O‘zbеkistоn rеspublikаsi

Подсчет колоний
Колонии получают обычно при высеве бактерий на поверхность твердой среды или помещая на них мембранные фильтры после фильтрования растворов.
Существует правило, согласно которому оптимальное для подсчета число колоний на чашку лежит в пределах от 30 до 300.
Нижний предел устанавливается из соображения статической достоверности, а верхний - из-за опасности слияния отдельных колоний.
При приготовлении твердых тел для культивирования хемолитоавтотрофных ацидофильных бактерий к жидким средам добавляют отмытый агар, агарозу. Используют также гелевые пластинки или пластинки из полиакриламидного геля
Поскольку число клеток бактерий в пробах руды или воды, как правило, перед анализом неизвестно, то делают несколько разведений, например,10^-1 10^-2 и т.д.
Затем 0.1 мл разведенной культуры наносят на поверхность твердой среды в чашке Петри. Для этого 2-3 капли капают на поверхность, а оставшуюся в пипетке жидкость выдувают. Культуру равномерно распределяют по поверхности твердой среды шпателем. Затем чашку Петри опрокидывают дном вверх и помещают в термостат при оптимальной для роста бактерий температуре. После инкубации и появления колоний проводят их подсчет. Интерпретация полученных данных будет зависеть от того, насколько число выросших колоний соответствует исходному числу клеток в инокулуме. Чтобы оценить эту зависимость для изучаемых бактерий необходимо использовать по крайней мере, в первое время, ряд методов количественного учета бактерий в инокулуме.
Твердую среду для учета Т. Ferrooxidans готовят путем смешения 0,06 н раствора серной кислоты, содержащего в г/л: К₂НРО₄ 0,8, MgSO₄x7H₂O 0,8 ; (NH₄ ) ₂SO₄ 0,8; FeSO₄x7H₂O, 66,6 с равным объемом агара или агарозы в воде. Обе части среды автоклавируют отдельно при давлении 5 фунтов/кв. дюйм в течение 10 мин. Среду разливают по 40 мл в стерильные чашки Петри.
Исходное значение рН твердой среды соответствует 1,5. Серию разведений Т. Ferrooxidans готовят, используя 0,01н H₂SO₄. от 5 до 100 мл суспензии, фильтруют через мембранные фильтры диаметром 47 или 50 мм с размерами пор 0,45 мкм.
Фильтры предварительно кипятят в стерильной воде в течение 10 мин и оставляют в воде на 24 часа.
После фильтрования мембранные фильтры с бактериями помещают на твердую среду и чашки инкубируют при 30 ⁰С в течение 15 дней или более.
Благоприятные условия для роста колоний создают при концентрации агара не более 0,3 % (вес/об.). Образование колонии T. Ferrooxidans на твердых средах имело место при содержании в посевном материале примерно 10⁴ клеток на чашку.
После инкубации мембранные фильтры помещают на фильтрованную бумагу (ватман № 17) и смачивают 1% (об/об) раствором кислого фуксина для окрашивания колоний. Затем фильтры высушивают при комнатной температуре и подсчитывают клетки с помощью стереомикроскопа (х20).
Метод реплик на бумаге с сульфидом талия предложен Галлизии и Феррари для идентификации ряда тиобацилл. Тест основан на способности T.Thioparus и T.Thiooxidans окислять тиосульфат до сульфата с образованием серы, которая откладывается в колониях. Этот факт был использован для определения наличия бактерий, образующих серу. Пластинки с колониями бактерий реплицируются на бумагу с сульфидом таллия, которая затем помещается в разбавленную азотистую кислоту. Предварительно бумага увлажняется пиридином, чтобы быстро растворить кристаллическую серу. Черная бумага с сульфидом таллия обесцвечивается за исключением тех мест, где присутствует свободная сера. Обесцвечивание связано с образованием полисульфида таллия, который является нерастворимым в разбавленных минеральных кислотах. Если сера присутствует, коричневые пятна проявляются на бумаге на той стороне, реплицированной колониям. Коричневые пятна позволяют оценить присутствие тиобацилл в исходном образце. Этот метод оказался более чувствителен и дал более точные результаты учета T.Thioparus и T.Thiooxidans в почве, чем метод предельных десятикратных разведений.