O‘zbеkistоn rеspublikаsi

Вопросы к главе
1.Расскажите о методе серийных разведений?
2. Как получают колонии?
3. Как готовят твердую среду для учета Т. Ferrooxidans?
4. Какая должна быть концентрация H₂SO₄ , рН среды?
5. Кто предложил метод реплик на бумаге с сульфидом таллия?
(На чем основан тест?)
6. Что является особенностью методов камер Тома, Петрова,
Хаузера и др.?
7. Что можно определить методом косвенного окрашивания флуоресцентными антителамй?
8. В чём заключается метод количественного определения Т.Ferrooxidans?


Практическая работа №10
Исследование и определение биомассы Т. Ferrooxidans , экспресс-методом
Цель работы: Ознакомить студентов с исследованиями и определением биомассы Т.Ferroksidans , экспресс - методом.
Концентрацию сырой биомассы в культуре можно определить по Коврову и др. центрифужным методом. Для этого в специальную пробирку, изготовленную из оргстекла (рис 5.1.), наливают некоторый объем культуры ,например, 5 мл и центрифугируют при 6000 об/мин в течение часа. После этого по отградуированному узкому цилиндру пробирки определяют объем упакованных клеток. Объем пробирки должен быть около 5 мл, но при работе с разбавленными культурами порядка 0,1 г/л биомассы объем может быть увеличен до 25- 50 мл. Внешние размеры пробирки определяются посадочным гнездом применяющейся центрифуги, которая должна иметь ротор с поворотными стаканами. Измерительная часть пробирки - цилиндрическое сверление диаметром 1,5 - 3 мм (чем тоньше сверление и длиннее измерительный цилиндр, тем точнее измерение). Объем всего измерительного канала пробирки должен быть примерно вдвое больше, чем среднее ожидаемое количество биомассы клеток в объеме культуры, помещаемом в пробирку для измерения концентрации. Градуировка пробирки проводится следующим образом. В пробирку вводится вода в количестве, которое по расчету должно заполнить ее измерительный канал (количество воды определяется взвешиванием пробирки). Кратковременным центрифугированием вода осаживается в измерительный канал пробирки и по верхнему уровню воды наносится метка. После этого расчетным путем определяются и наносятся все промежуточные метки. Например, в пробирке, рассчитанной на 5 мл культуры, удобно наносить метки через 5 мг воды в канале. Тогда каждое деление измерительного цилиндра пробирки соответствует концентрации сырой биомассы в г/л.
Предполагается, что удельный вес сырой биомассы бактерий мало отличается от единицы. Снятие отсчета по шкале проводят с точностью ¹/₄ деления, т.е. 0.25 г/л, что соответствует при концентрации сырой биомассы 10 г/л ошибке -⁺ 2,5% измеряемой величины.
При измерении концентрации в более плотных средах в пробирку может быть внесено меньшее количество культуры, например, 2,5 мл вместо
5 мл., тогда цена деления шкалы пробирки увеличивается соответственно вдвое. При измерении концентрации биомассы в жидких культурах для повышения точности измерения можно накапливать осадок клеток из нескольких порции культуры последовательной центрифугируемости в одной и той же пробирке.
Для определения концентрации сухой биомассы клеток пользуются пересчетным коэффициентом 0,26 - отношение массы сухих клеток к сырым, которая периодически в ходе экспериментов проверяется весовым методом.
При определении концентрации бактерий в пульпе твердую часть отделяют путем центрифугирования при 300х g в течение 10 мин. Для определения концентрации биомассы используются центрифуженные пробирки из полированного оргстекла объемом 50 см³ с капиллярами диаметром 0,8, 1,13, 3 мм. Аликвотную часть раствора (1-5 мл и более) помещают в пробирки, центрифугируют при 6,5 тыс.x g, в течение 45 мин. Тонкие взвеси ярозита, гидратов железа и т.п. растворяют добавлением к пробе до центрифугирования НСl (рН 0,8-1,1). Другие авторы капиллярные пробирки калибруют в миллиграммах биомассы, приходящейся на 1 мм его высоты (плотность сырой биомассы принята равной 1,01). При высоте столба осевших в капилляре клеток определяет их массу в аликвотной части (в мг) и, зная объем раствора, рассчитывают концентрацию бактерий в жидкой фазе пульпы - m (г/л). В качестве контроля в отдельных случаях следует использовать и др. методы оценки биомассы клеток бактерии, как, например, метод 10 - кратных предельных разведений на среде 9 К с расчетом наиболее вероятного числа клеток или модифицированный метод Питерсона для определения белка, приведенный ниже.
Для пересчета биомассы (г/л) в количество клеток (кл /мл) используется уравнение: Х= m 3.8 10 ⁹,
Где Х- количество бактерий в 1 мл жидкой фазы пульпы, кл /мл;
m - масса бактерий, г/л.

Рис.5.1. Центрифужная пробирка для определения концентрации сырой биомассы Т.Ferrooxidans