Техника приготовления мазка, окраска простым методом


Download 5.71 Mb.
bet30/38
Sana16.11.2023
Hajmi5.71 Mb.
#1781609
TuriУчебно-методическое пособие
1   ...   26   27   28   29   30   31   32   33   ...   38
Bog'liq
лаб.работы 2019. Microsoft Word

ЛАБОРАТОРНАЯ РАБОТА №16
«ИММУНОБЛОТИНГ И ПОЛИМЕРАЗНАЯ ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ».
Цель лабораторной работы
- Знакомство с современными методами диагностики – применение реакций ИБ и ПЦР в практическом здравоохранении.
Задачи педагога:
- Ознакомление студентов схемой постановки реакции иммуноблотинга и полимеразной цепной реакции.
- Объяснить значения и механизмиммуноблотинга и полимеразной цепной реакции.
Результаты работы
Студент должен знать:

  • Схему постановки реакции иммуноблотинга и полимеразной цепной реакции.

  • Значение и механизм реакции иммуноблотинга и полимеразной цепной реакции

Студент должен уметь:

  • Разбираться в последовательности проведения иммуноблотинга.

  • Разбираться в последовательности проведения полимеразной цепной реакции.

  • Полимеразная цепная реакция

  • Полимеразная цепная реакция (ПЦР) был разработана в 1983 году Керри Мюлли сыном, он был удостоен в 1993 году Нобелевской премии по химии.Открытие метода ПЦР было большим успехом в области молекулярной генетики, прежде всего, дало возможность обнаружить геномы целого ряда микроорганизмов. ПЦР анализ дал возможность диагностировать многие инфекционные заболевания, а также трудно культивируемые агенты, генотипирование возбудителя, оценивать их вирулентность, определить устойчивость микроорганизмов к антибиотикам, перинатальную диагностику, а также выявлять загрезнённость препаратов крови.

  • Фермент ДНК-полимеразы бактерий, которые живут в гейзерах, дал уникальную возможность для изучения ПЦР. Эти ферменты очень термостойкие, оптимум 72 °С.

  • В настоящее время детекция результатов ПЦР -диагностики проводится в следующих системах:

  • - Гель-электрофорез;

  • - ГТФ –гибридизационно-ферментный анализ;

  • - FLASH – флюоресцентная детекция результатов;

  • - ПЦР флюоресцентная детекция во время ПЦР диагностики (в реальном времени).

  • Метод ПЦР имеет следующие преимущества:

  • 1. Доказательство заболевания с помощью выявления конкретных частей ДНК / РНК возбудителя;

  • 2. Высокая специфичность связана с определением конкретного фрагмента ДНК возбудителя в исследуемом материале;

  • 3. Высокая чувствительность выявления вирусов, даже в пределах одной клетки;

  • 4. Универсальность. Могут быть иследованы различные биологические материалы (слизь, моча, мокрота, эпителиальные клетки, кровь, сыворотка);

  • 5. Быстрота получения результатов анализа;

  • 6. Можно диагностировать не только острые, но даже инфекции в латентных формах.

  • Ограничения использования метода ПЦР:

  • - При подготовке опытного материала и/или биологического материала, полученного экстракцией, при смешивании реакционной смеси , существует возможность контаминации, что может дать ложноположительные результаты;

  • - большое значение имеет контаминация с продуктами амплификации, т.к. вследствие реакции накапливаются амплификоны в большом количестве.


  • Факторы, влияющие на результаты ПЦР:

  • 1. Взятие биологического материала, хранение, транспортировка и обработка;

  • 2. Некачественное разделение нуклеиновых кислот;

  • 3. Качество функции оборудования (в первую очередь, амплификатора).

  • Для ПЦР-диагностики биологический материал забирается в стерильную одноразовую пластиковую пробирку. Необходимо проводить экстракцию нуклеиновых кислот и ПЦР-диагностику строго в соответствии с инструкцией, которая прилагается к диагностическому набору. Перед ПЦР-диагностикой обрабатывается биологический материал и отделяется нуклеиновая кислота.

  • Технология постановки метода ПЦР-

  • 1. Утренняя цельная кровь, плазма крови, сыворотка, цереброспинальная жидкость берётся в соотношении 1:20 в пробирку с 6% -ным раствором ЭДТА. Пробирку с периферической кровью, которая герметично закрыта, перемешивают переворачиванием. Чтобы отделить плазму пробирку с кровью центрифугируют в течение 20 минут при обороте 1600. Сыворотку получают стандартным методом. Цереброспинальная жидкость не проходит предварительной обработки.

  • 2. Внутренние органы домашних животных, а также секционные материалы гомогенизируются в фарфоровой посуде, а затем готовят из них раствор суспензии растворяя в стерильном физ.растворе или 10% -ном фосфатном буфере.

  • 3. Перед приготовлении суспензию из мух и комаров сначала определяется их тип , затем из "пакета" (не более 50) гомогенизируют в физ. растворе или буфере, центрифугируют при обороте 10000 и 100 мкл надосадочной жидкости берут на исследование.

  • 4. Для приготовления суспензии из клешей, сначала определяется вид, и затем, как указано выше, готовится суспензия для исследования.

  • Выделение ДНК / РНК включают в себя следующее:

  • - биологические материалы;

  • - лизис клеточных и вирусных оболочек

  • - деструкция нуклеопротеидного комплекса;

  • - инактивация и удаление экзо- и –эндогенных нуклеаз;

  • - инактивация и удаление ингибиторов ПЦР.

  • Последний продукт экстракции – чистый препараты ДНК и РНК.

  • Полимеразная цепная реакция – синтез копий фрагментов отмеченной части ДНК в пробирке. Этот метод основан на естественной фермента репликации ДНК-полимеразы.

  • Репликация ДНК состоит из нескольких этапов:

  • 1. денатурация ДНК (распад две спирали ДНК);

  • 2. появления двух коротких цепочек ДНК (необходим для инициации синтеза ДНК);

  • 3. Синтез новой цепи ДНК (завершение комплементарного строения двух нитей ДНК).

  • Синтез комплементарной цепи начинается из стартовых блоков – двух коротких двухнитевых частей. Этот процесс синтеза ДНК конкретного участка происходит только в этой части, а не вдоль цепи ДНК. В синтезе компонентов ДНК участвуют два олигонуклеотида, известные как праймеры. Праймеры находятся с левой и правой стороны специфических фрагментов ДНК и ограничивают синтез комплементарных последовательностей ДНК между ними. Для получения нужного количества ДНК цикл амплификации повторяется (от 20 до 40).

  • Для проведения амплификации необходимы следующие комплементы:

  • 1. Начальная молекула ДНК, содержащаяся в специфическом фрагменте (матрица).

  • 2. Праймеры, последовательно комплементарные ДНК, на границе исследуемого специфического участка (синтетические олигонуклеотиды 20 - 30 пар нуклеотидов).

  • 3. Дезоксинуклеотидтрифосфаты (материал для синтеза нового комплементарного фрагмента ДНК)

  • 4. Фермент Taq-полимераза (термоустойчивая ДНК-полимераза, катализирующая соединение увеличивающихся праймеров из цепи ДНК).

  • 5. Буферный раствор (содержащий Mg 2 + ион реакционная среда, которая необходима для поддержания активности ферментов).

  • Каждый цикл амплификации включает в себя 5 этапа, проходящие при различных температурах

  • 1 этап - денатурации ДНК (разрыв двух спиралей).протекает при 93° - 95°С в течение 30 - 40 секунд.

  • 2 этап – соединения праймеров (смягчение). Протекает в специфических частях нити ДНК – комплементарный синтез нитей ДНК. Для смягчения каждой пары праймера существует своя температура, обычно она в пределах 50-65 ° С в течение 20-60 секунд.

  • 3 - этап – завершение синтеза цепи ДНК. Синтез комплементарной цепи ДНК завершается от 5 до 3 последовательности конечной цепи. Для синтеза новой ДНК материалом служит дезоксинуклеотидтрифосфаты. Синтез ДНК катализируется термостабильным ферментом (Taq-полимераза) и проходит при температуре 70-72 ° С. Синтез происходит в течения - 20-40 секунд.Вновь синтезированная цепь ДНК первого цикла амплификации служит в качестве матрицы для следующего цикла, так появляется специфические фрагменты ДНК (ампликоны). Амплификоны служат матрицей для последующих синтезов. Таким образом, по формуле 2n происходит накопление ампликонов, где n число циклов амплификации. Следовательно, если в исходном растворе была одна молекула ДНК, то после 30 -40 циклов их количество увеличилось до 108 молекулы ампликонов. Это достаточное количество для детекции.



  • Рисунок 65. Схема постановки ПЦР. дДНК- дезоксинуклеотидтрифосфат

  • Исследование наличия РНК ПЦРом в биологическом материале состоит из следующих этапов:

  • - экстракция РНК из исследуемых образцов;

  • - проведение обратной транскрипции и амплификации в режиме «реального времени» с флюоресцентной детекции;

  • - Анализ и интерпретация полученных результатов.

  • Для анализа результатов каждого этапа ПЦР-анализа, необходимо отделить различные этапы территориально, они размещаются в отдельных комнатах. Лабораторная диагностики проводится поочередно (в последовательности) и комнаты должны сообщаться друг с другом.

  • ●Комната приёма, регистрации и первичной обработки биологических материалов.

  • ●В комнате предыдущей комнате ПЦР-диагностике проводится экстракция ДНК / РНК, подготовка реакционной смеси для ПЦР (это происходит в различных ламинарных боксах).

  • ● Комната для ПЦР, где проводится детекция продукции. В этой комнате разрешено применять и другие методы диагностики инфекций.

  • Когда используется классический способ ПЦР (гель-электрофорез) требуются дополнительные комнаты.

  • Обработка биологических материалов и приготовление реакционной смеси проводится в комнате с ультрафиолетовыми лампами и ламинарным столом.

  • В комнате ПЦР – диагностики должны быть свои наборы лабораторных реагентов, автоматические пипетки (дозаторы), пластиковые и стеклянные посуды, лабораторное оборудование, халаты и перчатки.

  • В каждом из них должны быть отметки для того, чтобы не выносить в другую комнату.

  • В лаборатории могут работать специалисты с высшим или средним специальным образованием, обученные в специальных курсах диагностики и прошедшие обучение по биологической безопасности.




Download 5.71 Mb.

Do'stlaringiz bilan baham:
1   ...   26   27   28   29   30   31   32   33   ...   38




Ma'lumotlar bazasi mualliflik huquqi bilan himoyalangan ©fayllar.org 2024
ma'muriyatiga murojaat qiling