O’zbekiston respublika xalq ta’lim vazirligi muqimiy nomidagi qo’qon davlat pedagogika instituti kimyo-biologiya fakulbteti Umumiy biologiya kafedrasi mikrobiologiya fanidan laboratoriya mashg’ulotlari tuzuvchi: S. Yuldasheva Qo’qon-2008 y


LABORATORIYA MASHG’ULOTI Oziq muhiti va idishlarni sterillash hamda mikroorganizmlarni parvarish qilish va shu maqsad uchun ishlatiladigan asboblar


Download 411 Kb.
bet2/3
Sana13.12.2020
Hajmi411 Kb.
#165950
1   2   3
LABORATORIYA MASHG’ULOTI Oziq muhiti va idishlarni sterillash hamda mikroorganizmlarni parvarish qilish va shu maqsad uchun ishlatiladigan asboblar.

Kox qaynatgichida sterillash. Buning uchun qaynatgichga 5 sm qalinlikda suv quyiladi. So’ngra sterillanadigan probirka va kolbalar sim savatga yoki tunuka chelakka joylanib, qaynatgich ichidagi tirgak ustiga qo’yiladida, qaynatgichning qopqog’i yopiladi (9-rasm). Bular 3 kun davomida 3 marta sterillanadi.

Birinchi kuni qaynatgich ichidagi probirka yoki kolbalar 100° haroratda 30 minut qizdirilganda, spora hosil qilmaydigan hamda sporalari issiqqa chidamsiz bakteriyalar nobud bo’ladi. Sterillanayotgan idishlar Kox qaynatgichida kelgusi kungacha qoldiriladi. Ikkinchi kuni qaynatgich qaytadan 100° gacha qizdirilganda sporalari issiqqa chidamli bakteriyalar ham nobud bo’ladi. Oziq muhitini butunlay sterillash maqsadida


9 - rasm. Kox qaynatgichi.







uchinchi kuni yana 30 minut qizdiriladi. SHunda oziq muhiti mikroorganizmlardan butunlay tozalanadi.

Avtoklavda sterillash. Avtoklavga avval 5-10 sm qalinlikda suv quyiladi. So’ngra sterillanadigan buyumlar unga joylanib, qopqog’i mahkam bekitiladi. Ichidagi havo chiqib ketguncha uning jo’mragi ochiq holda qoldiriladi. Suv bug’i bir tekis chiqa boshlagandan keyin jo’mragi bekitiladi (10-rasm). Avtoklavga o’rnatilgan manometr bir atmosferaga ko’tarilganligi kuzatiladi. Manometr bosim bir atmosfera ko’tarilganini ko’rsatgan vaqtda avtoklavning ichidagi va probirka ichidagi oziq muhitining harorati 120° ga etadi. Bunday haroratda oziq muhitidagi mikroorganizmlarning hammasi nobud bo’ladi.


10 - rasm. Avtoklav turlari: a

- vertikal; b - gorizontal shakldagi avtoklavlar; v - strillash





Sterillash 20 minut davom etadi. SHundan so’ng manometr strelkasi nolb darajaga kelguncha avtoklav sovitiladi, so’ngra bug’ chiqib bo’lguncha jo’mragi ochiq qoldiriladi. Bug’ chiqishi to’xtagandan keyin qopqog’i ochilib, undan sterillangan oziq muhiti olinadi.

Sut va issiqlik ta’sirida buziladigan boshqa suyuqliklar ichidagi sporasiz bakteriyalarni nobud qilish maqsadida pasterlash usuli qo’llaniladi. Bu usulda suyuqliklar 60-70° issiqda 15-30 minut yoki 70-80° issiqda 5-10 minut qizdiriladi.

YUqoridagi usullardan tashqari, sovuq sterillash usuli ham qo’llaniladi. Bu holda Paster-SHamberlen ishlab chiqargan sopol idishlardan foydalaniladi. Buning uchun sterillanadigan eritma mayda teshikchalari bo’lgan sopol filbtrdan o’tkaziladi. Biroq bakteriofaglar va ulbtramikroblar sopol filbtr orqali o’tib keta oladi. SHuning uchun bunday filbtratda mikroblar bo’lmaydi deyish noto’g’ri. Keyingi yillarda asbestdan yasalgan Zeyts filbtri ham qo’llannlmokda (11-rasm).

Sterillangan oziq muhitlarini sterillangan idishlarga solish kerak. SHu sababli idishlar ham quruq issiqda barvaqt sterillab qo’yilishi kerak. Buning uchun Paster pechkasi yoki quritgich shkaflar ishlatiladi (12-rasm). Petri va Kox idishlari, probirkalar va ishlatiladigan boshqa buyumlar qog’ozga o’ralib, quritish shkafiga joylanadi va harorat 150-160°ga etguncha 2 soat davomida qizdiriladi. Tajribada foydalaniladigan mikroorganizmlarni parvarish qilish uchun turli sxemada ishlangan termostatlar qo’llaniladi. Termostatda mikroorganizm uchun zarur bo’lgan harorat muayyan nuqtada saqlab turiladi.




11 - rasm. Zeys filbtri: a - filtrlanuvchi suyuqlikni quyish uchun voronka; b - filbtr; v - havoni tortib turish uchun Komovskiy nasosi








12 - rasm. Quritgich shkaflar: a - zamonaviy shkaf; b - Paster pechkasi.







  1. LABORATORIYA MASHG’ULOTI Pichan basillasining elektiv kulbturasini tayyorlash.

Kerakli jihozlar: quruq pichan, tarozi, bitta katta va bir nechta kichik kolba, elektr plitka, oq bo’r, termostat.

Nazariy tushuncha: Bir necha xil mikroorganizmlar aralashmasida bir turning rivojlanishini ta’minlash usuli elektiv kulbtura tayyorlash deb ataladi. Elektiv kulbtura tayyorlashdan oldin tekshiriladigan organizmning yashash va rivojlanish sharoitini bilib olish kerak. Pichan badillasining yaxshi rivojlanishi uchun aerob (kislorodli) sharoit bo’lishi lozim. Bundan tashqari, bu basilla geterotrof organizm bo’lganligi sababli uning rivojlanishi uchun etarli miqdorda organik oziq ham talab etiladi. Bu sharoitda ko’pchilik mikroorganizmlarning yashash va rivojlanish jarayoni ancha qulay bo’ladi. Ular orasidan pichan basillasini ajratib olish uchun basilla sporasining issiqqa chidamliligidan foydalaniladi. Pichan basillasining sporalari 2 soat qaynatilganda ham o’z hayot faoliyatini yo’qotmasdan saqlab qoladi. Spora hosil qiluvchi bakteriyalarning ko’pchiligi va spora hosil qilmaydigan bakteriyalarning hammasi eritma qaynatilgandagina nobud bo’ladi.

Ishning borishi: Pichan basillasining elektiv kulbturasi quyidagicha tayyorlanadi: 20-25 g maydalangan quruq pichan hajmi 200-300 ml suvli kolbaga solinib, 30 minut qaynatiladi. Bu aralashmadagi sharoitni neytrallash uchun unga 1-2 g maydalangan oq bo’r qo’shiladi. Aralashma qaynatilganda pichan tarkibidagi organik moddalar eritmaga o’tadi va sporadan o’sib chiqqan basilla uchun oziq bo’ladi. YUqorida ko’rsatilgan vaqt o’tgandan so’ng qaynatilgan suyuqlikdan 3 ta toza kolbaga 1-2 sm3 dan quyib olinadi. Kolbalarning og’zi paxtadan qilingan tiqin bilan bekitiladi va 30° issiq termostatda 1-4 kun saqlanadi. So’ngra tekshiriladi.

  1. LABORATORIYA MASHG’ULOTI Mikroorganizmlarning kislorodga munosabatini aniqlash.

Kerakli jihozlar: YArmigacha qattiq oziq muhiti quyilgan probirkalar yoki

silindr.


Ishning borishi: Mikroorganizmlarning turini aniqlashda ularning kislorodga bo’lgan munosabatiga ham e’tibor berish zarur. Kislorodga bo’lgan munosabatiga karab ular quyidagi uch gruppaga bo’linadi:

  1. aerob mikroorganizmlar-havo o’tib turadigan sharoitda normal rivojlana oladi, havosiz sharoitda rivojlanmaydi;

  2. anaerob bakteriyalar-havosiz sharoitda normal o’sadi va rivojlanadi;

v) fakulbtativ anaerob bakteriyalar-kislorodli va kislorodsiz sharoitda ham bemalol o’sadi va rivojlanaveradi. Agar qattiq oziq muhitli silindr yoki probirkaga mikroorganizmlar, ukol vositasida yuqtirilsa, ularning kislorodga bo’lgan munosabati yaqqol ko’rinadi. Jumladan, aerob bakteriyalar oziq muhitining ustki tomonida, anaerob bakteriyalar pastki tomonida, fakulbtativ anaerob bakteriyalar esa har ikkala tomonida rivojlanganligi aniqlanadi (21-rasm).


21 - rasm. Mikroorganizmlarning kislorodga bo’lgan munosabatlari: a - aerob; b - fakulbtativ anaerob; v - haqiqiy anaerob sharoitda o’suvchi formalari.







  1. LABORATORIYA MASHG’ULOTI Tuproq tarkibidagi mikroorganizmlarning sonini aniqlash (0. G. SHulbgina tomonidan o’zgartirilgan S. N. Vinogradskiy usuli).

Kerakli jihozlar: mikroskop, mikropipetka, tuproq, buyum oynalari, karbol kislotali eritrozin buyog’i, okulyar mikrometr.

Nazariy tushuncha: Tuproq mikroflorasi. Tuproq tarkibidagi mikroorganizmlarning soni million va milliardlar bilan ifodalanadi. Ba’zi olimlarning ma’lumotiga ko’ra, 1 g tuproq tarkibida 2,5-5 milliardgacha mikroorganizm bo’ladi. Bir gektar erdagi mikroorganizmlarning umumiy vazni 3-5 t ga etib qoladi.

Tuproqning fizik va kimyoviy xossalari, unda oziq moddalarning ko’pligi, namlik va havoning etarli darajada bo’lishi turli-tuman mikroorganizmlarning rivojlanishi uchun juda qulay sharoit hisoblanadi. Tuproq tarkibidagi mikroorganizmlarning soni va xili kun sayin ko’payib hamda o’zgarib turadi. Ular odatda, inson, hayvon va o’simlik qoldiqlari hisobiga ko’payadi. Arktikada va issiq Sahara qumlarida ham minglab, millionlab uchraydi.

S. Razumov va R. Remezovning ma’lumotiga ko’ra, tuproqning ustki qatlamida mikroorganizmlarning soni ko’p bo’lib, chuqurlashgan sari kamaya borar ekan. Tuproq qatlami chuqurlashgan sari mikroorganizmlarning soni kamaya borishiga ularning tuproq zarrachalari tomonidan yutilib ketishi sabab bo’ladi. Tuproq tarkibidagi mikroorganizmlarning soni yil fasllariga qarab ham o’zgarib turadi. Ular tuproq strukturasini yaxshilashda, uni chirindiga boyitishda juda katta rolb o’ynaydi.

Tuproq tarkibidagi mikroorganizmlar juda xilma-xil bo’lganligidan ular bir- biriga salbiy yoki ijobiy ta’sir ko’rsatadi, ya’ni bir-biri bilan simbioz holda yoki bir- biriga antagonist bo’lib hayot kechiradi.

Ishning borishi: Tuproq tarkibidagi mikroorganizmlar sonini aniqlash uchun 5 g tuproq olib, 250 ml hajmli kolbaga solinadi. SHu kolbaga 50 ml sterillangan suv qo’shib 5 minut chayqatgandan so’ng 1-2 minut tindiriladi. So’ng buyum oynasiga eni 1 sm va uzunligi 4 sm keladigan kvadrat chizib, unga yuqorida tayyorlangan eritmadan 0,01 ml olib bir tekisda yuqtiriladi. Bu mazok quritilgandan so’ng absolyut spirt eritmasi bilan yoki spirt lampa alangasida fiksasiyalanib, karbol kislota (fenol) da eritilgan eritrozin bo’yog’i bilan bo’yaladi. 30 minutdan keyin bo’yoq yuvilib, preparat quritiladi va bir tomchi kedr moyi tomizib immersion ob’ektiv orqali mikroskopda kuzatiladi. Endi 1 g tuproq tarkibidagi mikroorganizmlar sonini aniqlash uchun quyidagi ishlar bajariladi.


  1. Mikroskop orqali ko’ringan doiraning umumiy sathi aniqlanadi. Buning uchun okulyar mikrometr yordamida doira radiusi aniqlanib, tubanda ko’rsatilgan formula asosida doiraning umumiy sathi topiladi:

S = p r2

Bunda, S-istalgan doira yuzasini:

P-3,14 (3,14159) irrasion son-doira aylanasining doira diametriga bo’lgan nisbatini bildiradi;

r2-doira radiusini ifodalaydi.

Masalan, doira radiusini 0,075 yoki 0,08 nm ga teng deb olib, yuqoridagi formula asosida doiraning umumiy sathi topiladi:

S = p r2; S = 3,14 x (0,08)2 = 3,14 x 0,0064 = 0,020094.

Demak, mikroskopda ko’ringan doiraning umumiy sathi 0,020094 yoki 0,02 mm2 ga teng deb olindi.



  1. Mikroskop doirasida ko’ringan mikroorganizmlar soni sanaladi. Bu ishni bajarish uchun ularning doira ichidagi soni aniqlanib daftarga yoziladi. So’ng stolchani harakatlantiradigan vintlar yordamida preparatni siljitib, uning boshqa joyida ko’ringan doira ichidagi mikroorganizmlar soni ham daftarga yozib qo’yiladi. SHunday tarzda, preparatni harakatlantirib, 50-100 doiradagi mikroorganizmlar soni aniqlangach, ularning o’rtacha soni topiladi. Faraz qilaylik, kuzatilgan 50 doira ichida 1500 dona mikroorganizm bo’lsa, bitta doira ichidagilarining o’rtacha soni: 1500 : 50 = 30 dona bo’ladi. Demak, olingan tajriba dalillariga asoslanib, bitta doira ichidagi mikroorganizmlar soni 30 dona deyish

mumkin.

  1. YUqoridagi sonlarga asoslanib, tajriba o’tkazilayotgan buyum oynasining 4 sm yuzasiga yuqtirilgan yoki 0,01 g (ml) aralashma ichidagi mikroorganizmlarning umumiy sonini aniqlash uchun quyidagi tenglamadan foydalanamiz:

0.02 mm2 - 30 bona bakteriya

4sm2 = 400 mm2 - x dona bakteriya x = 400 x 30 / 0,02 = 600 000 dona



1 g tuproq tarkibidagi mikroorganizmlar sonini aniqlash uchun tubandagi tenglamadan foydalanamiz (buning uchun 0,01 ml aralashmadagi tuproqning og’irligini 0,001 g ga teng deb olamiz):

0,001g - 600000



  1. g - x x = 1 x 600 000 / 0,001 = 600 000 000 dona

Demak, tekshirilgan tuproqning bir gramida 600 000 000 dona mikroorganizm borligi aniqlanadi.

  1. LABORATORIYA MASHG’ULOTI Havo tarkibidagi mikroorganizmlarni aniqlash va ularni bir-biridan ajratib olish.

Kerakli jihozlar: Petri idishlari, probirkada sterillangan GPA yoki GPJ oziq muhitlari, termostat, Volbfgyugelb kamerasi.

Nazariy tushuncha: Havo mikroflorasi. Tuproqdan ko’tariladigan chang o’zi bilan birga mikroorganizmlarni ham havoga tarqatib, havoni ifloslaydi. Xavoning quruq bo’lishi va ulbtrabinafsha nurlarning ta’siri havodagi mikroorganizmlarning hayoti uchun xavflidir.

Havodagi mikroorganizmlar soni yil fasllariga qarab o’zgarib turadi. Bu mikroorganizmlar qish faslida oz, yozda ko’p, kuzda va bahorda o’rtacha bo’ladi. Havoning yuqori qatlamlariga ko’tarilgan sari mikroorganizmlar soni kamaya boradi.

Ishning borishi: Bu mashg’ulotni o’tkazishda Kox usulidan foydalanish mumkin. Bunda go’sht-pepton-agarli (GPA) yoki go’sht-pepton-jelatinali (GPJ) qattiq oziq muhiti ishlatiladi.

Mashg’ulot uchun kerakli oziq muhiti Petri idishiga solinib, plastinka shaklida qotiriladi, so’ngra idishning qopqog’i olinib, bir necha (5-10) minut ochiq qoldiriladi. Keyin qopqog’ini bekitib, 25-30° li termostatga qo’yiladi.

Qattiq oziq muhitidagi har bir mikroorganizm hujayrasi ko’payib o’ziga xos koloniyalar hosil qiladi. Bu koloniyalar (to’dalar) mikroorganizmning turiga qarab har xil shaklda bo’ladi va turli rangda tovlanib turadi. Bir necha kun o’tgandan so’ng Petri idishidagi qattiq oziq muhitida paydo bo’lgan koloniyalarning soni havo tarkibida qancha mikroorganizm borligini aniqlashga imkon beradi.

Petri idishidagi oziq muhitida bakteriyalar sonini Volbfgyugelb kamerasi yordamida aniqlash juda oson. Buning uchun kamera ichiga Petri idishi to’ntarib qo’yiladi. Kameraning yuqori tomonidagi oyna 1 sm2 ga teng bo’lgan kataklarga bo’lingan. Petri idishining sathiga ro’parama-ro’para kelgan 10-20 katakchadagi koloniyalarning sonini sanab, 1 sm2 sathga teng kelgan bakteriyalarning o’rtacha soni topiladi, so’ngra bu son idishdagi oziq muhitining umumiy sathiga ko’paytiriladi. Natija havoning mikroorganizm bilan ifloslanganlik darajasini ko’rsatadi (22-rasm). 1 m3 havo tarkibidagi mikroorganizmlar sonini topish uchun avval 100 sm2 oziq muhitidagi mikroorganizmlar koloniyasini aniqlash kerak. CHunki V. S. Omelyanskiy ma’lumotiga ko’ra, 10 l havo tarkibida bo’lgan mikroorganizmlar 5 minut ichida 100 sm2 yuzaga o’tirar ekan. Bu ko’rsatkich aniqlangandan so’ng 1 m3, ya’ni 1 000 litr havo tarkibidagi mikroorganizmlar sonini aniqlash juda oson bo’ladi. Masalan, Petri idishining umumiy sathini 70,84 sm2 ga teng




22 - rasm. Volbfyugelb kamerasi.

a - kataklarga bo ’lingan plastinka; b - plastinka tagiga joylangan buyumli Petri chashkasi.



deb olib, tajriba natijasiga ko’ra, undagi oziq muhitida 25 dona bakteriya koloniyasi bor deb faraz qilaylik, u vaqtda 100 sm2 yuzaga to’g’ri keladigan mikroorganizmlar koloniyasini aniqlash uchun quyidagicha proporsiya tuziladi:

70,84 sm2 — 25 dona

j ^ , 100x25 2500 ,

100sm2 — X dona x = = = 35 dona

70,84 70,84

Demak, V. S. Omelyanskiy ma’lumotlariga asoslanib, 10 litr havo tarkibida 35 dona bakteriya koloniyasi borligi aniqlandi. Endi 1 m3, ya’ni 1000 l havo tarkibidagi bakteriyalar koloniyasini aniqlash uchun tubandagicha proporsiya tuziladi:

10 l — 35 dona

, 1000x35 3500

100 l — X dona x = = = 3500dona

10 1


  1. LABORATORIYA MASHG’ULOTI Suvdagi mikroblar sonini aniqlash.

Nazariy tushuncha: Suv mikroflorasi. Suv tarkibidagi organik va anorganik moddalarning miqdoriga qarab, mikroblarning soni ham turlicha bo’ladi. Suvdagi mikroblarning ko’pchiligi saprofit hayot kechiradi. Ular orasida kasallik qo’zg’atuvchi mikroorganizmlar ham uchraydi. Bularning ko’pchiligi suv ostidagi

loyqaga joylashadi. Uning tarkibida mikroblar yashashi uchun barcha zarur sharoit mavjud. Lekin suvga tushgan quyosh nurlari va suv tarkibidagi bakteriofag, sodda hayvonlar, antagonist organizmlar ishlab chiqargan mahsulotlar ta’sirida mikroorganizmlar keng tarqala olmaydi. SHuning uchun suvda mikroblar soni tuprokdagiga nisbatan ancha kam bo’ladi.

Ishning borishi: Suvdagi mikroblar sonini aniqlash uchun Petri idishiga

  1. ml suv quyib, unga eritilgan GPJ yoki GPA dan 10-12 ml chamasi qo’shib aralashtiriladi. GPJ yoki GPA qotib qolgandan so’ng idish 25-30° li termostatga qo’yilib bir sutka saqlanadi. SHundan so’ng qattiq oziq muhitida hosil bo’lgan bakteriya, mikroblar koloniyasining soni Volbfgyugelb kamerasi yordamida aniqlanadi.

  1. - LABORATORIYA MASHG’ULOTI Oqsil chirishi jarayonida ishtirok etadigan bakteriyalarni aniqlash.

Kerakli jihozlar: kolba, pepton (eruvchan oqsil), tuproq, qizil lakmus qog’oz, qo’rg’oshin asetat [Rb(SN3SOO)2] tuzi eritmasi va oksalat kislota (N2C2O4), shimdirilgan qog’ozlar, tiqin tayyorlash uchun paxta, buyum oynalari, fuksin, mikroskop, bakterial ilmoq, imm
ersion moy (kedr moyi).

Nazariy tushuncha: Ammonifikasiya jarayoni. Oqsil va tarkibida azot bo’lgan boshqa organik birikmalar parchalanib, o’zida ammiak hosil qilishi ammonifikasiya deyiladi. Odatda, bu jarayon oqsilning chirishi deb aytiladi. Oqsil chirishi jarayonida ammiakdan tashqari, N2S, indol (SsNN), metil- merkaptan (SN3SN), fosfat kislota (N3RO4) va boshqa birikmalar hosil bo’ladi. O’zidan tashqi muhitga proteolitik fermentlar ishlab chiqaradigan tirik organizmlargina bevosita oqsilga ta’sir qila oladi va uni parchalaydi. Boshqa organizmlar pepton va aminokislotalarni ammiakkacha parchalashi mumkin. Ammonifikasiya jarayonida bakteriyalardan tashqari, aktinomisetlar va mog’or zamburug’lari ham qatnashadi. Ammonifikasiya jarayoni tabiatda keng tarqalgan bo’lib, qishloq xo’jaligida juda muhim rolb o’ynaydi. Bu jarayonda hayvon va o’simliklar qoldig’i tarkibidagi azotli organik moddalar parchalanib, o’simliklarning oziqlanishi uchun zarur bo’lgan mineral moddalar hosil bo’ladi. SHuni ham aytib o’tish kerakki, agar tabiatda ammonifikasiya jarayoni yuz berib turmasa, er shari o’simlik va hayvonlar qoldig’i bilan to’lib ketgan bo’lar edi.

Demak, ammonifikasiya jarayoni tabiatda azotning aylanishida birinchi tartibli jarayon bo’lib hisoblanadi. Bu jarayonda qatnashuvchi bakteriyalar juda xilma-xil bo’lib, ularning ba’zi turlari anaerob, ikkinchi xil turlari aerob sharoitda hayot kechiradi. Bu jarayonda fakulbtativ anaerob bakteriyalar ham ishtirok etadi.



Ishning borishi: Bu ishni bajarish uchun 200 ml hajmli kolbaga uning 3/4 qismigacha 3% li pepton eritmasi to’ldirilib, eritma ichiga 0,5 g chamasida tuproq aralashtiriladi. Tuproq tarkibidagi aerob va anaerob bakteriyalar ta’sirida bu aralashmada ammonifikasiya prosessi boshlanadi.

Kolba og’ziga qo’yilgan paxta tiqinning bir joyiga qizil lakmus qog’oz, ikkinchi joyiga konsentrlangan oksalat kislota (N2S2O4) va uchinchi joyiga

qo’rg’oshin asetat [Rb(SN3SOO)2] tuzi eritmasi shimdirilgan qog’oz parchalari osib qo’yiladi. Bakteriyalarga qulay sharoit yaratish uchun kolba 30° li issiq termostatga qo’yiladi (23-rasm).

Oradan bir necha kun o’tgach, kolba tiqiniga osib qo’yilgan qog’ozlarning rangi o’zgargan-o’zgarmaganligi tekshiriladi. Jumladan, kizil lakmus qog’oz jarayon vaqtida ajralib chiqqan ammiak ta’sirida ko’k rangga kiradi. Qo’rg’oshin asetat tuzining eritmasi shimdirilgan qog’oz N2S ishtirokida qora rangga, oksalat kislota shimdirilgan qog’oz indol ta’sirida pushti rangga bo’yaladi.



Bu reaksiyalarning hammasi ammonifikatorlar ta’sirida peptonning parchalanishi natijasida vujudga kelgan mahsulot borligini isbotlaydi.


23 - rasm. Ammonifikasiya jarayonini tekshirish uchun tajribaning qo’yilishi: a - qizil lakmus qog’oz;

b - oksalat kislota (N2S2O4) tuzi eritmasi shimdirilgan filbtr qog’oz; v - qo’rg’oshin asetat (Pb(SN3SOO)2) tuzi eritmasi shimdirilgan filbtr qog’oz.



Aerob sharoitda yashab, oqsilning chirishida ishtirok etadigan bakteriyalarni ko’rish uchun kolbadagi suyuqlikning yuza qavatidan sterillangan ilmoq yordamida bir tomchi olib mazok tayyorlanadi. Mazok quritilib, fiksasiyalangandan va fuksin bilan bo’yalgandan so’ng unga bir tomchi kedr moyi tomizilib, mikroskopning immersion sistemasi orqali tekshiriladi.

Mikroskopda oval shaklli spora hosil qiladigan kichik tayoqcha-basillus mikoides (Bacillus mycoides) borligi ko’rinadi. Bu basilla peritrix tipda joylashgan xivchinli bo’lib, oqsilni ammiakkacha parchalaydi. Qattiq oziq muhiti betida zamburug’ misellalari (iplari) ga o’xshash koloniyalar hosil kiladi (24-rasm, a). Oqsilning chirishida pichan basillasi (Bacillus subtilis) ham faol qatnashadi (25-rasm,


  1. . Oqsilning anaerob sharoitda parchalanishida qatnashadigan basillus putrifikans (Bacillus putricus) ning bor-yo’qligini aniqlash uchun kolbadagi suvning pastki qatlamidan bir tomchi eritma olib mazok tayyorlanadi. Mazok quritilgandan so’ng bo’yaladi va mikroskopda tekshiriladi. Bo’yalgan mazokda spora hosil qiluvchi, baraban tayoqchasi shaklidagi basilla borligi ko’rinadi (26-rasm, v).

Proteus vulgarus (Proteus vulgaris) nomli bakteriya esa ingichka tayoqchalar shaklida ko’rinadi. Bu bakteriya spora hosil qilmaydi. Oqsilning parchalanishi natijasida indol va N2S hosil bo’ladi. Agar muhitga uglevod berilsa, bu holda karbonat angidrid va vodorod gazlari ham ajraladi. Proteus vulgaris fakulbtativ anaerob bakteriya bo’lib, aerob va anaerob sharoitda hayot kechiradi.






24 - rasm. Ammonifikasiya jarayonida qatnashadigan mikroorganizmlar: a - basillus mikoydes (Bacillus mycoides); chap tomonda spora hosil qilish oldidagi vegitativ hujayralar, o’ng tomonda koloniyalari.

6


12-LABORATORIYA MASHG’ULOTI



25 - rasm. Ammonifikasiya jarayonida qatnashadigan mikroorganizmlar: b - basillus subtilis (Bacillus subtilis)


26 - rasm. Ammonifikasiya jarayonida qatnashadigan mikroorganizmlar: v - basillus putrifikus (Bacillus putricus); g - proteus vulgaris (Proteus vulgaris)





Azotobakterning elektiv kulbturasini tayyorlash.

Kerakli jihozlar: Petri idishi, tuproq, shpatelb, mannit yoki gliserin, karbol kislotada eritilgan eritrozin bo’yog’i, buyum oynalari, kedr moyi, spirt lampa, bakterial ilmoq.

Nazariy tushuncha: Azotobakter. 1901 yilda nemis olimi Beyerink molekulyar azotni o’zlashtiradigan klostridiumdan boshqa bakteriyalar ham borligini aniqladi. Bu bakteriyalar to’dasi (koloniyasi) qo’ng’ir rangli bo’lganligi sababli, ularga azotobakter xrookokkum degan nom berdi (31-rasm).

Azotobakter aerob sharoitda hayot kechiradi. Mikroskopda shar shaklida ko’rinadi. Azotobakter bittadan, ikkitadan yoki uchtadan bo’lib, shilimshiq g’ilof ichida joylashadi. Bu g’ilof kapsula deb ataladi. Kapsula bakteriyalarni noqulay sharoitdan himoya qilish vazifasini bajaradi.



Azotobakterning yosh hujayrasi harakatchan, monotrix tipda


31 - rasm. Molekulyar azotni o’zlashtiriuvchi azotobakter xrookokkum (Azotobacter chroococcum) bakteriyasi: 1 - bittadan va ikkitadan qo’shilgan-sharsimonlari; 2 - sakkiztasi

qo’shilgan sarsina tipdagilari.



xivchinlangan bo’ladi. Bu bakteriya klostridiumga nisbatav molekulyar azotni



  1. 6 baravar ko’proq o’zlashtiradi. Agar erga kalbsiyli va fosforli o’g’itlardan tashqari, bor yoki molibden solinsa, azotobakterning hayot faoliyati faollashadi. Kislotali tuproqlarda azotobakter yashamaydi, uning hayot kechirishi uchun tuproqning rN-6 dan past bo’lmasligi kerak.

Tuproqni azotobakter bilan boyitish maqsadida sun’iy bakterial o’g’it ishlatiladi. Azotogen yoki azotobakterin deb atalgan bu o’g’it dalaga ekinlar urug’i bilan birga solinadi. Uning ta’sirida hosil 20% gacha ortadi. Bir gektar erga 3 kg azotogen sarflanadi. Azotogen bilan aralashtirilgan urug’larni shu kunning o’zidayoq ekish zarur.

Ishning borishi: Azotobakterni to’plab olish uchun 100 g tuproqqa 2 g mannit yoki gliserin aralashtiriladi. Bu aralashma ustiga 20-30 ml suv quyib, undan xamirsimon loy tayyorlanadi. Uni Petri idishiga solib, usti shpatelb bilan silliq qilib suvaladi. So’ngra idishning og’zini yopib, 30°li termostatda bir necha hafta saqlanadi. SHundan so’ng idishdagi loy betida oq rangli yaltiroq koloniyalar hosil bo’lganligini ko’rish mumkin
, keyinchalik bu koloniyalar qo’ng’ir tusga kiradi. Bakteriyalar bilan tanishish maqsadida koloniyaning bir bo’lakchasini olib, 1-2 tomchi suvda suyultiriladi va shu suyuqlikdan mazok tayyorlanadi. Mazok kurigandan so’ng 5 minut davomida spirt bilan fiksasiyalanadi. Fiksasiyalangai mazok ustiga karbol kislotada eritilgan eritrozin bo’yog’i tomizilib, so’ngra bo’yaladi. Keyin yuviladi, quritilib, bir tomchi kedr moyi tomiziladi va mikroskopning immersion ob’ektivi orqali ko’riladi. Eritrozin bo’yog’i tuproq zarrachalarini bo’yamasdan faqat bakteriyalarni bo’yaydi. Bu preparatda azotobakter xrookokkum hamda ularni o’rab olgan kapsula ko’rinadi.

  1. LABORATORIYA MASHG’ULOTI Tugunak bakteriyalarni to’plash va aniqlash.

Kerakli jihozlar: mikroskop, har xil yoshdagi tugunaklar, buyum oynalari, sinbka yoki fuksin, spirt lampa, shakar, soda, no’xat yoki boshqa dukkakli o’simliklar urug’i, o’lchovli kolba, voronka, filbtr.

Nazariy tushuncha: Tugunak bakteriyalar. Dukkakli ekinlar mahalliy yoki mineral o’g’it berilmaganda ham normal rivojlanib, hosilga kirishi qadimdan ma’lum. Buning sabablarini birinchi marta fransuz olimi Jan-Batist Bussengo 1838 yildan boshlab tekshirgan. SHu tekshirish natijalariga asoslanib, u dukkakli o’simliklar molekulyar azotni o’zlashtira oladi degan xulosaga kelgan. Oradan 20 yil o’tgach, Bussengo dukkakli va don ekinlari ustidagi tajribalarini yangidan boshlaydi va bu tajriba usullarini tobora takomillashtiradi. U tajriba uchun ishlatiladigan tuproq tarkibidagi azotli birikmalarni yo’qotish uchun shu birikmalar batamom yonib bo’lguncha tuproqni qizdiradi (sterillaydi). SHu tarzda tayyorlangan tuproqni idishlarga solib, ularning yarmiga no’xat va qolgan yarmiga don ekinlari urug’ini ekadi. Lekin ekilgan no’xat va don ekinlari urug’i ko’karib chiqsa ham, keyinchalik o’smay qolaverganligini aniqlaydi. Bussengo bu tajriba natijalariga asoslanib, o’zining dastlabki, ya’ni dukkakli o’simliklar havodagi erkin azot bilan oziqlanib, bemalol o’sadi va rivojlanaveradi degan fikridan voz kechadi.

1888 yilda nemis olimlari Gelbrigelb bilan Vilbfart ham dukkakli o’simliklar bilan tajriba ishlari olib boradilar. Ular bu tajribalarda dukkakli o’simliklar urug’ini qizdirilgan hamda qizdirilmagan tuproq solingan idishlarga ekadilar va shu tajriba natijalariga aeosan quyidagi xulosaga keladilar:


  1. qizdirilmagan (tabiiy) tuproq solingan idishga ekilgan urug’dan ko’kargan dukkakli o’simliklarning ildizida tugunaklar hosil bo’ladi, qizdirilgan tuproqqa ekilgan dukkakli o’simliklarda esa bunday hodisa yuz bermaydi;

  2. ildiz sistemasida tugunaklar hosil qilgan dukkakli o’simliklargina molekulyar azotni o’zlashtira oladi.

Dukkakli o’simliklar molekulyar azot o’zlashtirishi sabablarini rus olimi M. S. Voronin bilan nemis olimi Beyerink ham isbotlaganlar. M. S. Voronin 1865

yilda dukkakli o’simliklar ildizidagi tugunaklar ichida tayoqchasimon va shoxlangan bakteriyalar borligini aniqlagan. Beyerink esa 1888 yilda bu tadqiqotni davom ettirib, tugunaklar ichidagi bakteriyalarni toza holda ajratib olgan va ularga bakterium rizobium radisikola (Bacterium Rhizobium radicicola) degan nom bergan. SHunga asosan ular tugunak bakteriyalar deb atalgan. Bu bakteriyalarning yo’g’onligi 1 mkm, uzunligi 4-5 mkm keladi. Ba’zilari shoxlanib turadi. Mayda

tayoqcha shaklidagi shakllari ham uchraydi, ularning uzunligi 0,9 mkm, yo’g’onligi


  1. 2 mkm dan oshmaydi.

Bakterium rizobium radisikolaning rivojlanish davri juda murakkab bo’lib, bu davr mobaynida uning shakli ham juda o’zgarib turadi. YOsh tugunak bakteriyalar ancha harakatchan bo’lib, ularning yo’g’onligi 0,18 mkm va uzunligi 0,9 mkm, keladi. Vinogradskiy ma’lumotlariga ko’ra, bu bakteriyalar 24 soat mobaynida 2,5 sm masofaga siljir ekan.

Harakatchan bakteriyalar rivojlanish davrining birinchi bosqichida oddiy bo’linish yo’li bilan ko’payadi. Ikkinchi bosqichida esa xivchinlarini to’kib, harakatdan to’xtaydi va hajmi kattalashadi. Bakteriyaning hujayrasi ichida vakuola vujudga keladi, hujayraning o’zi esa belbog’li bo’lib ko’rinadi. Belbog’li hujayra kokk shaklidagi bir necha harakatchan hujayralarga bo’linadi. SHu paytdan e’tiboran rivojlanish davrining birinchi bosqichi yangidan boshlanadi (32-rasm).

Qarib qolgan bakteriyalarning ba’zi birlari shoxlangan shaklda bo’ladi va bakteroid deb ataladi. Ular ham belbog’li bo’lib ko’rinadi (33-rasm).

Tugunak bakteriyalar tugunak ichidagina yashamasdan, tuproqda ham bir necha yilgacha nobud bo’lmay saqlanadi. Bu bakteriyalar radisikola degan umumiy nom bilan atalsa ham, har qaysi dukkakli o’simlikning o’ziga xos bakteriyasi bo’ladi (34-rasm).

Tugunak bakteriyalar o’ziga xos xususiyatlariga ko’ra: no’xat, vika, china va burchoq; lyupin va seradella; beda va qashqarbeda; loviya, soya; nut; sebarga va boshqa dukkakli o’simliklar ildizida rivojlanadigan guruhlarga bo’linadi.

Dukkakli o’simliklar tugunak bakteriyalarni tarkibida azot bo’lmagan organik moddalar bilan ta’minlab turadi. Bakteriyalar esa dukkakli o’simliklarga azotli birikmalarni etkazib beradi, ya’ni ular o’zaro simbioz hayot kechiradi.

Tuproqda erkin holda yashaydigan tugunak bakteriyalar o’simlikning ildiz to’qimalariga kirishdan oldin, ildiz tukchalari yoniga to’planib ko’payish bilan bir qatorda, ularning po’stini yumshatadi.

Hujayra ichiga kirgan bakteriyalar o’zidan shiliq chiqaradi, u ipsimon bo’lib cho’ziladi. Bu infeksion ip deb ataladi (35-rasm). Ildiz tukchalarining hujayralari bakteriyalar tomonidan yumshatilgandan so’ng tez fursatda bo’linadi va cho’zilib tugunakka aylanadi. Tugunak hosil bo’lgandan keyin hujayralarning protoplazmasi tugunak bakteriyalar bilan to’ladi. O’simliklar hujayrasi bo’linganda tugunak bakteriyalar ham deyarli baravar taqsimlanadi (36-rasm).



Dukkakli ekinlarni o’ziga xos aktiv tugunak bakteriyalar bilan boyitish maqsadida ular sun’iy yo’l bilan tayyorlangan bakterial o’g’itlar bilan oziqlantiriladi. Bu o’g’itlar nitrogen deb ataladi. Nitrogenni suvda eritib, ekiladigan dukkakli o’simlikning urug’i shu eritmada namlanadi. Nitrogen bilan namlangan urug’larni shu kunning o’zidayoq ekish zarur aks holda bakteriyalarning aktivligi pasayib ketishi mumkin. Urug’i nitrogen bilan namlab ekilgan dukkakli o’simliklarning hosili 14-50% ortadi.


rasm. Tugunak bakterichsining rivojlanish 33 - rasm. SHoxlangan vegitativ bosqichlari: a-kokklik davri; hujayra-bakteroidning ko’rinishi.

b - harakatchan xivchinlik davri; v - xivchinini yo’qotgan davri;

g - belbog’li davri; d - kokklarga ajralish davri.








34 - rasm. Dukkaki o’simliklar ildizida hosil bo’lgan tugunaklarning shakllari: 1 - no’xat, 2 - sebarga, 3 - seradella, 4 - lyupin, 5 - qashqar beda.







Ishning borishi: Bu mashg’ulot quyidagicha o’tkaziladi:

  1. 100 ml suvga 10 g no’xat yoki boshqa dukkakli o’simlik urug’i solinib, dukkaklar yorilguncha (30 minut) qaynatiladi. Eritma issiq holicha 100 ml hajmli idishga filbtrlanadi. Bu filbtratga uning hajmi 100 ml ga etguncha suv qo’shiladi. Suv qo’shishdan oldin filbtrat kristalik soda bilan neytrallanadi. So’ngra bu aralashmaga 2 g shakar va 1,5-2 g agar-agar qo’shib eritiladi. SHu tarzda tayyorlangan suyuqlik Petri idishlariga 0,5 sm qalinlikda quyib qotiriladi.


35 - rasm. 1) Bakteriyalarning ildiz tukchalari orqali o’simlik to’qimasiga o’tish payti: a - ildiz tukchasi yonida to’planib turgan bakteriyalar; b - ildiz tukchasi ichida infeksion ipning hosil bo’lishi.



2) Katta qilib ko’rsatilgan hujayra va infeksion ip: a - o’simlik hujayrasi; b - infeksion ip.






36 - rasm. O’simlik hujayralari bo’linganda tugunak bakteriya hujayralarining

taqsimlanishi.



Qotib qolgan plastinkaga tarkibida tugunak bakteriyalar bo’lgan suyuqlik surkaladi. Plastinkaga surkaladigan suyuqlik bironta dukkakli o’simlik tugunagidan siqib olinadi. So’ngra Petri idishi 25-35° li termostatga qo’yilib, bir necha kun saqlanadi. Bu vaqt o’tgandan so’ng Petri idishidagi plastinkada tugunak bakteriyalar koloniyasi hosil bo’ladi. Koloniyalarni tashkil etgan bakteriyalar mikroskopda tekshiriladi.



  1. Dukkakli o’simlikning yosh tugunagidan suvi siqib chiqariladi. Buyum oynasiga undan bir tomchi tomizib Mazok tayyorlanadi. Mazok fiksasiyalangandan keyin sinbka yoki fuksin bilan bo’yalib, mikroskopda ko’rilganda tayoqsimon bakteriyalar borligi kuzatiladi.

  2. YAxshi rivojlangan (qarigan) tugunakni kesib, suvi siqib olinadi va yuqorida ko’rsatilgandek bakteriyali preparat tayyorlanadi. Bu preparat mikroskopda qaralganda shoxlangan bakteriyalar ko’rinadi.

  1. LABORATORIYA MASHG’ULOTI Spirtli bijg’ish va bu jarayonni qo’zg’ovchi tirik organizmlar.

Kerakli jihozlar: mikroskop, kolbalar, egri shisha nay o’rnatilgan kauchuk tiqin, suvli idish, probirkalar, quruq achitqi, pivo achitqisi, suv hammomi, termometr, shakarning 10% li eritmasi, ishqorning 10% li eritmasi, buyum va qoplag’ich oynalar, yod eritmasi, hovoncha.

Nazariy tushuncha: Spirtli bijg’ish. Tabiatda mikroorganizmlarning foydali va foydasiz turlari juda ko’p tarqalgan. SHuning uchun zararli mikroorganizmlarning hayot jarayonlari o’rganilib, ularga qarshi kurash choralari ishlab chiqilmoqda. Foydali mikroorganizmlarning hayot jarayonida hosil bo’ladigan mahsulotlarni xalq xo’jaligida ishlatish uchun ularning faol shakllaridan foydalanilmoqda. Bu organizmlardan to’g’ri va samarali foydalanish uchun tabiatda eng muhim hisoblangan spirt, sut, moy, kletchatka, pektin kabi moddalarning bijg’ish jarayoni bilan, shuningdek, spirtning oksidlanishi natijasida sirka kislota hosil bo’lish yo’llari bilan qisqacha tanishib o’tish zarur.

Vino tayyorlash usullari qadimdan ma’lum bo’lishiga qaramay, shakarning parchalanishi natijasida etil spirt hosil bo’lishi XVII asr oxiridagina aniqlangan. Lavuazbe ma’lumotiga ko’ra, shakarning parchalanishi natijasida etil spirt va karbonat angidrid ajralib chiqadi. Bu reaksiya tubandagicha boradi:

S6N12O6 ^ SN3SN2ON + 2SO2 + 25 kkal.

Spirtli bijg’ish jarayoni tirik organizmlar ishtirokida borishini, ya’ni biologik jarayon ekanligini Lui Paster 1858 yilda ko’rsatib o’tdi. Bu davrgacha spirtli bijg’ish jarayoni kimyoyaviy reaksiyalardan iborat hodisa deb qaralgan, xolos.

Spirtli bijg’ish jarayoni saxaromises oilasiga kiradigan achitqi zamburug’larining ishtiroki bilan borishini ham Lui Paster aniqlagan. Bu jarayon havosiz sharoitda borganligini nazarda tutib, u bijg’ish — anaerob sharoitdagi hayot ekanligini uqtirib o’tgan.

Ba’zi mog’or zamburug’lari ham bijg’ish jarayonini qo’zg’aydi. Lekin bular ta’sirida hosil bo’lgan spirt miqdori 5-7% dan oshmaydi. 1 g shakar bijg’ishi natijasida 0,5 g chamasi spirt va boshqa mahsulotlar (sirka albdegid, gliserin, butil, izobutil va amil spirtlar, sirka va kahrabo kislotalar) hosil bo’ladi. SHakarning 1-5% ga yaqin qismi zamburug’larning oziqlanishi vaqtida sarf bo’ladi. Reaksiya vaqtida ajralib chiqqan 25-27 kkal ga yaqin energiya zamburug’larning hayot faoliyatida sarflanadi.

Achitqi zamburug’lari fakulbtativ anaerob organizmlar qatoriga kirib, aerob sharoitda ham hayot kechira oladi. Achitqi zamburug’larining aerob sharoitdagi hayot faoliyati natijasida shakarning ko’p qismi suv va sirka kislotagacha parchalanib ketadi. Bunda spirt kam hosil bo’ladi. Bulardan tashqari, aerob sharoitda zamburug’larning ko’payish jarayoni ham tezlashadi. SHundan foydalanib, achitqi zamburug’larini to’plab olish maqsadida, bijg’ish jarayonida oziq muhiti ichiga havo yuborib turiladi.

Anaerob sharoitda 10-15% gacha etil spirt to’planadi. Agar bijg’ish vaqtida muhitga natriy sulbfit tuzi (N2SO3) qo’shilsa, spirt o’rniga 25% ga yaqin gliserin to’planadi. Demak, spirtli bijg’ish jarayonidan gliserin tayyorlash sanoatida ham foydalaniladi.



Spirtli bijg’ish jarayoni normal o’tishini ta’minlash uchun rN=3-6, harorat esa 25-40° bo’lishi kerak. Azot manbai sifatida pepton, aminokislotalar va ammiakdan foydalanish mumkin.

Ishning borishi: Bu mashg’ulotni o’tkazish uchun avval 3-5 g quruq achitqiga shakarning 10% li eritmasidan 10 ml qo’shib, hovonchada eziladi (eritiladi) va 40-60 minut tindiriladi. So’ngra 100 ml hajmli kolbaga shakarning 10% li eritmasidan 50 ml quyib, unga yuqoridagicha tayyorlangan achitqi-shakar aralashmasi qo’shiladi. Qolbaning og’zi egri shisha nay o’rnatilgai kauchuk tiqin bilan mahkam bekitiladi. Bijg’ish jarayoni faol o’tishi uchun kolba 30-35° li suv hammomiga joylanadi (37- rasm). Nayning ikkinchi uchiga suv to’ldirilgai probirka to’nkarib kiygizilib, suvli idishga botirib qo’yiladi (38-rasm). Oradan 20-30 minut o’tgach, bijg’ish jarayoni vaqtida ajralib chiqayotgan karbonat angidrid (SO2) probirkaga to’planadi. Keyin probirkaning og’zi barmoq bilan bekitilib, pastga qaratilgan holda barmoq olinadi va darhol 10% li ishqor quyilgan stakanga botirib qo’yiladi. Probirkadagi SO2 gazi ishqor bilan reaksiyaga kirishadi. Undagi gaz o’rnini ishqor oladi, ya’ni probirkani to’ldiradi. Ayni vaqtda kolbadan ajralib chiqayotgan gaz ikkinchi probirkaga to’ldirib olinadi va u yonishga yordam bermaganligi aniqlanadi.


37 - rasm. Suv hammomlarining turlari.





Achitqi zamburug’larini mikroskopda ko’rish uchun pivo achitqisidan foydalanish mumkin. Agar pivo achitqisi bo’lmasa, quruq achitqi (xamirturush) suvda eziladi va eritiladi. SHu tartibda tayyorlangan eritmadan buyum oynasiga bir tomchi tomizib, usti qoplag’ich oyna bilan yopiladi.




/

38 - rasm. Spirtli bijg’ish jarayonini kuzatish asbobi: a - shakar bilan achitqi aralash eritma solingan kolba; b - suv hammomi; v - spirtli bijg’ish vaqtida ajralib chiqqan SO2 gazini to’plab olish uchun qo’yilgan probirka; g - shtativ; d



- spirt lampasi.



Preparatda kurtaklanish yo’li bilan ko’payayotgan saxaromises sereviziya nomli zamburug’ borligi ko’zga tashlanadi. U oval shaklda bo’ladi. SHu preparatning o’zida boshqa shakldagi zamburug’larni ham ko’rish mumkin (39- rasm).




15-LABORATORIYA MASHG’ULOTI

Zamburug’lar tarkibida hayvon kraxmali-glikogen to’planadi. Uni aniqlash uchun preparatga yod eritmasi tomiziladi. yod ta’sirida glikogen kizg’ish-qo’ng’ir rangga kiradi.


39 - rasm. Achitqi zamburug’lari: a - Saceharomyces certvisiae, b - Saceharomyces elllp soldeus; v - kurtaklanish jarayonida hosil bo’lgan koloniya; g - sporali hujayralar.





Download 411 Kb.

Do'stlaringiz bilan baham:
1   2   3




Ma'lumotlar bazasi mualliflik huquqi bilan himoyalangan ©fayllar.org 2024
ma'muriyatiga murojaat qiling