Nefelometriya. Elektron mikroskopiya ultramikroskopiya tem plastik qismlar elektron mikroskop

NEFELOMETRIYA.ELEKTRON MIKROSKOPIYA ULTRAMIKROSKOPIYA
REJA:

1. 
   NEFELOMETRIYA.ELEKTRON MIKROSKOPIYA ULTRAMIKROSKOPIYA
   
2. 
   TEM - PLASTIK QISMLAR
   
3. 
   ELEKTRON MIKROSKOP
   

TEM - plastik qismlar

Namunadagi suv asta-sekin qatron bilan almashtiriladi, keyin esa qattiqlashadi va namunadan taxminan 100 nm qalinlikdagi bo'laklar kesiladi va yuqori vakuumda TEM ustuniga qo'yiladi. Namunaning kimyoviy tarkibi tubdan o'zgargan, ammo agar davolash yaxshi bajarilsa, hujayralar shakli va hatto ichidagi organellalarning joylashuvi saqlanib qolishi mumkin. Mana, http://www.cellimagelibrary.org/images/7722 dan ushbu texnikaning vakili tasviri. Ribosomalar va mitoxondriyalar bilan endoplazmatik retikulumni ko'rishingiz mumkin.
TEM - CryoEM
Namuna shu qadar tez soviydiki, uning ichidagi va uning atrofidagi suv muz kristallarini hosil qilmasdan qotib qoladi, aks holda bu membranalarni buzadi va hokazo. Namuna uning tabiiy holati bilan deyarli bir xil. Ushbu "vitrifik" namunalarni to'g'ridan-to'g'ri mikroskop ustuniga qo'yish mumkin, ammo ular suyuq azot haroratida saqlanishi kerak. Etarlicha tez sovutilishi mumkin bo'lgan namunaning o'lchami taxminan 300 mikron qalinligi bilan cheklangan. Standart TEM nurlari qalinligi taxminan 200 nm dan ortiq bo'lgan namunalar orqali yaxshi o'tmaydi; kriyo namunalari plastik qismlarga o'xshash tarzda kesilishi mumkin (garchi bu xona haroratiga qaraganda ancha qiyinroq bo'lsa ham) yoki ion nurlarini frezalash orqali. Mana https://www.pnas.org/content/117/16/8941 dan flagellar motorlarini ko'rsatadigan vakili rasm:
Ekologik SEM
Kattaroq namunalarni atrof-muhit SEM (ESEM) da suvsizlanmasdan yoki qoplamasiz tasvirlash mumkin. Ushbu mikroskop elektron tabanca va linzalar uchun yuqori vakuumli kameraga va namuna va detektorlarni o'z ichiga olgan past vakuumli kameraga ega. Bu usul taxminan 10 mm gacha bo'lgan kattaroq namunalarni tabiiy holatiga yaqin tasvirlashi mumkin, ammo TEM usullari kabi yuqori aniqlikda emas. Mana https://forschungsinfrastruktur.bmbwf.gv.at/en/fi/fei-esem-xl30-scanning-electron-microscopy_540 dan kichik baliqni ko'rsatuvchi rasm, tuzilish qanchalik yaxshi saqlanganligini o'zingiz baholaysiz:
Elektron mikroskop
An elektron mikroskop yorug'lik manbai sifatida tezlashtirilgan elektronlar nuridan foydalanadigan mikroskopdir. Elektronning to'lqin uzunligi ko'rinadigan yorug'lik fotonlaridan 100 000 baravar qisqaroq bo'lishi mumkinligi sababli, elektron mikroskoplar yorug'lik mikroskoplariga qaraganda yuqori aniqlik kuchiga ega va kichikroq ob'ektlarning tuzilishini ochib bera oladi. Skanerli transmissiya elektron mikroskopi halqa shaklidagi qorong'u maydon tasvirlash rejimida soat 50 dan yaxshiroq aniqlikka erishdi [1] va taxminan 10 000 000 × gacha kattalashtirishga erishdi, aksariyat yorug'lik mikroskoplari esa 200 nm o'lchamdagi diffraktsiya va 200 × dan past foydali kattalashtirish bilan cheklangan.
Elektron mikroskoplar optik yorug'lik mikroskopining shisha linzalariga o'xshash elektron optik linzalar tizimini yaratish uchun shakllangan magnit maydonlardan foydalanadi.
Elektron mikroskoplar mikroorganizmlar, hujayralar, yirik molekulalar, biopsiya namunalari, metallar va kristalllarni o'z ichiga olgan keng doiradagi biologik va noorganik namunalarning ultrastrukturasini o'rganish uchun ishlatiladi. Sanoatda elektron mikroskoplar ko'pincha sifatni nazorat qilish va nosozliklarni tahlil qilish uchun ishlatiladi. Zamonaviy elektron mikroskoplar tasvirlarni olish uchun maxsus raqamli kameralar va ramka tutqichlari yordamida elektron mikrografiyalarni ishlab chiqaradi.
Elektronlar bilan ko'rish
Foto: Atom ichida: elektronlar yadro (markaz) atrofidagi qobiqlardagi (orbitallardagi) zarralardir.
Biz atrofimizdagi olamdagi narsalarni ko'ra olamiz, chunki yorug'lik nurlari (Quyoshdan yoki boshqa yorug'lik manbasidan, masalan, ish stoli lampasidan) ularni va ko'zlarimizga aks ettiradi. Hech kim yorug'lik nima ekanligini bilmaydi, ammo olimlar uning o'ziga xos bo'linish xususiyatiga ega degan fikrga kelishdi. Ular buni to'lqin-zarrachalar ikkiligi deb atashni yaxshi ko'radilar, ammo asosiy g'oya ko'rinadiganidan ancha sodda. Ba'zan yorug'lik o'zini to'lqinlar poyezdiga o'xshab, dengiz bo'ylab harakatlanadigan to'lqinlarga o'xshaydi. Boshqa paytlarda, agar xohlasangiz, zarrachalar oqimining mikroskopik o'qlarini bombardimon qilishiga o'xshaydi. Siz ushbu so'zlarni kompyuteringiz ekranida o'qishingiz mumkin, chunki yorug'lik zarralari displeydan ko'zingizga qandaydir ommaviy, gorizontal do'l bo'ronida oqmoqda! Biz bu alohida zarrachalarni yorug'lik fotonlari deb ataymiz: ularning har biri elektromagnit energiyaning kichik paketidir.
Agar siz atomlardan kattaroq narsalarni ko'rmoqchi bo'lsangiz, fotonlar bilan ko'rish yaxshi. Ammo agar siz kichikroq narsalarni ko'rishni istasangiz, fotonlar juda qo'pol va foydasiz bo'lib chiqadi. Tasavvur qiling-a, siz yog'och o'ymakorligining ustasi bo'lsangiz, o'zingiz yasagan nozik o'yilgan mebellar bilan butun dunyoga mashhur bo'lgan bo'lsangiz. Bunday nozik detallarni o‘yib olish uchun siz yaratmoqchi bo‘lgan naqshlardan kichikroq, o‘tkir, aniq asboblar kerak bo‘ladi. Agar sizda bor narsa bolg'a va belkurak bo'lsa, murakkab mebellarni o'yib bo'lmaydi. Asosiy qoida shundaki, siz foydalanadigan asboblar siz ishlatayotgan narsalardan kichikroq bo'lishi kerak.
Xuddi shu narsa ilm-fan uchun ham amal qiladi. Mikroskop bilan ko'rishingiz mumkin bo'lgan eng kichik narsa (qisman) u orqali porlayotgan yorug'lik bilan aniqlanadi. Oddiy yorug'lik mikroskopi to'lqin uzunligi taxminan 400&ndash700 nanometr bo'lgan to'lqinlarga ekvivalent bo'lgan yorug'lik fotonlaridan foydalanadi. Taxminan 100 marta kattaroq (diametri 50 000 va ndash 100 000 nanometr) inson sochi kabi narsalarni o'rganish uchun bu juda yaxshi. Ammo uzunligi 200 nanometr bo'lgan bakteriya yoki atigi 10 nanometr uzunlikdagi oqsil haqida nima deyish mumkin? Agar siz "yorug'likdan kichikroq" (fotonlarning to'lqin uzunligidan kichikroq) nozik tafsilotlarni ko'rishni istasangiz, fotonlardan ham qisqa to'lqin uzunligiga ega bo'lgan zarrachalardan foydalanishingiz kerak: boshqacha qilib aytganda, elektronlardan foydalanishingiz kerak. Siz bilganingizdek, elektronlar atomlarning tashqi qismlarini egallagan kichik zaryadlangan zarralardir. (Ular zanjirlar atrofida elektr tokini olib yuruvchi zarrachalar hamdir.) Elektron mikroskopda yorugʻlik nuri oʻrnini elektronlar oqimi egallaydi. Elektron 1 nanometrdan sal ko'proq ekvivalent to'lqin uzunligiga ega, bu bizga yorug'likning o'zidan kichikroq narsalarni (yorug'lik fotonlarining to'lqin uzunligidan kichikroq) ko'rish imkonini beradi.
3. Rang
Eng keng tarqalgan konfiguratsiyalarida elektron mikroskoplar har bir piksel uchun bitta yorqinlik qiymatiga ega tasvirlarni ishlab chiqaradi, natijalar odatda kulrang rangda ko'rsatiladi. Biroq, ko'pincha bu tasvirlar xususiyatni aniqlash dasturidan foydalanish yoki oddiygina grafik muharriri yordamida qo'lda tahrirlash orqali ranglanadi. Bu estetik effekt uchun strukturani aniqlashtirish uchun amalga oshirilishi mumkin va odatda namuna haqida yangi ma'lumotlarni qo'shmaydi.
Ba'zi konfiguratsiyalarda, odatda, bir nechta detektorlardan foydalanish orqali har bir piksel uchun bir nechta namunaning xususiyatlari haqida ma'lumot yig'iladi. SEMda topografiya va moddiy kontrastning atributlarini bir juft orqaga tarqalgan elektron detektorlari yordamida olish mumkin va bunday atributlar har bir atributga boshqa asosiy rang berish orqali bitta rangli tasvirga joylashtirilishi mumkin. Xuddi shunday, orqaga tarqalgan va ikkilamchi elektron signallarining kombinatsiyasi turli xil ranglarga tayinlanishi va bir vaqtning o'zida namunaning xususiyatlarini ko'rsatadigan bitta rangli mikrografga joylashtirilishi mumkin.

SEMda ishlatiladigan detektorlarning ba'zi turlari analitik imkoniyatlarga ega va har bir pikselda bir nechta ma'lumotlarni taqdim etishi mumkin. Misollar, elementar tahlilda ishlatiladigan energiya-dispersli rentgen spektroskopiyasi EDS detektorlari va geologik namunalardagi elektronlar bilan induktsiyalangan luminesansning intensivligi va spektrini tahlil qiluvchi katodolyuminesans mikroskop CL tizimlari. Ushbu detektorlardan foydalanadigan SEM tizimlarida namunaning turli tarkibiy qismlarining taqsimlanishidagi farqlarni aniq ko'rish va solishtirish uchun signallarni rangli kodlash va ularni bitta rangli tasvirga joylashtirish odatiy holdir. Majburiy emas, standart ikkilamchi elektron tasvirni bir yoki bir nechta kompozitsion kanallar bilan birlashtirish mumkin, shuning uchun namunalar tuzilishi va tarkibi solishtirilishi mumkin. Bunday tasvirlar hech qanday tarzda o'zgartirilmagan asl signalning to'liq yaxlitligini saqlagan holda amalga oshirilishi mumkin.

Umumiy bo'yash usullari
Mikroskop ostida mikrobni to'g'ri ko'rish uchun mikrobiologlar hujayralar va tuzilmalarni ta'kidlash uchun bir qator dog'lardan foydalanadilar.
O'quv maqsadlari
In vitro va in vivo bo'yashni solishtiring va taqqoslang
Asosiy paketlar
Asosiy fikrlar
Tirik hujayralarni ko'rsatadigan in-vivo binoni va qo'zg'almas hujayralarni ko'rsatadigan in-vitro binoni ikkalasi ham muhim maqsadlarga ega.
Hujayraning deyarli har qanday xususiyatlarini, hatto hujayra ichidagi organellalarni ajratib ko'rsatishi mumkin bo'lgan mikroblarda ishlatilishi mumkin bo'lgan juda ko'p dog'lar mavjud.
Bo'yash protokollari murakkab bo'lishi mumkin, ammo ular bir nechta asosiy bosqichlarni o'z ichiga oladi: tayyorlash, mahkamlash, bo'yash va o'rnatish.
Asosiy shartlar
sirt faol moddasi: suyuqlikning sirt tarangligini kamaytirishga qodir bo'lgan sirt faol vosita yoki namlovchi vosita, odatda hidrofilik “head” va hidrofobik “quyruq” bo'lgan organik birikmalar.
organella: ma'lum bir hayot jarayonini amalga oshiradigan hujayralar ichida joylashgan maxsus tuzilma (masalan, ribosomalar, vakuolalar)
Bo'yash - bu mikroskopik tasvirda kontrastni kuchaytirish uchun mikroskopiyada qo'llaniladigan usul. Dog'lar va bo'yoqlar ko'pincha mikroblardagi tuzilmalarni ko'rish uchun, ko'pincha turli mikroskoplar yordamida ta'kidlash uchun ishlatiladi. Bo'yoqlar mikroblarning har xil turlarini, hujayra hayotining turli bosqichlarini (masalan, mitotik sikl) va hatto alohida hujayralardagi organellalarni (masalan, mitoxondriyalar yoki xloroplastlar) aniqlash va tekshirish uchun ishlatilishi mumkin.
In-vivo binoni tirik to'qimalarni bo'yash jarayonidir & # 8212 in vivo “hayotda” degan ma'noni anglatadi (farqli ravishda in vitro binoni). Muayyan hujayra yoki struktura qarama-qarshi rang(lar)ga ega bo'lsa, uning shakli (morfologiyasi) yoki hujayra yoki to'qima ichidagi holatini osongina ko'rish va o'rganish mumkin. Odatiy maqsad, aks holda ko'rinmaydigan sitologik tafsilotlarni aniqlashdir, ammo binoni hujayralar ichida ma'lum kimyoviy moddalar yoki o'ziga xos kimyoviy reaktsiyalar sodir bo'lgan joyni ham aniqlashi mumkin. In vitro binoni biologik kontekstidan olib tashlangan hujayralar yoki tuzilmalarni bo'yashni o'z ichiga oladi. Ba'zi dog'lar ko'pincha bitta dog'ning o'zi ochadiganidan ko'ra ko'proq tafsilotlar va xususiyatlarni ochib berish uchun birlashtiriladi va qarama-qarshi bo'yoq asosiy dog' etarli bo'lmaganda hujayralar yoki tuzilmalarning ko'rinishini oshiradigan dog'dir. Olimlar va shifokorlar bo'yashni fiksatsiya va namuna tayyorlash uchun maxsus protokollar bilan birlashtirishi mumkin va ushbu standart usullardan izchil, takrorlanadigan diagnostika vositalari sifatida foydalanishi mumkin.

Turli xil usullarda ishlatilishi mumkin bo'lgan aql bovar qilmaydigan miqdordagi dog'lar mavjud. Quyida tayyorlanish jarayonining umumiy jihatlari keltirilgan in vitro binoni

Fiksatsiya: bu o'zi bir necha bosqichlardan iborat bo'lishi mumkin. Fiksatsiya hujayralar shaklini (bu holda mikroblarni) iloji boricha saqlab qolishga qaratilgan. Ba'zida issiqlik fiksatsiyasi hujayralarni o'ldirish, yopishtirish va dog'larni qabul qilish uchun o'zgartirish uchun ishlatiladi. Ko'pgina kimyoviy fiksatorlar oqsillar va namunadagi boshqa moddalar o'rtasida kimyoviy bog'lanish hosil qiladi va ularning qattiqligini oshiradi. Umumiy fiksatorlarga formaldegid, etanol, metanol va pikrik kislota kiradi.
O'tkazuvchanlik: Bu hujayralarni (odatda) yumshoq sirt faol moddasi bilan davolashni o'z ichiga oladi. Ushbu davolash hujayra membranalarini eritib, kattaroq bo'yoq molekulalarining hujayraning ichki qismiga kirishiga imkon beradi.
O'rnatish: Bu bosqich odatda namunalarni kuzatish va tahlil qilish uchun shisha mikroskop slaydga ulashni o'z ichiga oladi. Ba'zi hollarda hujayralar to'g'ridan-to'g'ri slaydda o'stirilishi mumkin. Bo'shashgan hujayralar namunalari uchun namuna to'g'ridan-to'g'ri slaydga qo'llanilishi mumkin.
Eng sodda qilib aytganda, haqiqiy bo'yash jarayoni namunani (fiksatsiya va o'rnatishdan oldin yoki keyin) bo'yoq eritmasiga botirishni, so'ngra chayish va kuzatishni o'z ichiga olishi mumkin. Ko'p bo'yoqlar, ammo, erimaydigan rangli cho'kma hosil qilish uchun dog 'bilan reaksiyaga kiruvchi kimyoviy birikma — mordan foydalanishni talab qiladi. Ortiqcha bo'yoq eritmasi yuvilganda, mordanlangan dog 'qoladi. Ushbu bosqichda foydalanish mumkin bo'lgan juda ko'p dog'lar mavjud, ular mikroblarning o'ziga xos turlarini bo'yaydiganlardan (quyidagi rasmga qarang) yadro yoki endoplazmatik retikulum kabi hujayraning pastki bo'limlari yoki organellalarini ta'kidlaydiganlargacha. Shu bilan bir qatorda, salbiy binoni qo'llanilishi mumkin. Bu bakteriyalarni bo'yashning oddiy usuli bo'lib, hujayralarni slaydga surtish va keyin nigrosin (qora sintetik bo'yoq) yoki hind siyohini (uglerod zarrachalarining suvli suspenziyasi) qo'llash orqali amalga oshiriladi. Quritgandan so'ng, mikroorganizmlarni yorqin dala mikroskopida ko'rish mumkin, chunki engilroq qo'shimchalar ularni o'rab turgan qorong'u muhitdan yaxshi farq qiladi.
Xlamidiya dog'i: Bakterial patogen xlamidiya hujayralari (strelkalar bilan ko'rsatilgan) “geimsa deb nomlangan dog 'bilan ta'kidlangan. “
Jonli, in-vivo bo'yash mikroskopiyasi tekshiriladigan mikrobni doimo o'ldiradigan fiksatsiya bundan mustasno, ushbu bosqichlarning ko'pini o'z ichiga oladi.


Xulosa
Farmatsevtik formulalarni mikroskopik usullar bilan tavsiflash tizimning haqiqiy morfologiyasi haqida ishonchli ma'lumotlarni olish uchun muhimdir. Kolloid dori vositalarining o'lchamlari diapazoni uzoq vaqt oldin nanometr shkalasining pastki qismiga etib kelganligi sababli, klassik yorug'lik mikroskopiyasi nano o'lchamdagi tuzilmalarni vizualizatsiya qilish uchun etarli ruxsatni ta'minlaydigan elektron mikroskopiya usullari bilan almashtirildi. Haqiqatan ham, elektron mikroskopiyaning yuqori aniqligi va uslubiy ko'p qirraliligi ushbu texnikani nanoemulsiyalarni tahlil qilish uchun ajralmas vositaga aylantirdi. Pastki mikronli diapazonda zarracha o'lchamlari bo'lgan ushbu lipidga asoslangan dori vositalarini etkazib berish tizimlarining mikroskopik tahlili emulsiya tomchilarining hajmi, shakli va ichki tuzilishi haqida muhim ma'lumotlarni beradi. Bundan tashqari, zarrachalar hajmini o'lchashda sezilmaydigan lipozomalar yoki ko'p qatlamli tuzilmalar kabi sirt faol moddalar agregatlari shu tarzda aniqlanishi mumkin. Ushbu sharh nanoemulsiyalarni tavsiflashda qo'llaniladigan transmissiya elektron mikroskopiyasi (TEM) va skanerlash elektron mikroskopiyasi (SEM) usullari haqida qisqacha ma'lumot beradi. TEM va SEM uchun namunalarni tayyorlashning murakkab krio texnikasi alohida qiziqish uyg'otadi, ular nanoemulsiyalarning tabiiy holatida yuqori sifatli tasvirlarni beradi. Barcha taqdim etilgan usullar uchun asboblar va namunalarni tayyorlash haqida umumiy ma'lumot berilgan. Muhim amaliy jihatlar, xato manbalari va keng tarqalgan artefaktlar, shuningdek, so'nggi uslubiy yutuqlar muhokama qilinadi. Nanoemulsiyalarning elektron mikroskopik tadqiqotlarining tanlangan namunalari ushbu texnikaning batafsil va aniq ma'lumotlarni ochish imkoniyatlarini ko'rsatish uchun taqdim etiladi.