Protočna citometrija dr Milica Pešić

Protočna citometrija

• dr Milica Pešić

Ispitivanje

• Izvor svetlosti fokusiran na ćelije

• Izvor svetlosti

• Na većini instrumenata – laser
• Laser Light amplification by stimulated emission of radiation Lasers can provide a single wavelength of light (monochromatic)
• Obezbeđuju snagu (miliW-W)
• Obezbeđuju koherentno svetlo
• Pomažu stvaranju stabilnog i pouzdanog signala
• Koherentna svetlost: svi emitujući fotoni imaju istu talasnu dužinu, fazu i pravac kao stimulirajući fotoni

Bočno rasipanje

• Svetlost koja se rasipa pod uglom od 90° u odnosu na putanju lasera se očitava na kanalu: “Side Scatter Channel”

• Jačina ovog signala je proporcionalna strukturiranosti citoplazme (granulisanost, ćelijski sadržaj itd.)

• Side Scatter Channel = SSC

Zašto posmatramo FCS vs. SSC ?

• Pošto je FSC ~ veličina, a SSC ~ unutrašnja struktura, njihovo uporedno merenje nam dozvoljava da razlikujemo ćelijske tipove u heterogenoj populaciji ćelija

Kanali za fluorescencu

• Dok laser ispituje ćeliju, fluorohromi na ili u ćeliji mogu apsorbovati svetlost i ekscitirati se

• U toku napuštanja svog eksitiranog stanja, fluorohromi oslobađaju energiju u formi fotona specifične talasne dužine, veće od ekscitatorne

• Ovi fotoni prolaze kroz sakupljajuća sočiva, razdvajaju se i usmeravaju se ka specifičnim kanalima uz pomoć filtera

Filteri

• Svetlost različitih talasnih dužina se rasipa sa ćelije i treba je podeliti na specifične talasne dužine koje bi se nezavisno očitale

• Optički filteri upijaju ili odbijaju određene talasne dužine, a prenose neke druge

• 3 tipa filtera

• Dugo-prolazni filter
• Kratko-prolazni filter
• Trakasto-prolazni filter

Dihroični filteri

• Mogu biti dugo- ili kratko-prolazni

• Filter je pod uglom od 45º u odnosu na upadno svetlo

• Deo svetlosti se odbija pod uglom od 90º u odnosu na upadno svetlo i usmerava ka detektoru, a deo se prenosi i nastavlja dalje

Višekanalni raspored optike

• spektralne karakteristike fluorohroma koji se koriste
• odgovarajuća pozicija filtera

Kompenzacija

• Fluorohromi fluoresciraju duž šireg dela spektra (100nm ili više)

• U zavisnosti od rasporeda filtera, detektor može očitati fluorescencu sa više od jednog fluorohroma

• Kompenzacija se i vrši da bi jedan detektor preneo signal samo sa jednog fluorohroma

Elektronika

• Detektori sakupljaju fotone svetlosti i pretvaraju ih u struju

• Elektronika obrađuje svetlosni signal i pretvara stuju u digitalizovani zapis koji se oslikava na kompjuteru

Prag čitanja signala

• Kada laser ispituje ćeliju, svetlost se rasipa

• Ako količina rasute svetlosti premaši prag elektronika se otvara podešavanjem okvira vremena za detekciju signala

• Prag se može podesiti na bilo kom parametru, ali se uobičajno podešava na FSC

Naponski puls

• Kako ćelija prolazi kroz laser, sve više i više svetlosti se rasipa, dok ćelija ne dospe u centar laserskog snopa (maksimum)

• Kako ćelija napušta laser, sve manje i manje svetlosti se rasipa

• Nakon podešenog vremena, okvir čitanja se zatvara do sledeće ćelije koja rasipa dovoljno svetlosti da bi se okvir čitanja aktivirao

Linearni i logaritamski amplifikatori

• Struja koja izlazi iz detektora prolazi kroz linearni ili logaritamski amplifikator gde se pretvara u naponski puls

• Jačina napona se može podesiti umnožavanjem na linearnoj skali ili pretvaranjem u logaritamsku skalu

• Upotreba logaritamskog amplifikatora je korisna pri očitavanju širokog opsega fluorescence, koja se tada može suziti – uobičajno za većinu distribucija u biologiji

• Linearno umnožavanje se koristi pri analizi DNK ili merenju protoka Ca 2+

Tumačenje rezultata

• Kada se brojke za svaki parametar nađu u “list mode file”, specijalizovani program ih može grafički prikazati

• Podaci mogu biti prikazani u 1, 2, or 3 dimenzionalnom formatu

• Uobičajni programi su…

• CellQuest
• Flowjo
• WinMDI
• FCS Express

Graničnik

• Koristi se da se izoluje podgrupa ćelija na nacrtu

• Omogućava proučavanje parametara baš na toj podgrupi ćelija

Ključne tačke analize

• Za kakvim podatkom tragamo?

• Intenzitet fluorescence
• Procenat pozitivnih ćelija
• Koliko pozitivnije je x od y
• Odnos između parametra 1 and parametra 2

• Koji tip statistike koristimo?

• MFI (geometrijski ili aritmetički)
• %
• CV
• Median
• Bilo šta što se može uraditi sa dobijenim brojkama

• Sve je relativno

• To što ćelije imaju srednji intenzitet fluorescence (MFI) = 100, ne znači ništa dok se ne očita i negativna kontrola

• Činjenica da je sve relativno dozvoljava da se uporedi 2, 3, ili 20 uzoraka sa istim podešavanjem

Puštanje uzoraka

• Pripremiti uzorke

• Jedan uzorak je kompletno negativan i analizira se prvi – Koristi se za podešavanje PMT amplifikacionog napona

• Podesiti PMT napon dok se ne pojavi pik analizirane populacije u prvoj dekadi parametra 1 ili na dvoparametarskom nacrtu, gde se koristi za podešavanje spektralnog preklapanja

• Kada je podešavanje optimizovano, pustiti uzorke i sakupiti podatke

Svaka ćelija stvara kvant fluorescence

• Svaka ćelija stvara kvant fluorescence

Očitavanje negativnih ćelija

Jednoparametarski histogram

Rasipanje svetlosti –dvoparametarski histogram

Dvoparametarski histogram

Podaci sa protočnog citometra