Viruslarning oxirgi suyulish darajasini aniqlash

Viruslarning oxirgi suyulish darajasini aniqlash
Darsning maqsadi: talabalarni viruslarni miqdoriy aniqlash usullari bilan tanishtirish.
Uskunalar va materiallar: vazifalar, logarifmik jadvallar. Nazariy qism.
Virusning titri ostida uning kontsentratsiyasining materialdagi ifodasini tushuning. Virus titri - materialning birlik hajmidagi virus miqdori. Eksperimental infektsiya paytida virusologik ishda yoki virusga qarshi va diagnostik preparatlarni ishlab chiqarish va faoliyatini baholashda ma'lum bir materialdagi viruslar miqdorini aniqlash zarurati doimo paydo bo'ladi. Virus miqdori harakat birliklari yoki faoliyat birliklarida ifodalanadi.
Viruslar yuqumli va gemagglyutinatsiya qiluvchi ta'sirga ega. Demak, viruslar sonining birliklari infektsion va gemagglyutinatsiya qiluvchi hisoblanadi. Amalda uch turdagi virus miqdori birliklari qo'llaniladi:
1. Viruslar keltirib chiqaradigan va bitta ta'sir bilan baholanadigan mahalliy zararning yuqumli birliklari.
2. Yuqumli birliklar 50% viruslarning sezgir tirik ob'ektlarga ta'siri, statik jihatdan baholanadi.
3. Gemagglyutinatsiya qiluvchi birliklar.
PFUda virus titrini aniqlash usuli
Viruslar keltirib chiqaradigan mahalliy lezyonlardan eng mashhuri CAO ustida neytral va pockmark bo'yoq (nekrotik tugunlar) bilan agar muhiti bilan to'ldirilgan infektsiyalangan hujayra kulturalarida blyashka (bo'yalgan tirik hujayralar qatlamidagi o'lik, bo'yalmagan hujayralar orollari) chechak va boshqa viruslar bilan kasallangan tovuq embrionlari.
Keyin virus miqdori mos ravishda blyashka hosil qiluvchi birliklarda (PFU) va chechak hosil qiluvchi birliklarda (PFU) o'lchanishi mumkin: 1 PFU = bitta blyashka keltirib chiqaradigan virus dozasi; 1 POE = bitta pockmarkni keltirib chiqaradigan virus dozasi. PFU (OFU) da virus titrini aniqlash usuli quyidagicha:
1. O'rganilayotgan virusli materialning aniq o'lchangan va qat'iy bir xil hajmlari matraslardagi bir nechta hujayra madaniyatini yoki CAOdagi tovuq embrionlarini yuqtiradi.
2. Har bir jo'ja embrionida har bir to'shakda yoki pockmarkda hosil bo'lgan plitalar sonini hisoblang.
3. Ushbu miqdorning o'rtacha arifmetik qiymatini hisoblang, bu virusni o'z ichiga olgan materialning yuqtiruvchi dozasida virusning PFU yoki OFU soniga teng.
4. Virus titri (T) quyidagi formula bilan hisoblanadi:
T = blyashka (cho'ntaklar) o'rtacha arifmetik soni / yuqumli doza hajmi x virus o'z ichiga olgan materialning suyultirilishi.
Blyashka va pockmarks, agar ularning soni to'shak yoki HAO uchun 50 dan oshmasa, hisoblanishi mumkin, deb ishoniladi. Ba'zida, materialda virusning yuqori konsentratsiyasi bo'lsa, hujayra madaniyatidagi blyashka yoki CAOdagi cho'ntak belgilari birlashishi mumkin va ularni sanab bo'lmaydi. Bunday hollarda, sinov materialining bir necha o'n marta suyultirilishi tayyorlanadi va hujayra madaniyatining teng guruhlari yoki jo'ja embrionlari har bir suyultirish bilan teng dozalarda infektsiyalanadi, so'ngra har bir suyultirish uchun o'rtacha arifmetik blyashka yoki pockmark soni hisoblanadi. Bu holda virus titri yanada murakkab formula yordamida hisoblanadi:
T = har bir suyultirishda o'rtacha arifmetik blyashka soni (cho'ntaklar) yig'indisi / yuqumli dozaning hajmi x virus o'z ichiga olgan materialning suyultirilishi yig'indisi. PFU virusini titrlash usuli virus kontsentratsiyasi bo'yicha eng ishonchli ma'lumotlarni beradi, ammo blyashkalarni sanashda texnik qiyinchiliklarga duch keladi. . Chechak kasalligiga kelsak, ulardan foydalanish jo'ja embrionlarining CAOlarida tugunlar hosil qila oladigan bir nechta viruslar bilan cheklangan.
Blyashka hosil qilish usuli hayotiy bo'yoq - neytral og'izni o'z ichiga olgan agar muhiti bilan to'ldirilgan bir qatlamli kulturalarda virus tomonidan salbiy koloniyalar yoki blyashka shakllanishiga asoslangan. Blyashka - bu virus ta'sirida o'lgan hujayralardan tashkil topgan madaniyatning rangsiz joylari. Ba'zi viruslar agar qatlam qoplamasi bo'lmagan blyashka beradi: teri zararkunandalari virusi, emlash, ba'zi herpes viruslari.
Blyashkalarni o'rnatayotganda, flakonlarda yoki matraslarda o'stirilgan madaniyatlardan foydalanish yaxshidir, madaniyat degeneratsiya belgilarisiz bo'lishi kerak. Hank eritmasi bilan yuvilgan hujayralar virusni ma'lum suyultirishlarda qo'llaydi va virusning hujayralar bilan aloqasini ta'minlaydi, vaqti-vaqti bilan 37-38 ° S haroratda 1-2 soat davomida chayqatiladi. Adsorbsiyalanmagan virus Hanks eritmasi bilan yuviladi yoki Paster pipetkasi bilan so'riladi va hujayra qatlamiga Erl eritmasi, bo'yoq, qoramol zardobi, antibiotiklar va boshqa komponentlar bo'lgan maxsus agar qoplamasi qo'llaniladi. Qoplama muhitini tanlash hujayralar va viruslar turiga qarab belgilanadi. Qattiqlashgandan so'ng, agarning yuzasidan kondensatsiyalangan namlik chiqariladi, flakonlar termostatga o'tkaziladi va hujayralar bilan ma'lum bir virus uchun maqbul bo'lgan haroratda inkubatsiya qilinadi. Bu vaqt ichida viruslar hujayralarga zarar etkaza boshlaydi. Bunday holda, bo'yoq eritmasi faqat tirik hujayralarni bo'yadi. Shuning uchun tirik hujayralar qatlamining qattiq qizg'ish-pushti fonida rangsiz dog'lar (blyashka) paydo bo'ladi - virusdan ta'sirlangan hujayralar. Agar virus yuqori konsentratsiyada bo'lsa, blyashka tezda birlashadi. Blyashka paydo bo'lish vaqti va morfologiyasi virusning turi va shtammiga, hujayra turiga va madaniyat sharoitlariga bog'liq.
50% infektsion faollik birliklarida virus titrini aniqlash usuli.
Bu usul umumiyroq. Virus miqdori (virusli titr) samarali 50% dozada o'lchanadi - ED50.
1 ED50 = infektsiyalangan test sub'ektlarining 50 foizini yuqtirishga qodir virus dozasi.
Har bir virus uchun unga sezgir bo'lgan sinov ob'ekti tanlanadi - laboratoriya hayvonlari (odatda oq sichqonlar), tovuq embrionlari yoki hujayra madaniyati. Virusning turli test tizimlariga yuqumli ta'siri yoki ta'siri o'lim, klinik belgilar, patologik o'zgarishlar va sitopatik ta'sir bilan namoyon bo'lishi mumkin. Laboratoriya hayvonlari va tovuq embrionlarida virusning ta'siri o'limga olib keladigan va yuqumli dozalarda baholanadi:
1 LD50 - laboratoriya hayvonlarining 50% ni o'ldiradigan virus dozasi; I ELD50 - tovuq embrionlarining 50% ni o'ldiradigan virusning dozasi;
1 ID50 - kasallangan laboratoriya hayvonlarining 50 foizida klinik belgilar yoki patologik o'zgarishlarni keltirib chiqaradigan virus dozasi;
1 EID50 - infektsiyalangan tovuq embrionlarining 50 foizida patologik o'zgarishlarga olib keladigan virusning dozasi.
Hujayra madaniyatida virusning ta'siri sitopatik ta'sir yoki ta'sir (CPE) bilan baholanadi:
1 CPD50 - infektsiyalangan hujayra madaniyati bo'lgan sinov naychalarining 50% da sitopatik ta'sir ko'rsatadigan virusning dozasi.
Virus o'z ichiga olgan materialning birlik hajmidagi virusning ED50 (LD50, ELD50, ID50, EID50 va CPD50) miqdori ushbu materialdagi virus titrining ifodasi bo'ladi. Shunday qilib, kirish T = 103,48 CPD50 / 0,1 ml har bir 0,1 ml virus o'z ichiga olgan material 103,48 dozani o'z ichiga oladi, ularning har biri hujayra madaniyati naychalarining 50% da sitopatik ta'sir ko'rsatishga qodir.
Viruslarni 50% infektsion faollik bilan titrlash usuli deyarli har qanday virusni titrlash uchun mos keladi, agar unga sezgir bo'lgan jonli test tizimi tanlangan bo'lsa. Kamchilik - bu murakkablik, muddat va statistik hisoblash zarurati.
Virus titrini 50% infektsion ta'sir birliklarida (LD50, ELD50, ID50, EID50 va CPD50) aniqlash usuli sinovdan o'tgan virus o'z ichiga olgan materialning shunday suyultirilishini topishdan iborat bo'lib, uning yuqumli dozasi hajmi bitta bo'lishi mumkin. ED50, so'ngra virus o'z ichiga olgan materialning bir xil hajmida qancha bunday birlik virus borligini hisoblang. Bu virusning titri bo'ladi. Buning uchun:
1) sinovdan o'tgan virusli materialdan bir qator ketma-ket 10 marta suyultirish tayyorlanadi. Suyultirishlar soni ko'proq bo'lishi kerak (ya'ni, oxirgisi, endi hech qanday yuqumli ta'sir ko'rsatmaydi). Ketma-ket 10 ta suyultirish uchun 10 ta steril naychaning har biriga 9 ml steril fiziologik eritma quyiladi, so'ngra birinchisiga 1 ml sinov suspenziyasi qo'shiladi. Birinchi probirkaning tarkibini aralashtiramiz, 1 ml aralashmani yig'ib, ikkinchi probirkaga soling, tarkibini va ikkinchi probirkadan uchinchisiga 1 ml aralashtiramiz va hokazo.
2) virusni o'z ichiga olgan har bir suyultirishning bir xil hajmlari ushbu virusga sezgir bo'lgan jonli sinov ob'ektlarini yuqtiradi. Ularning har bir guruhida kamida 4-6 ta test ob'ekti (statistik ahamiyatga ega bo'lishi uchun) talab qilinadi;
3) vaqt o'tgandan so'ng, virusning infektsiyalangan ob'ektlarga ta'siri natijasi (o'lim, kasallik, patologik o'zgarishlar yoki sitopatik ta'sir) hisobga olinadi. Laboratoriya hayvonlarining o'limi, TBE birinchi marta 48 soat ichida o'ziga xos bo'lmagan hisoblanadi. Buxgalteriya hisobi ish tugatilgandan keyin 2-3 kun o'tgach tugaydi;
4) virus qanday suyultirishda sezgir ob'ektlarning 50% ga o'z ta'sirini ko'rsatganligini aniqlang. Virusning ta'siri LD50, ELD50, ID50, EID50 va CPD50 da aniqlanadi. Ushbu suyultirishdagi doz 1 ED50 deb hisoblanadi. Virusning dozasi turli usullar bilan hisoblanadi (Reed va Mench, Kerber bo'yicha).
Titrlashni amalga oshirish uchun o'rganilayotgan virusli materialdan 1:10 dan bir necha ketma-ket o'n marta suyultirish tayyorlanadi, ya'ni. 10-1 dan 1:10.000.000.
7 yoki undan ko'p (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 va boshqalar). Suyultirishlar soni virusning taxminiy titriga bog'liq, ular oxirgi (eng yuqori) suyultirish endi yuqumli ta'sir ko'rsatmasligi uchun tayyorlanishi kerak. Virusning yuqumli ta'siri (yuqumli ta'sirning kattaligi) har bir suyultirishda suyultirish (yoki doza) logarifmiga mutanosib ravishda kamayadi. Ya'ni, 1:100 (10-2) suyultirilganda, yuqumli ta'sir ikki baravar kamayadi, agar 1:1000 (10-3) uch marta bo'lsa va hokazo.
O'rganilayotgan virusni o'z ichiga olgan materialning ma'lum bir xil hajmdagi har bir suyultirilishi ushbu virusga sezgir bo'lgan jonli sinov ob'ektlarining teng guruhlarini (laboratoriya hayvonlari, tovuq embrionlari, to'qimalar madaniyati) yuqtiradi. Bu materialni kiritishning ushbu usuli uchun odatda qabul qilingan virusning tropizmi va dozalarini hisobga oladi. Har bir guruh kamida 4-6 ta sinov ob'ektini o'z ichiga olishi kerak, chunki kichikroq raqam bilan materialni statistik qayta ishlash juda katta xatolikka ega bo'ladi.
Biroq, virusning titrini aniqlashda, ulardan biri yuqtirgan hayvonlarning 50% o'limiga olib keladigan bunday suyultirishlarni tanlash juda qiyin. Ko'pincha titrlash paytida tirik va o'lik hayvonlarning soni teng emas. Bunda titrni aniqroq aniqlash uchun virusologiyada Rid va Mench tomonidan taklif qilingan usul keng qo'llaniladi. Ular titrlashda har bir guruhda 4-6 ta sezgir modeldan iborat ko'p sonli guruhlarni tajribaga olishni tavsiya qiladilar. Guruhdagi oz sonli eksperimental hayvonlardan foydalanish tufayli LD50 ning haqiqiy qiymatidan og'ish, o'lim foizini hisoblashda ular umumiy o'lim (kumulyatsiya - to'plash) to'g'risidagi ma'lumotlar bilan ishlaganligi bilan tuzatiladi.
Reed va Mench usuli virusning ma'lum bir suyultirilishi bilan kasallanganda o'ladigan hayvonlar (va boshqa modellar), masalan, 10-5, pastroq suyultirilganda ham o'ladi degan mantiqiy asosga asoslanadi (10-4, 10-3) virus. Agar hayvon bu suyultirishda o'lmagan bo'lsa, u yuqori suyultirilganda ham tirik qoladi (10-6, 10-7). Shu asosda olingan natijalar interpolyatsiya qilinadi va jamlangan ma'lumotlar sifatida ifodalanadi, buning asosida o'lim% i hisoblanadi.
Kümülatif ma'lumotlarni hisoblashda yuqori suyultirishdan o'lgan sichqonlar quyi suyultirishdan o'lganlar soniga qo'shiladi. Pastki suyultirishdan omon qolgan sichqonlar yuqori suyultirishdan o'ldirilmagan hayvonlar soniga qo'shiladi (yo'nalish o'q bilan ko'rsatilgan). Kümülatif ma'lumotlarni olgandan so'ng, o'lim% aniqlanadi. Har bir suyultirish uchun halokatlilik ulushi quyidagi formula bo'yicha hisoblanadi:
O'lim % = O'lganlar soni (jamlangan ma'lumotlar) / Yuqtirilganlar soni (jamlangan ma'lumotlar) x 100
O'lim darajasi 50% ga yaqin bo'lgan suyultirishlar eng yuqori va eng past kritik doza deb ataladi.
LD50 quyidagi formula bilan aniqlanadi:

bu erda LD50 - virusning kerakli suyultirilishi; B - hayvonlarning 50% dan ko'prog'ining nobud bo'lishiga olib keladigan naslchilik; b - suyultirish B ga mos keladigan o'lim darajasi; a - hayvonlarning 50% dan kamrog'ining nobud bo'lishini ta'minlovchi naslchilikka mos keladigan o'lim darajasi; d - suyultirish omili.
Virusning kasr ko'rsatkichli raqam sifatida ifodalangan titri odatda ushbu shaklda qoldiriladi. Uni antilogarifmlar jadvali (4 xonali Bradis matematik jadvallari) yordamida osongina mutlaq qiymatga aylantirish mumkin. Antilogarifmlar jadvaliga ko'ra, 1 LD50 ga mos keladigan suyultirishning mutlaq qiymati topiladi.
Gemagglyutinatsion ta'sir birliklarida virus titrini aniqlash usuli.
Ba'zi viruslar, ma'lum sharoitlarda, hayvonlarning ayrim turlarining eritrotsitlarini aglyutinatsiya qilishga qodir. Bunday viruslarning titri gemagglyutinatsiya birliklarida (HAU) ifodalanishi mumkin.
1 HAU = virus bilan bir xil miqdordagi yuvilgan eritrotsitlarning 1% suspenziyasi tarkibidagi eritrotsitlarning taxminan 50% ni aglutinatsiya qila oladigan virus dozasi.
Gemagglyutinatsiya ta'sirida virusning titrini aniqlash usuli quyidagicha:
1) ma'lum turdagi hayvonlarning yuvilgan eritrotsitlaridan 1% suspenziyani tayyorlash;
2) o'rganilayotgan virusli materialning pleksiglas plitalaridagi ketma-ket 2 marta suyultirilishini teng hajmda tayyorlang;
3) virusli materialning barcha suyultirishlariga bir xil hajmlarda yuvilgan eritrotsitlarning 1% suspenziyasini qo'shing;
4) aralashmalar ma'lum bir haroratda belgilangan vaqtga bardosh beradi va har bir quduqda (naychada) gemagglyutinatsiya intensivligini xochlarda baholaydi. Eritrositlarning 50% aglyutinatsiyalanadigan (kamida ikkita xoch) virus o'z ichiga olgan materialning eng yuqori suyultirilishi 1 HAU ni o'z ichiga oladi.
Virus titri 1 HAU olish uchun material qanday suyultirilgan bo'lsa, shuncha ko'p bo'ladi. Agar gemagglyutinatsiyani ikkita xoch orqali beradigan eng yuqori suyultirish 1:128 bo'lsa, bu 128 marta suyultirilgan virusning titrlash hajmi 1 HAU ni o'z ichiga oladi. Bunday holda, suyultirilmagan materialdagi virus titri 128 HAU ni tashkil qiladi.
Talabalarning mustaqil ishi.
1. Virus titrini nazorat vazifalariga ko'ra alohida hisoblang.