Учебное пособие Якупов Т. Р. Молекулярная биотехнология Биоинженерия Казань 2016

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — экспериментальный метод молекулярной биологии, способ значительного увеличения малых концентраций определённых фрагментов ДНК (клонирование) в биологическом материале.
Метод ПЦР относится к гибридизационным методам анализа ДНК, основанным на достраивании комплементарной полинуклеотидной цепи на одинарной полинуклеотидной цепи - матрице. Принцип метода ПЦР был разработан в начале 80-х годов прошлого столетия в США. В настоящее время метод широко используется в научных исследованиях, в практическом здравоохранении и службе Госсанэпиднадзора.
Основные стадии ПЦР
1) денатурация ДНК (расплетение двойной спирали, расхождение нитей ДНК) при 94—96 °C.
2) отжиг при 68 °C, образование коротких двухцепочечных участков ДНК (затравок, необходимых для инициации синтеза ДНК) или связывание нитей ДНК праймерами;
3) элонгация при 72 °C или синтез новой цепи ДНК (комплементарное достраивание обеих нитей);
4) окончание первого цикла. Две получившиеся ДНК-цепи служат матрицей для следующего цикла, поэтому количество матричной ДНК в ходе каждого цикла удваивается.
Таким образом, в основе метода ПЦР лежит многократное удвоение определённого участка ДНК при помощи ферментов in vitro. В результате нарабатывается количество ДНК, достаточное для визуальной детекции.
Кроме простого увеличения числа копий ДНК (этот процесс называется амплификацией), ПЦР позволяет производить множество других манипуляций с генетическим материалом. Широко используется в биологической и медицинской практике, например, для диагностики заболеваний (наследственных, инфекционных), для установления отцовства, для клонирования генов, введения мутаций, выделения новых генов.


Рис.11 Схематическое изображение первого цикла ПЦР.
Разновидности ПЦР
• «Вложенная» ПЦР — применяется для уменьшения числа побочных продуктов реакции. Используют две пары праймеров и проводят две последовательные реакции. Вторая пара праймеров амплифицирует участок ДНК внутри продукта первой реакции.
• «Инвертированная» ПЦР — используется в том случае, если известен лишь небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод особенно полезен, когда нужно определить соседние последовательности после вставки ДНК в геном.
• ПЦР с обратной транскрипцией — используется для амплификации, выделения или идентификации известной последовательности из РНК. Предварительно проводят на матрице мРНК синтез одноцепочечной молекулы ДНК с помощью ревертазы, которая используется в качестве матрицы для ПЦР.
• Количественная ПЦР — используется для быстрого измерения количества определенной ДНК, кДНК или РНК в пробе.
• Количественная ПЦР в реальном времени — в этом методе используют флуоресцентно меченые реагенты для точного измерения количества продукта реакции по мере его накопления.
• ПЦР с использованием горячего старта — модификация ПЦР с использованием парафина для разделения верхней и нижней смесей с целью недопущения раннего смешивания компонентов реакции.
• RAPD PCR (Random Amplification of Polymorphic DNA PCR) - ПЦР со случайной амплификацией полиморфной ДНК — используется тогда, когда нужно различить близкие по генетической последовательности организмы. Например, разные сорта культурных растений, породы собак или близкородственные микроорганизмы.
Методы гибридизации.
Гибридизация ДНК, гибридизация нуклеиновых кислот - соединение in vitro комплементарных одноцепочечных нуклеиновых кислот из разных источников  в одну молекулу.
В 1961 году было обнаружено, что если комплементарные цепи ДНК, полученные после денатурации, выдержать при температуре 65°С, они легко спариваются, восстанавливая структуру двойной спирали (ренатурация). Подобные процессы могут происходить между двумя любыми одинарными цепями нуклеиновых кислот (ДНК—ДНК, РНК—РНК, ДНК—РНК) при условии, что они содержат комплиментарные последовательности нуклеотидов.
Если при гибридизации используются участки ДНК (РНК) с известной последовательностью нуклеотидов, то этот метод весьма эффективен для поиска неидентичных, но родственных генов в биопробах. Участки ДНК (РНК) с известной последовательностью нуклеотидов, меченые специальной меткой и используемые для гибридизации называются ДНК (РНК)-зондами. ДНК-зонды применяются в различных целях. Гибридизация ДНК-зонда с РНК, выделенной из анализируемой клетки, может выявить наличие или отсутствие экспрессии гена. Если гибридизации не происходит, значит, ген молчит, не работает. ДНК-зонды также позволяют проводить диагностику инфекционных и наследственных болезней. Методы гибридизации лежат в основе других более современных методов изучения нуклеиновых кислот.
Способность к гибридизации двух препаратов ДНК служит строгим тестом на комплементарность. Существуют два основных способа проведения реакции – это гибридизация в растворе и гибридизация на фильтре.
В случае гибридизации в растворе препараты одноцепочечной ДНК смешивают и отжигают непосредственно в растворе. Данный способ имеет существенный недостаток: цепи препарата ДНК могут одновременно ренатурировать с образованием гибридных, так и исходных двухцепочечных молекул ДНК. Поскольку обе реакции конкурируют между собой, то трудно с нить степень гибридизации.



Рис. 12. Способы гибридизации
Этот недостаток легко преодолеть, если один из препаратов ДНК иммобилизовать так, чтобы он не мог ренатурировать. Для этой цели используют нитроцеллюлозный или нейлоновый фильтры (мембраны), на поверхности которых адсорбируют одноцепочечную ДНК. Затем фильтр с иммобилизованной ДНК инкубируют в растворе второго препарата ДНК, который обычно содержит метку (радиоактивную, флуоресцентную и т.п.). Гибридизация иммобилизованной ДНК и ДНК-зондов (т.е. ДНК, содержащей метку) происходит только в том случае, если их последовательности комплементарны. Анализ результатов гибридизации проводят по метке, оставшейся на фильтре. Этот способ гибридизации используется во многих методах криминалистического ДНК-анализа.
Гибридизация, как один из классических методов исследования нуклеиновых кислот лежит в основе многих других методов, таких как рестрикционный анализ, генная дактилоскопия, технологий филогенетического анализа и др.
В рестрикционном анализе, как известно, фрагменты ДНК различной длины могут быть фракционированы методом электрофореза. Для определения длины фрагментов ДНК на гель наносят ДНК или РНК зонды, т.е. пробу, содержащую смесь фрагментов известной длины. Ориентируясь на расположение зонда и полосы фрагмента ДНК неизвестного размера, устанавливают его длину.