate, resulting in

$100%

VEGF release within 3 days.



9

Based on these studies and others,

it is clear that the physicochemical properties of a hydrogel

network strongly influence protein diffusion and, in turn, protein

release. In this study we hypothesized that dynamic variation in

hydrogel network properties via dynamic protein conformational

changes could provide a novel mechanism to modulate release of

a therapeutic protein.

Recently there has been a great deal of interest in developing

‘‘smart’’ hydrogels for dynamic, controlled protein delivery.

7

Specifically, previous studies have demonstrated that the rate of



protein delivery from a hydrogel can be dynamically varied over

time by creating hydrogels that change their x, charge, or internal

fluid pressure in response to a stimulus. One mechanism used to

a

The University of Wisconsin, Department of Biomedical Engineering,



Madison, WI 53706, USA. E-mail: wlmurphy@wisc.edu

b

The University of Wisconsin, Department of Materials Science and



Engineering, Madison, WI 53706, USA

c

The University of Wisconsin, Department of Pharmacology, Madison, WI



53706, USA

† This paper is part of a Soft Matter issue highlighting the work of

emerging investigators in the soft matter field.

This journal is

ª The Royal Society of Chemistry 2009

Soft Matter, 2009, 5, 2399–2406 | 2399

PAPER

www.rsc.org/softmatter



| Soft Matter

dynamically change x involves creating hydrogel networks that

change their solubility in response to a stimulus. This class of

dynamic hydrogels has been designed to respond to physi-

ochemical

stimuli

including



pH,

10

temperature,



11

electric


current,

12

and light.



13,14

Another mechanism used to dynamically

alter the protein release rate involves changing the internal fluid

pressure in a hydrogel network. For example, Lee et al.

mechanically loaded alginate hydrogels impregnated with

VEGF, and found that the release rate of VEGF was increased

due to the increased fluid pressure inside the hydrogel.

15

These



approaches indicate that changes in the physicochemical prop-

erties of a hydrogel network can be translated into changes in

protein release characteristics. However, these approaches may

be limited in the types of stimuli that can be used to induce

changes in protein release, and they have focused on non-specific,

physicochemical stimuli to date.

Recently, hydrogels have been designed to respond to more

specific biochemical stimuli by incorporating proteins that bind

to specific ligands.

16–20


These binding events effectively change

the number of crosslinks in a hydrogel network, which in turn

decreases network x, resulting in volume changes of up to 20%

when compared to the initial hydrogel volume.

17,19

For example,



Miyata et al. created hydrogels in which antibodies and their

specific antigens were covalently attached to the hydrogel

network. Within the hydrogel network the antibodies were able

to bind to the antigens, thereby increasing the crosslinking

density and decreasing x. When free antigen was added to the

solution bathing the hydrogel, the free antigen competitively

replaced the network-bound antigen, resulting in a decreased

crosslinking density and an increased x, leading to macroscopic

volume shifts of approximately 10%.

17

This approach provides



an important example of dynamic hydrogels that respond to

biochemical cues, and motivates the need for hydrogels that

undergo more substantial dynamic changes in response to

specific biological molecules.

We have previously designed dynamic hydrogels whose

macroscopic dynamic properties are based on a nanometre-scale

conformational change in the protein calmodulin (CaM).

21–23


Calmodulin undergoes a ‘‘hinge motion’’ upon binding of

a variety of specific ligands, including small molecules, peptides,

and proteins.

23

Therefore, hydrogels in which CaM is included as



a functional network component have been shown to undergo

reversible volume decreases of up to 75% of their initial volume

in the presence of CaM-specific ligands.

21–23


In the current study,

we hypothesized that the dynamic properties of CaM-based

hydrogels could be tailored by changing: (1) the ratio of dynamic

(PEG-CaM-PEG) to static (PEGDA) polymer in the hydrogel;

and (2) the initial concentration of PEG-CaM-PEG present

during hydrogel formation. Furthermore, we hypothesized that

the volume decreases of PEG-CaM-PEG hydrogels in the pres-

ence of a CaM ligand would be accompanied by fluid exclusion,

which in turn would lead to enhanced release of a therapeutic

protein molecule. More specifically, we hypothesized that

transport of a growth factor out of a PEG-CaM-PEG hydrogel

would be increased during hydrogel ‘‘collapse’’ when compared

to typical transport via Fickian diffusion. We specifically focused

on modulating release of VEGF in these studies, as VEGF is

a potent therapeutic promoter of angiogenesis, the growth of new

blood


vessels

from


a

pre-existing

vascular

supply.


24,25

Furthermore, in previous studies VEGF activity has been shown

to be maintained after release from hydrogels.

15,26


Results herein

indicate that uptake of VEGF into PEG-CaM-PEG hydrogels is

proportional to the initial PEG-CaM-PEG concentration

present during hydrogel formation, and that the VEGF release

rate is significantly increased in environments that promote

hydrogel collapse. These data provide a first demonstration that

protein conformation changes can be used as a mechanism to

modulate protein release from a material.

Results

PEG can be covalently conjugated to an engineered version of



the protein calmodulin, and the resulting PEG-CaM-PEG

conjugates can be purified without significant loss of protein

activity. The Michael-Type addition reaction of PEGDA to the

sulfhydryl side chains of CaM(T34C, T110C), shown schemati-

cally in Fig. 1A, proceeded to completion as demonstrated by

MALDI-ToF mass spectrometry (Fig. 1B). Phenyl sepharose

column purification removed unreacted PEGDA from the reac-

tion mixture as evaluated by HPLC (Fig. 1C). CaM(T34C,

T110C) maintained nearly 100% of its original activity during

phenyl sepharose purification, dialysis, and reaction with

PEGDA. Lyophilization in the absence of the excipient raffinose

decreased CaM(T34C, T110C)’s activity to 52.4

Æ 5.6% of its

original activity. In contrast, when lyophilization was performed

in the presence of the excipient raffinose 85.5

Æ 1.2% of original

CaM activity was maintained (Fig. 1D).

The initial mass fraction of polymer (4) and ratio of PEG-

CaM-PEG3400 to PEGDA3400 influenced the static and

dynamic properties of protein-based hydrogels. The initial Q

m

of

swollen



PEG-CaM-PEG3400/PEGDA3400

hydrogels

was

significantly greater than the Q



m

of the collapsed hydrogels in all

conditions (p < 0.05). Interestingly, the Q

m

s of all hydrogels after



exposure to the TFP ligand were not significantly different (p >

0.05) (Fig. 2A). PEG-CaM-PEG3400/PEGDA3400 hydrogels

decreased their volume to a greater extent in response to TFP as

the ratio of PEG-CaM-PEG3400/PEGDA3400 was increased.

PEG-CaM-PEG3400/PEGDA3400 hydrogels with ratios of

7/3% and 8/2% underwent significant recovery when TFP was

removed from the buffer, but did not recover to 100% of their

swollen volume (p < 0.05) (Fig. 2B). Pure PEG-CaM-PEG3400

hydrogels of varying 4 decreased their volume to a greater extent

with decreasing 4 (Fig. 2C). Hydrogels composed of constant 4

of PEG-CaM-PEG3400 and varying 4 of PEGDA3400

decreased in volume less in response to TFP as the 4 of PEGDA

increased (Fig. 2D).

Absorption and release of VEGF by dynamic, protein-based

hydrogels is strongly influenced by the hydrogel physiochemical

properties

and

hydrogel


dynamics.

PEG-CaM-PEG3400

hydrogels absorbed more VEGF as 4 was increased (R

2

¼



0.9857) (Fig. 3A). Importantly, the VEGF release rate was

increased when 10% PEG-CaM-PEG3400 hydrogels were

exposed to TFP (Fig. 4A). 10% PEG-CaM-PEG3400 hydrogels

could also be triggered to increase their VEGF release rate in

response to TFP even after being initially maintained without

TFP for 24 h (Fig. 4B, black line). 10% hydrogels undergo

significant volume decreases when exposed to TFP (Fig. 4C), as

demonstrated quantitatively in Fig. 2C.

2400 | Soft Matter, 2009, 5, 2399–2406

This journal is

ª The Royal Society of Chemistry 2009


Interestingly, the release rate of VEGF increased in all PEG-

CaM-PEG3400 hydrogels when the hydrogel underwent TFP-

induced volume collapse, regardless of their initial polymer

concentration (Fig. 5A–B). However, hydrogels with the highest

4

did not release the most VEGF over a 48 h time frame (Fig. 5A



left side). 10% (w/v) PEG-CaM-PEG3400 hydrogels released

100.4


Æ 0.8% of their absorbed VEGF, whereas 15% (w/v) PEG-

CaM-PEG3400 hydrogels released only 57.9

Æ 1.2% of their

absorbed VEGF over 48 h (Fig. 5A right side). In hydrogels

prepared with both PEG-CaM-PEG3400 and PEGDA3400, an

increase


in

the


PEG-CaM-PEG3400/PEGDA3400

ratio


increased the total amount of VEGF absorbed in the hydrogels,

which in turn resulted in an increased amount of total VEGF

released (Fig. 5B left side). Hydrogels prepared with PEG-CaM-

PEG3400/PEGDA3400 ratios of 7/3%, 9/1%, and 10/0% each

released more than 99% of their loaded VEGF in the presence of

TFP (Fig. 5B right side).

Discussion

The synthesis and purification approach used here may be used

for synthesis of other dynamic, protein-based materials. CaM

(T34C, T110C) was reacted with PEGDA via a Michael-Type

addition reaction between cysteines on the CaM(T34C, T110C)

mutant and acrylate groups on PEGDA molecules (Fig. 1A–B).

Many proteins have surface-exposed cysteine residues, which

could be modified in a similar manner. Here we removed excess

PEGDA after the PEGDA-protein reaction by purifying PEG-

CaM-PEG conjugates using hydrophobic interaction chroma-

tography (Fig. 1C). This form of column chromatography has

been optimized for several proteins, and could be used to purify

other protein–polymer conjugates without extensive method

development.

27

The activity of CaM was monitored during PEG-



CaM-PEG synthesis and purification using a modified assay for

calcineurin activity, which is dependent on the presence and

concentration of CaM.

28

PEG-CaM-PEG was found to maintain



its activity during each processing step, with the exception of

lyophilization. However, the presence of the sugar raffinose

during lyophilization decreased the loss of CaM activity during

lyophilization (Fig. 1D). These results are consistent with

previous reports, which have shown that CaM is partially

denatured during lyophilization and that raffinose has a protec-

tive effect during lyophilization.

29

It is noteworthy that dynamic



proteins often undergo conformation changes to hide or expose

autoinhibitory domains that regulate another protein’s enzy-

matic activity.

30

Thus, enzymatic activity assays—similar to the



calcineurin-based assay performed herein—could be used to

assess the activity of dynamic proteins in other applications of

dynamic, protein-based materials.

31

The Q



m

of dynamic hydrogels can be tuned by varying 4 of

PEG-CaM-PEG3400 or the ratio of PEG-CaM-PEG3400 to

PEGDA3400. Increasing the 4 of PEG-CaM-PEG3400 hydro-

gels led to a decrease in Q

m

, which may be attributed to an



increased concentration of acrylate groups and increased cross-

linking density. In hydrogels prepared with both PEG-CaM-

PEG3400 and PEGDA3400, increasing the 4 of PEGDA3400

Fig. 1


(A) Schematic representation of the Michael-Type addition reaction between CaM(T34 C, T110C) and PEGDA to form PEG-CaM-PEG

conjugates. (B) MALDI-MS spectra of CaM(T34C, T110C) before and after reaction with PEGDA 575. (C) HPLC chromatogram of CaM(T34C,

T110C) and PEG-CaM-PEG575. (D) The calmodulin-dependent phosphatase activity of calcineurin was used to measure the activity of CaM as

purchased, or the CaM mutant CaM(T34C, T110C) (CaMmut) after different processing steps in the synthesis of PEG-CaM-PEG molecules (n

¼ 2).

This journal is



ª The Royal Society of Chemistry 2009

Soft Matter, 2009, 5, 2399–2406 | 2401



while decreasing the 4 of PEG-CaM-PEG3400 produced

hydrogels with decreasing Q

m

. This observation could be



attributed to the increased crosslinking density of hydrogel

networks


prepared

with


higher

4

of



PEGDA3400,

as

PEGDA3400 molecules have a higher number of acrylate groups



per unit mass compared to PEG-CaM-PEG3400 molecules

(Fig. 2A). These results are consistent with classical Flory–

Rehner theory.

32

The dynamic properties of hydrogels were dependent upon 4



of PEG-CaM-PEG3400 hydrogels and the ratio of PEG-CaM-

PEG3400 to PEGDA3400 in the initial hydrogel formulation.

Pure PEGDA3400 hydrogels underwent no volume change in

response to the addition or removal of TFP, which is consistent

with previous studies by Sui et al. (Fig. 2B).

22,23


Hydrogels

prepared


with

mixtures


of

PEG-CaM-PEG3400

and

PEGDA3400 underwent greater magnitude volume collapses in



response to TFP with increasing fractional mass of PEG-CaM-

PEG3400. This phenomenon could be attributed to the greater

Q

m

of hydrogels with high PEG-CaM-PEG3400/PEGDA3400



ratios, which likely permits greater magnitude volume collapses

compared to hydrogels with lesser Q

m

(Fig. 2A–B). A similar



phenomenon was observed in the 100% PEG-CaM-PEG3400

hydrogels. Specifically, increasing the 4 of PEG-CaM-PEG3400

from 10–20% produced hydrogels with a decreased magnitude of

Fig. 2


Characterization of the influence of the initial concentrations of PEG-CaM-PEG3400 and PEGDA3400 during hydrogel formation on hydrogel

properties. (A) The influence of PEG-CaM-PEG3400 4 on the equilibrium swelling ratio (Q

m

) of swollen and collapsed 5 ml hydrogels. [*-Significant



difference between swollen and collapsed hydrogels (n

¼ 3) p < 0.05]. (B) The dynamic properties of 10% (w/v) hydrogels composed of different initial 4

of PEG-CaM-PEG3400/PEGDA3400 [*-Significant difference between swollen and collapsed hydrogels, † denotes significant difference between

collapsed and recovered hydrogels (n

¼ 3) p < 0.05]. (C) Volume decreases and subsequent recovery of PEG-CaM-PEG3400 hydrogels with different 4

PEG-CaM-PEG hydrogels [*-Significant difference between swollen and collapsed hydrogels, † denotes significant difference between collapsed and

recovered hydrogels (n

¼ 3) p < 0.05]. (D) Volume decreases of PEG-CaM-PEG3400/PEGDA3400 hydrogels with a constant 4 of PEG-CaM-PEG3400

[*-Significant difference between swollen and collapsed hydrogels, † denotes significant difference between collapsed and recovered hydrogels (n

¼ 3)


p < 0.05].

Fig. 3


Absorption of VEGF into protein-based, dynamic hydrogels. (A) VEGF absorption into hydrogels prepared with different 4 of PEG-CaM-

PEG3400, and incubated in a 444 ng/ml VEGF solution. The inlayed schematic represents a PEG-CaM-PEG3400 hydrogel absorbing VEGF from

solution. (B) The crystal structures and isoelectric points of VEGF (PDB : 2VPF) and CaM (PDB : 3CLN). Positively charged amino acids are shown in

red on VEGF and negatively charged amino acids are shown in red on CaM (analyzed with Rasmol Software).

2402 | Soft Matter, 2009, 5, 2399–2406

This journal is

ª The Royal Society of Chemistry 2009


dynamic volume change (Fig. 2C). Again, increasing the 4 of

these hydrogels produces higher crosslinking densities and

a decreased Q

m

, which limits the magnitude of hydrogel volume



collapse. Importantly, hydrogels in which the 4 of PEG-CaM-

PEG3400 was held constant and the 4 of PEGDA3400 was

increased underwent smaller magnitude volume collapses with

increasing PEGDA3400 (Fig. 2D). These results further support

the hypothesis that the magnitude of hydrogel collapse is

modulated by the initial crosslinking density and associated Q

m

.

Interestingly, none of the PEG-CaM-PEG3400 or PEG-CaM-



PEG3400/PEGDA3400 hydrogels recovered to 100% of their

swollen volume. This observation could be attributed to inho-

mogeneous CaM incorporation. Upon hydrogel collapse, local-

ized regions of high [CaM] within the hydrogel may become

insoluble and form aggregates. Another possible explanation

could involve CaM multimerization. CaM has been previously

shown to non-covalently dimerize with an equilibrium dissocia-

tion constant (K

d

) of 570


Æ 70 mM.

33

Although this is a relatively



Fig. 4

Release of VEGF is modulated by protein conformational changes in dynamic, protein-based hydrogels. (A) The total VEGF mass released

from 10% PEG-CaM-PEG3400 hydrogels incubated with or without the ligand TFP, which induces a CaM conformational change. (B) The total VEGF

mass released from 10% PEG-CaM-PEG3400 hydrogels, with TFP added after 24 h to ‘‘trigger’’ VEGF release. (C) Representative micrographs of 10%

4

PEG-CaM-PEG3400 hydrogels in their swollen, collapsed, and recovered state (scale bar



¼ 1 mm).

Fig. 5


Release of VEGF is modulated by protein conformational changes in dynamic, protein-based hydrogels. (A) The total VEGF mass released (left

side) and % of total VEGF released (right side) from PEG-CaM-PEG3400 hydrogels prepared with different 4s. (B) The total VEGF mass released (left

side) and % of total VEGF released (right side) from PEG-CaM-PEG3400/PEGDA3400 hydrogels with different 4s.

This journal is

ª The Royal Society of Chemistry 2009

Soft Matter, 2009, 5, 2399–2406 | 2403



low affinity interaction, there could be significant increases in the

K

d



within the hydrogels due to the avidity effects resulting from

the mM concentrations of CaM used in PEG-CaM-PEG

hydrogels. The resulting non-covalent interactions could prevent

the hydrogels from recovering to 100% of their swollen volume.

The

physiochemical



properties

of

PEG-CaM-PEG3400



hydrogels modulated VEGF absorption, and hydrogel dynamics

had a clear influence on VEGF release. The isoelectric point of

VEGF has been reported to be 8.5

25

and the isoelectric point of



CaM has been reported to be 4.3 (Fig. 3B).

34

Thus, at the pH



of our studies (pH

¼ 6.3) these molecules are likely to undergo

significant charge–charge attraction. This interaction may largely

explain the observation that VEGF absorption is linearly related

to the 4 of PEG-CaM-PEG3400 hydrogels (Fig. 3A). Impor-

tantly, the TFP-induced conformational change in PEG-CaM-

PEG3400

molecules



resulted

in

hydrogel



collapse

and


a concomitant increase in the VEGF release rate (Fig. 4A). The

rate of VEGF release from 10% PEG-CaM-PEG3400 hydrogels

was also increased when TFP was added 24 h after VEGF

absorption, compared to hydrogels that were not exposed to

TFP. This result indicates that an increase in VEGF release can

be ‘‘triggered’’ via exposure to the TFP ligand (Fig. 4B).

Interestingly, increased VEGF release in the presence of the

TFP ligand was observed in every hydrogel formulation that

included PEG-CaM-PEG3400 (Fig. 5A–B). Furthermore, PEG-

CaM-PEG hydrogels released increasing total amounts of VEGF

when the hydrogels could undergo greater dynamic hydrogel

collapse (Fig. 2B–2C, 5A–5B). The increase in release may be

attributed to an increase in fluid pressure within the hydrogel

network upon volume collapse. This conclusion is supported by


Download 0.87 Mb.

Do'stlaringiz bilan baham:
1   2   3   4   5   6   7   8




Ma'lumotlar bazasi mualliflik huquqi bilan himoyalangan ©fayllar.org 2024
ma'muriyatiga murojaat qiling