Protočna citometrija dr Milica Pešić


Download 459 b.
Sana01.01.2018
Hajmi459 b.


Protočna citometrija

  • dr Milica Pešić
























Ispitivanje

  • Izvor svetlosti fokusiran na ćelije

  • Izvor svetlosti

    • Na većini instrumenata – laser
    • Laser Light amplification by stimulated emission of radiation Lasers can provide a single wavelength of light (monochromatic)
    • Obezbeđuju snagu (miliW-W)
    • Obezbeđuju koherentno svetlo
    • Pomažu stvaranju stabilnog i pouzdanog signala
    • Koherentna svetlost: svi emitujući fotoni imaju istu talasnu dužinu, fazu i pravac kao stimulirajući fotoni




Bočno rasipanje

  • Svetlost koja se rasipa pod uglom od 90° u odnosu na putanju lasera se očitava na kanalu: “Side Scatter Channel”

  • Jačina ovog signala je proporcionalna strukturiranosti citoplazme (granulisanost, ćelijski sadržaj itd.)

  • Side Scatter Channel = SSC



Zašto posmatramo FCS vs. SSC ?

  • Pošto je FSC ~ veličina, a SSC ~ unutrašnja struktura, njihovo uporedno merenje nam dozvoljava da razlikujemo ćelijske tipove u heterogenoj populaciji ćelija



Kanali za fluorescencu

  • Dok laser ispituje ćeliju, fluorohromi na ili u ćeliji mogu apsorbovati svetlost i ekscitirati se

  • U toku napuštanja svog eksitiranog stanja, fluorohromi oslobađaju energiju u formi fotona specifične talasne dužine, veće od ekscitatorne

  • Ovi fotoni prolaze kroz sakupljajuća sočiva, razdvajaju se i usmeravaju se ka specifičnim kanalima uz pomoć filtera



Filteri

  • Svetlost različitih talasnih dužina se rasipa sa ćelije i treba je podeliti na specifične talasne dužine koje bi se nezavisno očitale

  • Optički filteri upijaju ili odbijaju određene talasne dužine, a prenose neke druge

  • 3 tipa filtera

    • Dugo-prolazni filter
    • Kratko-prolazni filter
    • Trakasto-prolazni filter


Dihroični filteri





Višekanalni raspored optike

    • spektralne karakteristike fluorohroma koji se koriste
    • odgovarajuća pozicija filtera








Kompenzacija

  • Fluorohromi fluoresciraju duž šireg dela spektra (100nm ili više)

  • U zavisnosti od rasporeda filtera, detektor može očitati fluorescencu sa više od jednog fluorohroma

  • Kompenzacija se i vrši da bi jedan detektor preneo signal samo sa jednog fluorohroma





Elektronika

  • Detektori sakupljaju fotone svetlosti i pretvaraju ih u struju

  • Elektronika obrađuje svetlosni signal i pretvara stuju u digitalizovani zapis koji se oslikava na kompjuteru



Prag čitanja signala

  • Kada laser ispituje ćeliju, svetlost se rasipa

  • Ako količina rasute svetlosti premaši prag elektronika se otvara podešavanjem okvira vremena za detekciju signala

  • Prag se može podesiti na bilo kom parametru, ali se uobičajno podešava na FSC



Naponski puls

  • Kako ćelija prolazi kroz laser, sve više i više svetlosti se rasipa, dok ćelija ne dospe u centar laserskog snopa (maksimum)

  • Kako ćelija napušta laser, sve manje i manje svetlosti se rasipa

  • Nakon podešenog vremena, okvir čitanja se zatvara do sledeće ćelije koja rasipa dovoljno svetlosti da bi se okvir čitanja aktivirao



Linearni i logaritamski amplifikatori

  • Struja koja izlazi iz detektora prolazi kroz linearni ili logaritamski amplifikator gde se pretvara u naponski puls

  • Jačina napona se može podesiti umnožavanjem na linearnoj skali ili pretvaranjem u logaritamsku skalu

  • Upotreba logaritamskog amplifikatora je korisna pri očitavanju širokog opsega fluorescence, koja se tada može suziti – uobičajno za većinu distribucija u biologiji

  • Linearno umnožavanje se koristi pri analizi DNK ili merenju protoka Ca 2+



Tumačenje rezultata

  • Kada se brojke za svaki parametar nađu u “list mode file”, specijalizovani program ih može grafički prikazati

  • Podaci mogu biti prikazani u 1, 2, or 3 dimenzionalnom formatu

  • Uobičajni programi su…

    • CellQuest
    • Flowjo
    • WinMDI
    • FCS Express






Graničnik

  • Koristi se da se izoluje podgrupa ćelija na nacrtu

  • Omogućava proučavanje parametara baš na toj podgrupi ćelija



Ključne tačke analize

  • Za kakvim podatkom tragamo?

    • Intenzitet fluorescence
    • Procenat pozitivnih ćelija
    • Koliko pozitivnije je x od y
    • Odnos između parametra 1 and parametra 2
  • Koji tip statistike koristimo?

    • MFI (geometrijski ili aritmetički)
    • %
    • CV
    • Median
    • Bilo šta što se može uraditi sa dobijenim brojkama
  • Sve je relativno

  • To što ćelije imaju srednji intenzitet fluorescence (MFI) = 100, ne znači ništa dok se ne očita i negativna kontrola

  • Činjenica da je sve relativno dozvoljava da se uporedi 2, 3, ili 20 uzoraka sa istim podešavanjem



Puštanje uzoraka

  • Pripremiti uzorke

  • Jedan uzorak je kompletno negativan i analizira se prvi – Koristi se za podešavanje PMT amplifikacionog napona

  • Podesiti PMT napon dok se ne pojavi pik analizirane populacije u prvoj dekadi parametra 1 ili na dvoparametarskom nacrtu, gde se koristi za podešavanje spektralnog preklapanja

  • Kada je podešavanje optimizovano, pustiti uzorke i sakupiti podatke



Svaka ćelija stvara kvant fluorescence

      • Svaka ćelija stvara kvant fluorescence


Očitavanje negativnih ćelija



Jednoparametarski histogram



Rasipanje svetlosti –dvoparametarski histogram



Dvoparametarski histogram



Podaci sa protočnog citometra
































Do'stlaringiz bilan baham:


Ma'lumotlar bazasi mualliflik huquqi bilan himoyalangan ©fayllar.org 2017
ma'muriyatiga murojaat qiling