Оптические методы количественного анализа

Способ расчета результатов фотометрии по коэффициентам пересчета
Является наиболее простым и быстрым. Формула: С=F x E, где С - концентрация исследуемого компонента,
F - коэффициент пересчета, Е - экстинция.
Коэффициент пересчета является величиной специфической для каждого отдельного теста. Обычно указывается в описании метода исследования. Можно рассчитывать самому на основании исследования стандартных растворов. За основу можно взять ранее построенный калибровочный график. Коэффициенты требуют проверки не реже 1 раза в год.
Коэффициенты используются в анализаторах. Они вводятся в память компьютера и выдаются автоматически.


Методы оценки результатов фотометрии
по конечной точке (измерение в конечной точке) - учет образования продукта за некоторое время инкубации. Расчет результатов по стандарту.
по фиксированному времени - требуется применение фотометров с термостатируемыми кюветами. Устанавливается количество нарабатываемого (расходуемого) продукта за определенный промежуток времени, расчет концентрации по стандарту.
кинетически (кинетическое измерение) - производят измерение оптической плотности через определенные интервалы времени. Используется для ферментативных методов
Особенности эксплуатации фотометрической аппаратуры
Показания фотометров можно снимать в единицах оптической плотности или в процентах поглощенного или прошедшего света относительно фоновых величин (шкалы разных цветов). Во всех, предназначенных для измерений оптической плотности приборах, наибольшая точность достигается при значениях экстинции около 0,3, т.е. когда проходит примерно половина падающего света. По мере удаления в ту или другую сторону точность измерения уменьшается!
Экстинция раствора есть произведение его концентрации на толщину слоя раствора. Оптимальны в смысле чувствительности, точности и удобства кюветы с длине оптического пути 1 см.
Точность фотометрии значительно возрастает при использовании проточных кювет.
Основные источники ошибок при фотометрии
1).Работа с растворами, имеющими слишком высокую
(более 1) или слишком низкую (менее 0,3) оптическую плотность резко увеличивает погрешность измерения.
2). Для фотометрии пригодны лишь прозрачные растворы. Мутные растворы рассеивают свет и снижают достоверность измерений. Мутные окрашенные растворы использоваться не должны.
Рефрактометрия
Метод основан на измерении показателя преломления света при прохождении его через оптически неоднородные среды.
Пример – определение общего белка в сыворотке. В лаборатории используется мало.
Поляриметрия
Основан на способности веществ в растворе изменять плоскость поляризованного луча света. Пример – лазерный поляриметр для определения глюкозы в моче. В КЛД применяется мало.

ОПТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА

Оптический количественный анализ базируется на регистрации изменений, происходящих с лучом света при прохождении его через исследуемый раствор, а именно: интенсивности поглощения — абсорбционная фотометрия; свечения молекул и атомов вещества — флюоримет-рия, пламенная фотометрия; отклонения от первоначального направления распространения монохроматического светового потока — рефрактометрия; изменение угла вращения плоскополяризованного света.
В соответствии с этим оптические методы количественного анализа подразделяются на;
1) рефрактометрию,
2) поляриметрию,
3) фотометрию:
а) абсорбционную: спектрофотометрию, нефелометрию (собственно нефелометрию и турбидиметрию, все более широко используемую в настоящее время иммунотурби-диметрию),
б) эмиссионную: флюориметрию, пламенную фотометрию.
Метод рефрактометрии состоит в определении содержания вещества в растворе путем измерения показателя преломления света. Ранее он применялся в основном для установления содержания общего белка в плазме (сыворотке) крови. Поскольку преломляющая способность сыворотки зависит от содержания не только белков, но и небелковых компонентов, метод давал некорректные, завышенные результаты.
В основе поляриметрии лежит свойство прозрачных веществ вращать плоскость поляризованного луча света.
Известно, что естественный, неполяризованный луч представляет собой совокупность волн, колебания векторов электрического и магнитного полей которых происходят вдоль множества плоскостей, проходящих через линию распространения луча. Если луч сложного (белого) света пропустить через пластинку поляроида или призму Николя (кальцит), то такой луч разложится на составляющие, направленные по взаимно перпендикулярным осям поляроида (рис. 74). Поскольку поляризующий материал обладает способностью поглощать одну из этих составляющих, электромагнитные колебания в выходящем пучке света происходят только в одной плоскости, в связи с чем такой луч света называют плоскополяризованным. Если на его пути поместить второй поляроид, то через него подобным же образом пройдет только та составляющая луча, плоскость колебаний которой будет параллельна оси поляроида. Поскольку в пучке поляризованного света колебания совершаются только в одном направлении, при повороте второго поляроида (называемого анализатором) на 90° мощность светового пучка падает до нуля. Очевидно, поляризованный луч света будет проходить через две призмы Николя только в том случае, если их оси находятся в одной плоскости.
Ранее в клинико-лабораторной практике широко применялся поляриметр,
Более 80% используемых в клинико-диагностических лабораториях методов биохимического исследования базируется на принципе абсорбционной фотометрии. Для уяснения особенностей проведения этого вида фотометрического анализа требуются определенные сведения из области природы света и его взаимодействия с веществом.
1. СВЕТ И ЕГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С ВЕЩЕСТВОМ
Световые волны — одна из форм электромагнитного излучения, характеризующаяся частотой V, длиной волны А, и постоянной скоростью распространения в вакууме (с, 300 000 км/с). Эти величины связаны одна с другой сле-
с дующим отношением: у = —.
При взаимодействии света с веществом могут иметь место два случая.
1) Свет, проходя через вещество, поглощается очень слабо: вещество достаточно прозрачно. Отношение скорости света в вакууме к его скорости в данном веществе составляет показатель преломления этого вещества. Поскольку он во многом зависит от длины волны, свет при прохождении через прозрачную призму разлагается в спектр (по длинам волн). По обе стороны от видимого спектра располагаются невидимые лучи: инфракрасные и ультрафиолетовые.
2) Согласно квантовой теории, энергия света поглощается порциями, квантами. При этом отдельные молекулы, обладающие совокупностью близкорасположенных энергетических уровней, могут, поглощая кванты света, переходить с относительно низкого энергетического уровня на более высокий. Оказавшись в таком «возбужденном» состоянии, они способны флюоресцировать или претерпевать фотохимические изменения. В результате возбуждения сложных атомов испускаются электромагнитные волны самых разнообразных частот, образующие спектр испускания.
В зависимости от состояния излучающего тела он может быть сплошным или линейчатым. Так, сплошной
2) Согласно квантовой теории, энергия света погло­щается порциями, квантами. При этом отдельные моле­кулы, обладающие совокупностью близкорасположенных энергетических уровней, могут, поглощая кванты света, переходить с относительно низкого энергетического уровня на более высокий. Оказавшись в таком «возбужденном» состоянии, они способны флюоресцировать или претер­певать фотохимические изменения. В результате возбуж­дения сложных атомов испускаются электромагнитные волны самых разнообразных частот, образующие спектр испускания.
В зависимости от состояния излучающего тела он может быть сплошным или линейчатым. Так, сплошной спектр испускания дает раскаленная вольфрамовая нить, спектр линейчатый имеют газы, пары ртути (рис, 75).
Вещество поглощает те длины волн проходящего света, которые само способно излучать в определенных условиях. Так образуется спектр поглощения.
Электронные спектры молекул обычно охватывают область электромагнитных излучений с длиной волны от 100 до 800 нм. Видимая область, воспринимаемая человеческим глазом, соответствует интервалу длин волн от 400 до 760 (800) нм. Интервал между 200 и 400 нм называется ближней ультрафиолетовой областью, а область длин волн меньше 200 нм носит название далекой, или вакуумной, ультрафиолетовой области.
Указанный диапазон электромагнитных излучений создается при «возбуждении» электронов, располагающихся на внешнем электронном слое. В случае, если «возбуждаются» электроны внутреннего слоя (например потоком быстролетящих электронов в трубке Рентгена), то испускаются рентгеновские лучи (с длиной волны от 0,001 до 1 нм).
2. АБСОРБЦИОННАЯ ФОТОМЕТРИЯ
Абсорбционный фотометрический анализ основывается на физической способности веществ избирательно поглощать монохроматический поток световой энергии. Характер и степень светопоглощения раствора оказывают влияние на окраску, которая, в свою очередь, непосредственно связана с концентрацией вещества в растворе.
Определение интенсивности потока световой энергии, прошедшего через исследуемый раствор, всегда производится относительно раствора сравнения, при приготовлении и исследовании которого применяются растворитель и кюветы, аналогичные используемым в опытном
образце. Вследствие этого поглощение светового потока стенками кюветы и отражение его в окружающую среду кюветой и растворителем могут не приниматься во внимание.
Зависимость между ослаблением интенсивности параллельно направленного монохроматического светового потока, толщиной поглощающего слоя и концентрацией выражается объединенным законом Бугера — Ламберта — Беера: Д = /0 х 106/'", где /г — интенсивность света, прошедшего через раствор, /0 — интенсивность падающего на раствор света, / — толщина слоя раствора в см, с — концентрация поглощающего свет вещества; е — коэффициент поглощения (абсорбции, экстинкции), являющийся коэффициентом пропорциональности и показывающий, какая часть светового потока поглощается раствором толщиной 1 см. Если концентрация раствора составляет 1 моль/л и / = 1 см, то Е = А.
Логарифм отношения /0Д представляет собой величину абсорбции, или оптическую плотность вещества
(раствора), обозначаемую буквой А: А = 1$~ - е/с. *1
Отношение интенсивности монохроматического потока излучения, прошедшего через исследуемый объект, к интенсивности первоначального светового потока именуется пропусканием, или прозрачностью (светопроницаемостью), раствора и обозначается буквой Т. Обычно величину Г выражают в процентах: Т' (%} = 7(//0 х 100%.
Светопроницаемость раствора дает представление о том, какая часть светового потока проходит через раствор, а оптическая плотность характеризует долю поглощаемого света. Характерно, что оптическая плотность показывает величину свето поглощен и я безотносительно к абсолютной величине интенсивности падающего на кювету монохроматического светового потока.
Прямо пропорциональная зависимость между величинами, характеризующими процесс абсорбции, толщиной поглощающего слоя и концентрацией вещества в растворе может быть получена только при постоянном
Рис. 76. Устройство (а) и характеристика пропускания (б) типичного
интерференционного фильтра: / — полупрозрачная пленка (толщиной
в полдлины волны), X — длина волны в максимуме, Т — пропускание в
максимуме, б — полуширина
ставляют собой обычно стеклянную пластинку, на которую нанесены две (или более) полупрозрачные металлические пленки, разделенные слоем прозрачного вещества. Рису­нок, на котором представлен поперечный разрез интер­ференционного светофильтра, показывает, что часть па­дающего излучения подвергается многократкому внут­реннему отражению слоями серебра. Лучи, исходящие вправо от пластинки, будут усиливать друг друга только при тех длинах волн, которые вдвое больше расстояния между слоями серебра. Для других длин волн лучи будут ослаблять друг друга. Типичная кривая пропускания све­тофильтра показана на рис. 76.
Как видно, в отличие от обычного, интерференцион­ный светофильтр пропускает практически монохромати­ческий световой поток. Помимо того, что выделяют уз­кие полосы с относительно высоким пропусканием, ин­терференционные светофильтры обладают большой тер­моустойчивостью: последнее связано с тем, что они не поглощают, а отражают не прошедший через них свет. Благодаря данному свойству их можно применять с вы­сокоинтенсивными источниками света.
Рис. 77. Принципиальная схема электронного фотоумножители
Самым лучшим способом выделения узких спек­тральных интервалов является применение монохромато-ров, устроенных на базе призмы или дифракционной ре­шетки. При использовании источника света, излучаю­щего сплошной спектр, такие устройства позволяют по­лучать практически любую длину волны.
В качестве основных приемников излучения в ультрафиолетовой, видимой и ближней инфракрасной областях спектра применяют фотоэлементы, фотосопротивления и фотоумножители.
Принцип действия фотоэлементов основан на явлении фотоэффекта, которое заключается в том, что при действии света вещество (представленное обычно одновалентным металлом: цезием и др.) испускает электроны, которые в безвоздушном пространстве лампы устремляются со стороны фотокатода к аноду.
На практике выделяют два типа фотоэлементов: с внешним и внутренним фотоэффектом. Фотоэлементы с внешним фотоэффектом могут быть вакуумными и газонаполненными. Вакуумные фотоэлементы обладают значительно меньшей интегральной чувствительностью (микроамперы/люмен), чем газонаполненные, так как наполнение газом вызывает усиление фототока вследствие ионизации газа фотоэлектронами.
Освобождение электронов происходит не только в металлах, но и в полупроводниках, что увеличивает их электропроводность при освещении. Фотоэлементы с внутренним фотоэффектом носят название фотосопротивлений. Широкое применение нашли фотоэлементы с запирающим слоем, которые, обладая высокой чувствительностью, не требуют внешнего источника напряжения.
Фотоумножитель — весьма совершенный тип фотоэлектрического приемника света высокой чувствительности. Он включает фотоэлемент с внешним фотоэффектом, дающий фототок, который усиливается вследствие вторичной электронной эмиссии. Вторичная электронная эмиссия заключается в том, что при ударе о поверхность вещества падающий электрон выбивает из него несколько новых электронов, называемых вторичными. Схема фотоумножителя приводится на рис. 77. Наиболее широко фотоумножители используются в приборах для эмиссионной фотометрии (флюориметры и др.).
3. ОПТИЧЕСКИЕ ИЗМЕРИТЕЛЬНЫЕ ПРИБОРЫ
К оптическим измерительным приборам, используемым в клинической лабораторной диагностике, относятся
— фотометры и спектрофотометры;
— денситометры, предназначающиеся для сканирования, т. е. количественного определения содержания разделенных на носителях (хроматографической бумаге, пленках ацетатцеллюлозы, геле, пластинах с тонким слоем силикагеля) веществ;
— нефелометры и турбидиметры, позволяющие судить о содержании взвешенных частиц в объеме жидкости по интенсивности светорассеяния (используются, в частности, для оценки выраженности коллоидно-осадочных реакций);
— флюориметры, применяемые для определения концентрации сложных органических веществ (витаминов, гормонов и др.) путем измерения интенсивности флюоресценции (в том числе поляризационные);
— люминометры, измеряющие количество излученного света (светосумму), зависящее от содержания в биологических жидкостях некоторых веществ (ацилгидро-перекиси и других), при разложении которых ионами металлов переменной валентности либо другими реактивами происходит кратковременное излучение света;
— пламенные фотометры, используемые для измерения интенсивности светоизлучения (эмиссии) внесенных в пламя ионов металла;
— атомные абсорбциометры, определяющие содержание ионов металлов (в том числе относящихся к микроэлементам) в разных биологических жидкостях; при измерениях, как и в методе фотометрии пламени, анализируемый раствор вводится в пламя в виде аэрозоля с помощью распылителя. Однако измеряется не излучение, а поглощение монохроматического светового потока атомами исследуемого элемента. Метод позволяет определить содержание элементов, находящихся в пламени в виде свободных атомов;
— атомно-эмиссионные многоканальные спектрометры. Методика исследования на приборах такого типа сводится к следующему. Подготовленная к анализу проба помещается в камеру, где под действием электрического разряда вещество испаряется, а его атомы возбуждаются. Излучаемый атомами световой поток специальной опти-
ческой системой направляется в полихроматор, где происходит его разложение по спектральным составляющим. Регистрация спектра осуществляется с помощью оптического многоканального анализатора, что позволяет по оценке интенсивности или площади спектральных линий установить содержание 10 и более химических элементов в одной пробе.
Фотометры. На измерительном барабане широко распространенных в прошлом фотометров (типа ФЭК М, ФЭК Н 57 и др.) шкала оптических плотностей обозначена красным цветом, а шкала пропускания — черным.
Если оптическая плотность раствора соответствует 1, то через его слой проходит 10% интенсивности падающего светового потока (остальные 90% поглощаются). Для большинства современных автоматизированных приборов это крайне большая величина, превышение которой не гарантирует получения надежных результатов измерения. Во всех выпускавшихся ранее фотометрах наибольшая точность измерения достигается при значениях абсорбции около 0,3 (в этом случае через раствор проходит половина падающего на него светового потока); по мере ее снижения точность измерения, а следовательно, и достоверность полученных результатов уменьшаются.
Полученное значение абсорбции (оптической плотности) есть произведение величины концентрации на толщину слоя раствора. Практически одинаковые показатели экстинкции получают при фотометрии исходного раствора в кювете с длиной оптического пути 1 см и того же раствора, предварительно разведенного в 2 раза, но в кювете с длиной оптического пути 2 см. К повышению чувствительности измерения приводит удлинение оптического пути за счет сокращения поперечного сечения кюветы (при этом объем раствора остается прежним). Однако возможности этого приема фотометрии ограничены: чем уже и длиннее кювета, тем более высокие требования предъявляются к фокусировке и юстировке луча света. Поэтому большинство клинико-биохимических исследований рассчитано на проведение измерений в кювете с длиной оптического пути 1 см; значительно реже используется кювета с длиной оптического пути 0,5 см, еще реже — кюветы с длиной оптического пути 2 см. Следует стремиться к тому, чтобы фотометрия осуществлялась в кюветах с толщиной слоя 1 см: доказано, что этот режим фотометрии самый выигрышный. Повышение чувствительности фотометрического исследования обычно достигается путем использования особых по конструкции (узких и длинных) кювет, позволяющих значительно уменьшить объем фотометрируемого раствора. Однако нужно иметь в виду, что при уменьшении объема раствора до величины меньше 0,5 мл точность фотометрического измерения снижается и возрастает вероятность появления ошибки. В большинстве современных биохимических анализаторах используются кюветы с длиной оптического пути 1 см при объеме внесенной в них жидкости 0,5—1,0 мл.
Благодаря использованию проточных кювет точность фотометрии значительно возрастает, поскольку отпадает необходимость каждый раз вынимать кювету для заполнения ее новой порцией исследуемого раствора, что сделало процедуру измерения также и более быстрой и удобной (спектрофотометр «СОЛАР» РУ 1251 С, «Кормей Плюс»),
Фотометрические приборы представлены обычными фильтровыми фотометрами и спектрофотометрами, в которых отдельные участки спектра выделяют при помощи призм или диффракционных решеток; это позволяет установить любую длину волны в весьма большом диапазоне (спектрофотометры типа СФ 4, СФ 26, СФ 46, РУ 1251 С «СОЛАР» и др.).
При выполнении клинико-биохимических исследований фотометрия чаще всего проводится в области длин волн 400—700 нм. Особенно широко распространена регистрация содержания никотинамидадениндинуклеотида (восстановленного) НАД'Н2 и никотинамидадениндинук-леотидфосфата (восстановленного) НАДФ-Н2 по поглощению света с длиной волны 340 нм, т. е. в ближнем ультрафиолетовом диапазоне. Для фотометрических измерений в видимой и ближней инфракрасной области пригодны кюветы из обычного стекла; для регистрации оптической плотности раствора в ближней ультрафиоле-
товой области нужны кюветы из специальных сортов стекла, так называемого увиолевого, в коротковолновой ультрафиолетовой области годятся только лишь кюветы из кварца и сапфира.
При выполнении фотометрических исследований оценку результатов чаще всего производят тремя способами:
1) по конечной точке (измерение в конечной точке),
2) по фиксированному времени (примером может служить прямой псевдокинетический метод Яффе),
3) кинетическим (кинетическое измерение).
Определение по конечной точке состоит в учете образования продукта за некоторое (порой относительно длительное) время инкубации. Для расчета результатов требуется параллельное проведение стандартной пробы.
Способ исследования по методологии фиксированного времени основан на установлении количества нарабатываемого (расходуемого) продукта за определенный промежуток времени с последующим расчетом концентрации (активности) по стандарту. Он осуществляется на фотометрах с обычными светофильтрами или спектрофотометрах (типа «СОЛАР»), оснащенных термостатированным кюветным отделением.
Кинетический метод исследования, как и предыдущий, является ферментативным. Выполняется с применением строго монохроматизированного светового потока (фотометров с интерференционными светофильтрами или спектрофотометров) и использованием термостати-руемой кюветы (при температуре 25, 30 "С и, чаще всего, 37 °С). После старта реакции через определенный интервал времени (например 60 с троекратно) находят изменение оптической плотности, из полученных значений рассчитывают среднюю величину и с использованием определенных (соответствующих температуре инкубации) коэффициентов производят расчет с выражением результатов в ЕД/л (кат/л) и их производных.
Методы второй и особенно третьей группы обладают рядом существенных преимуществ перед одноточечными (конечной точки): их выполнение занимает мало времени, они не связаны с применением агрессивных жидко-стей, точны, позволяют получать достоверные результаты (в особенности при исследовании активности ферментов, когда, к тому же, не требуется разводить в определенное количество раз сыворотку крови для предотвращения эффекта «разбавления» при гиперферментемии). Подав­ляющее их большинство базируется на использовании оптического теста Варбурга, состоящего в ферментатив­ном (с участием лактатдегидрогеназы) превращении НАД-Нч в НАД (и наоборот), существенно отличающихся величиной оптической плотности при длинах волн 340, 334, 365 нм.

Этот принцип исследования положен, в частности, в основу ферментативного, с участием лактатдегидрогеназы (ЛДГ) определения пировиноградной (ПВК) и молочной (МК) кислот (по катализируемой этим энзимом прямой и обратной реакции).
При определении содержания разнообразных субстра­тов и метаболитов реакций и активности многих фермен­тов стараются, чтобы они «замыкались» на превращении ПВК в МК (и наоборот) с участием лактатдегидрогеназы и НАД (НАД-Н₂). Так, в методике установления активно­сти аланинаминотрансферазы используются следующие реакции:

-"-*, I
Наряду с ЛДГ находит применение и малатдегидроге-наза (МДГ).
В настоящее время с использованием оптического те­ста Варбурга определяется активность более 100 фермен­тов.
208
Чтобы избежать необходимости осуществлять измерения в ультрафиолетовом световом потоке (что выполнимо лишь с применением специальных дорогостоящих анализаторов), в реакционную смесь добавляют вещество, приобретающее способность излучать свет в видимой области спектра. Образующийся в результате ферментативной реакции НАД-Н2 и НАДФ-Н2 восстанавливают индикатор формазан с образованием окрашенного продукта, количество которого легко определять колориметрически. Примером этого может служить определение активности лактатдегидрогеназы:




В приведенной выше схеме резоруфин (окрашенный продукт) флюоресцирует в 100 раз сильнее НАД-Н2-
Еще более удобны прямые колориметрические методы с использованием тио-НАД (ТНАД-Нз) и тио-НАДФ (ТНАДФ-Н2). При восстановлении этих производных они окрашиваются в желтый цвет и могут быть определены в коротковолновой области спектра (398 нм). Ход ферментативных реакций можно регистрировать методами флюориметрического анализа, в 100—1000 раз более чувствительными, чем колориметрические. Они обычно основаны на собственной флюоресценции пиридинкофер-ментов (НДД-Н2 и НАДФ-Н2). Однако благодаря использованию флюоресцирующих индикаторов (флюоресцен-тной редоксиндикаторной цепи)



Применяя бактериальную люциферазу, можно получить продукт, флюоресценция которого в 1000 раз превышает флюоресценцию НАД -Н2.
4. НЕФЕЛОМЕТРИЯ, ТУРБИДИМЕТРИЯ
Нефелометрия — это вид оптического анализа, в основе которого лежит измерение интенсивности светового потока, рассеиваемого в направлении, почти перпендикулярном направлению падающего пучка. Светорассеяние имеет место в том случае, если размеры рассеивающих частиц превышают длину волны электромагнитного излучения. Чем мутнее дисперсная система, тем сильнее она рассеивает свет. В определенных условиях наблюдается пропорциональная зависимость между содержанием частиц во взвеси (либо капелек в эмульсии) и ее мутностью. Иначе говоря, принцип нефелометрии заключается в измерении количества света, рассеиваемого частицами в жидкой среде. Оптимальные условия его применения состоят в использовании растворов низкой концентрации.
Турбидиметрия представляет собой широко используемую в клинике-лабораторий и практике разновидность нефелометрии. При турбидиметрии оценивается непрозрачность фотометрируемой системы по измерению степени абсорбции проходящего через нее светового потока. Поглощение монохроматического светового потока происходит в случае, если длина волны электромагнитного излучения оказывается значительно меньше, чем размеры частиц. Турбидиметрия — менее чувствительный метод по сравнению с собственно нефелометрией, поскольку для турбид и метрического анализа используются среды с относительно большим содержанием частиц в единице объема.
Если при использовании собственно нефелометрии падающий на кювету монохроматический световой поток и приемник излучения (фотоэлемент) находятся под прямым (или близким к нему) углом, то при применении турбидиметрии источник света и приемник излучения располагаются на одной линии. Это и позволяет использовать многие фотометры в качестве и колориметров, и
нефелометров (ФЭК 56, ФЭК Н57 и др.). В приборах такого типа имеется специальный светофильтр для нефе-лометрических определений, с максимумом пропускания
около 590 нм.
В настоящее время собственно нефелометрия в клинической лабораторной диагностике используется редко: она выполняется с применением дорогостоящих приборов, например лазерных нефелометров.
В последние годы турбидиметрический анализ находит все более широкое применение в лабораторной практике. Если раньше он использовался в основном для оценки проб коллоидной устойчивости (тимоловая, цинк-сульфатная, проба Вера, Бурштейна и Самая), то в настоящее время — для исследования системы свертывания крови (коагулометры, агрегометр отечественного предприятия «СОЛАР» и других фирм). По анализу агрегато-грамм можно судить об изменениях структур но-функциональных свойств тромбоцитов, характерных для определенных заболеваний.
В последние годы в практику клинико-лабораторного обследования пациентов широко внедряются технологии иммунотурбидиметрических исследований, направленных на оценку иммунного статуса организма и установление содержания в плазме (сыворотке) крови так называемых специфических белков (в том числе белков «острой фазы»), что имеет большое значение для диагностики, оценки эффективности лечения и прогноза различных заболеваний внутренних органов.
Методы лазерной нефелометрии и иммунотурбиди-метрии основываются на регистрации протекающей в жидкой среде реакции «антиген — антитело», сопровождающейся образованием соответствующего преципитата. О ходе реакции можно судить как по установлению степени мутности системы «в конечной точке» (т. е. через вполне определенный промежуток времени — статическая нефелометрия), так и кинетически — по динамике нарастания этих эффектов.
Все определяемые методом нефелометрии (иммуно-турбидиметрии) вещества представляют собой белки, содержащиеся в основной внеклеточной жидкости — плаз-
ме (сыворотке) крови в относительно большом количестве. Среди них: 1) факторы гуморального иммунитета: иммуноглобулины А, С,М,СЗиС4 компоненты комплемента, х- и /^-цепи, пропердиновый фактор В; 2) специфические белки (белки «острой фазы»): а-1-кислый гликопротеин, а-1-антитрипсин, а-2-макроглобулин, р-2-микроглобулин, церулоплазмин, гаптоглобин, С-реактив-ный белок, трансферрин, ревматоидный фактор, орозо-мукоид, преальбумин; 3) апопротеины (белковый компонент атеро- и антиатерогенных липопротеинов): апопро-теин А 1, апопротеин В; 4) другие белки плазмы (альбумин); 5) белки мочи (микроальбумин).
Таким образом, нефелометрический анализ в настоящее время включает в себя многие виды инструментальных лабораторных исследований, а именно: иммунотурбидиметрию, лазерную нефелометрию, агрегатометрию, коагулометрию.
В 1969—1973 гг. КйсЫе ег а1. разработали систему автоматизированной нефелометрии, с помощью которой исследуется содержание белков не только в плазме (сыворотке) крови, но и в моче, спинно-мозговой, суставной и амниотической жидкостях.
5. ЭМИССИОННЫЙ АНАЛИЗ: ФЛЮОРИМЕТРИЯ
И ПЛАМЕННАЯ ФОТОМЕТРИЯ. АТОМНО-ЭМИССИОННЫЙ СПЕКТРАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ
В клинической химии в последние годы наряду с методами абсорбционного молекулярного спектрального анализа все более широко применяются методы эмиссионного анализа (эмиссия — излучение), основанные на способности многих органических веществ (фенолов, ароматических аминов, полициклических соединений, сопряженных полиаминов и др.) люминесцировать, т. е. давать характерный спектр испускания при освещении исследуемого образца ультрафиолетовым или другим коротковолновым излучением (флюориметрия), а также ряда простых веществ (металлов: макро- и микроэлементов) испускать свет при помещении анализируемого образца в источник высокой температуры (пламенная фотометрия, атомно-эмиссионный спектральный анализ).
Приборы, использующиеся для измерения концентрации вещества по интенсивности его флюоресценции (т. е. вторичного излучения, возникающего в ответ на облучение анализируемого вещества светом с более короткой длиной волны), именуются флюориметрами. В отличие от фотоэлектроколориметров в них всегда используется источник ультрафиолетового света, монохромати-зация световых потоков (возбуждение и испускание) достигается применением интерференционных светофильтров или монохроматоров. Исследуемый раствор вносится в кварцевую кювету, приемник излучения (фотоумножитель, ФЭУ) располагается под прямым углом к возбуждающему флюоресценцию монохроматическому световому потоку, а возбуждаемый в ФЭУ сигнал подается либо непосредственно на чувствительный гальванометр, либо после предварительного усиления — на стрелочный или цифровой прибор, печатающее устройство.
Методы этой группы характеризуются исключительно высокими чувствительностью и избирательностью благодаря применению процедуры предварительного отделения анализируемого продукта от других веществ, обладающих близкой химической структурой; преобразованию его в соединение, отличающееся более высоким квантовым выходом (что осуществляется, например, в тригидроксииндоловом методе определения катехола-минов); использованию такой узкой области ультрафиолетового (монохроматического) света, в которой возбуждается флюоресценция лишь интересующего исследователя метаболита; а также благодаря существенным различиям в максимумах спектров возбуждения и флюоресценции продуктов с несколько разной химической структурой и весьма малой вероятности того, что в содержимом кюветы флюориметра имеются два или более вещества, способных излучать в выбранном режиме возбуждения флюоресценции. Применение же для регистрации свечения ФЭУ и усилителей «снимаемого» сигнала придает методам флюоресцентного анализа весьма большую чувствительность.
К настоящему времени завершены государственные испытания первого отечественного универсального высо-
кочувствительного флкюриметра для клинической лабораторной диагностики. Этот прибор («ФЛЮОТЕСТ») позволит осуществлять все виды клинико-биохимических исследований методами ультра- и субмикроанализа, в том числе и те, которые не могут быть выполнены с применением абсорбционной фотометрии. Он заключает в себе набор светофильтров, позволяющий производить исследования биологически активных веществ (катехоламинов, гис-тамина и др.), гормонов (11 оксикортикостероидов), витаминов (группы В, Е и др.), атерогенных липопротеинов (при использовании флюоресцентного зонда), порфиринов, ферментов (активности аспартатаминотрансферазы, алани-наминотрансферазы и др.), субстратов и т. д.
Пламенная фотометрия — вид исследования, используемый для определения содержания электролитов и некоторых других элементов, атомы которых способны возбуждаться и испускать свечение в высокотемпературном пламени газовой горелки. Принцип определения состоит в следующем. Растворенный в воде образец (биологический материал) вводят в пламя посредством распылителя. В случае достаточно высокой температуры пламени внешние электроны атома, получая часть тепловой энергии, переходят на более высокие энергетические уровни. В возбужденном состоянии атомы способны пребывать весьма непродолжительное время. При возвращении возбужденных электронов на исходный стационарный уровень поглощенная ими энергия выделяется в виде световых квантов. Длина волны испускаемого света, зависящая от структуры электронной оболочки атома, отражает химическую природу элемента.
Если свет пламени, в котором находятся атомы металлов, разложить с помощью призмы в спектр, то он окажется линейчатым (спектр испускания). По интенсивности свечения его основной, так называемой характеристической, линии, выделяемой с помощью интерференционного светофильтра, можно судить о количественном содержании элемента в исследуемой биологической жидкости.
Основными ограничениями в исследовании спектра элементов являются: сравнительно низкая температура пламени (недостаточная для возбуждения свечения атомов множества элементов) и безызлучательные переходы. Для достижения высокой температуры пламени используют различные горючие газы: бутан или пропан, — хотя лучший тепловой эффект отмечается при использовании ацетилена или водорода. В качестве окислителя обычно применяют подаваемый под давлением (компрессором) атмосферный кислород.
Одна из наиболее важных областей применения пламенной фотометрии — одновременное определение натрия и калия (а иногда и кальция, лития). Эти элементы возбуждаются значительно легче остальных, и характеристические линии их спектра излучения четко отделены друг от друга. При применении более «горячего» пламени и чувствительных регистрирующих устройств становится возможным анализировать до 50 элементов.
Интенсивность излучения на длине волны, характерной для определяемого элемента, практически пропорциональна концентрации соответствующих катионов.
Пламенная фотометрия осуществляется с применением специального прибора, именуемого пламенным фотометром.