Mavzu: Ozuqa muxitlarini tayyorlash. Bakteriya shtammlarini ekish

4-Amaliy mashg’ulot
Mavzu: Ozuqa muxitlarini tayyorlash. Bakteriya shtammlarini ekish. DNK ajratish uchun eritmalar va asboblarni tayyorlash
Oziq muhitlar. Mikrobiologik amaliyotda bakteriya yoki boshqa mikroorganizmlarni laboratoriya va ishlab chiqarish sharoitida ko‘paytirish uchun qo‘llaniladigan, turli tarkibli murakkab yoki oddiy birikmalardan tashkil topgan ozuqa moddalarga oziqli muhit deb ataladi.
Oziqli muhitlarga qo‘yiladigan talablar:
1.Tarkibi (asosiy xususiyalaridan biri) - ma’lum mikroorganizmlarning ko‘payishi uchun barcha kerakli moddalar tutishi (azot va uglerodni universal manbasi oqsil gidrolizati, peptid va peptonlar, vitamin va mikroelementlarning manbasi o‘simlik, xayvon oqsillari) kerak;
2. Oziq moddalarni bakteriyalar oson o‘zlashtirishlari zarur;
3. Qulay namlik, yopishqoqlik va har bir bakteriyalarga xos rN ga ega bo‘lishi;
4. Izotonik holatda tiniq bo‘lishi kerak;
5. Har bir muhit albatta sterillangan bo‘lishi kerak.
Tarkibi bo‘yicha oqsilli, oqsilsiz va mineral oziqli muhitlar ishlatiladi. Oziqli muhitlar kelib chiqishiga qarab bo‘linadi- tabiiy va suniiy. Tabiiy muhitlar xayvonlar mahsuloti (qon, zardob, o‘t safro, mol go‘shti, tuxum va bosh.) va o‘simliklardan (meva va sabzavotlar) olinadi. Sun’iy muhitlar esa yuqoridagi moddalardan olingan mahsulotlardan (pepton, aminopeptid, achitqi uglevodlar va jo‘xori ekstraktlari) tayyorlanadi. Oziqli muhitda o‘stiruvchi omillarning borligi katta ahamiyatga ega. Ular metabolik jarayonlarda katalizator vazifasini bajaradi, asosan V gruppa vitaminlari, nikotin kislota va boshqalar shular qatoriga kiradi. Yumshoq – qattiqligiga (konsistensiyasiga) ko‘ra oziqli muhitlar qattiq, suyuq va yarim suyuq bo‘ladi. Qattiq muhitlar suyuq muhitga 1,5-2% arap, yarim suyuq muhitga 0,3-0,7% agar qo‘shish natijasida tayyorlanadi. Agar-agar-maxsus dengiz o‘simligini qayta ishlash natijasida hosil bo‘lgan mahsulot bo‘lib u qotirilsa, muhitni qattiq holatga keltiradi. Agar 80-86°C da eriydi, 40°C da qotadi. Ayrim hollarda qattiq oziqli muhitlarni olish uchun (10—15%) jelatin ishlatiladi. Tabiiy muhitlar, ivitilgan qon zardobi, tuxum oqsili o‘z-o‘zidan qattiq holatda bo‘ladi. Bakteriologiya amaliyotida ko‘pincha quruq oziqli muhitlardan foydalaniladi. Ular sanoat ko‘lamida oziq-ovqat uchun ishlatilmaydigan mahsulotlarning arzon gidrolizatlaridan (baliq chiqindilari, go‘sht-suyak uni, -texnik kazein) va oziqli agardan tayyorlanadi. Quruq muhitlarni uzoq vaqt saqlash mumkin, ularni transportda yuborish ham qulay, negaki tarkibi standart, o‘zgarmagan holda saqlanadi. Oziqli muhitlar qo‘llanilishi va nima maqsadda ishlatilishiga ko‘ra saqlab turuvchi, ko‘paytiruvchi asosiy, elektiv, maxsus va differensial-diagnostik turlarga bo‘linadi. Saqlab turuvchi muhitlar. Patogen bakteryalarni saqlanishini taminlaydi va saprofitlarni ko‘payishini to‘xtatishi mumkin. Amaliyotda glitserin aralashmasi (Tiga muhiti), gipertonik eritma, glitserinli konservant va dezoksixolat natriy va bosh. qo‘laniladi. Bu muhitlar asosan bakteriyalarni ma’lum mutdatda saqlash va laboratoriyaga etkazib borishda ishlatiladi. Ko‘paytiruvchi muhitlar. Ma’lum guruh bakteriyalarni ko‘paytirib olishda qo‘llaniladi va birlamchi ekishda ishlatiladi. Masalan bularga (Myuller, Kitta – Tarotssi, tioglikolli muhitlar va selenitli bulon) kiradi. Asosiy muhitlar. Bu muhitlar ko‘pgina bakteriyalarni o‘stirish uchun qo‘llaniladi. Bular baliq mahsulotlarining triptik gidrolizatlari, go’sht bulyonlari yoki kazeinlar bo‘lib, ulardan suyuq muhit - oziqli bulon va qattiq oziqli agar tayyorlanadi. Bunday muhitlar boshqa murakkab muhitlarni tayyorlash uchun asos bo‘ladi. Ko‘rsatilgan muhitlar qandli, qonli, zardobli va boshqa patogen bakteriyalarni oziqli muhitga talabini qondira oladigan aralash muhitlar tayyorlashda ishlatiladi. Ayrim hollarda muhitning asosi sifatida ma’lum mineral tuzlardan tayyorlangan sun’iy muhitlar ishlatilib, ularga aminokislotalar, vitaminlar, glyukoza, pepton, jo‘xori yoki achitqi ekstrakti va boshda oziqli moddalar qo‘shiladi. Elektiv muhitlar. Elektiv oziqli muhitlar turli xil, boshqa mikroflorali materialdan ma’lum turni ajratib olish va uni to‘plashga mo‘ljallangan. Ma’lum mikroblarga elektiv oziqli muhitni yaratishda, bu mikroblarning boshqa ko‘pchilik mikroblardan farqlantiradigan biologik, fermentativ xususiyatlariga asoslaniladi. Masalan qonli zardobli muhitlar bo‘g‘ma, ko‘k yo‘tal qo‘zg‘atuvchisini ajratib olishda (Klauberg II, KUA) tuberkulyozda (Levenshteyn-Yensen) stafilokokklarda natriy xlor tuzining konsentratsiyasi yuqori bo‘lgan muhiti, vabo vibrionida esa - ishqoriy muhit qo‘llaniladi. Differensial-diagnostik oziqli muhitlar. Ayrim turdagi (yoki gruppalar) mikroorganizmlarni bir-biridan ajratish, farqlash uchun ishlatiladi. Differensial-diagnostik muhit tuzilish prinsipiga ko‘ra, bakteriyalar xilma-xil turlarining o‘zaro biokimyoviy faolligi hamda bir xil bo‘lmagan fermentlar to‘plamiga ega bo‘lishi va oziqli muhit tarkibiga kiruvchi substratlarning parchalanishiga asoslangan. Differensial-diagnostik muhitlar tarkibiga quyidagi asosiy komponentlar kiradi: a) bakteriyalarning ko‘payishini ta’minlaydigan asosiy organik, neorganik birikmalar, kazein gidrolizati pepton va boshqalar. qo‘shimcha ma’lum kimyoviy substrat ularni parchalanishi oqibatida muhitni rN nordon tomonga (uglevodlar, mochevina) yoki ishqoriy (oqsillar parchalanishida) o‘zgaradi. Bu xususiyat shu mikrobning diagnostik belgisi hisoblanadi; v) rangli indikator (masalan, Andrede, bromtimol ko‘ki, bromkrezol purpur, krezol qizil indikatori), rangining o‘zgarishi sodir bo‘layotgan biokimyoviy reaksiyadan va tekshirilayotgan mikroorganizmda ushbu ferment sistemasi borligidan dalolat beradi. Agar oziq muhitdagi metobolitlarni parchalasa muhit nordonlashuvi mumkin, Andrede indikatori bor muhit qizarishi, brom timol ko‘k bilan musbat bo‘lishi mumkin, lekin oraliq mahsulot natijasida muhit ishqoriy tomonga siljisa bu ikki indikatorni rangi o‘zgarmaydi. Hamma differensial-diagnostik muhitlar 4 ta asosiy guruxga bo‘linadi.
1. Tarkibida oqsil tutuvchi, bakteriyalar fermentlari ta’sirida harakterli o‘zgaruvchi muhitlar (qon, jelatina, sut va bosh.). Bu muhitlarda bakteriyalarni gemolitik, proteolitik xususiyatlari o‘rganiladi, bulardan eng ko‘p (go‘sht peptonli jelatina, ivitilgan ot qon zardobi, sutli va qonli agar) ishlatiladi.
2. Tarkibida uglevodlar, ko‘p atomli spirtlar tutuvchi indikatorli muhitlar. Bu muhitlarda bakteriyalar uglevodlarni parchalashi oqibatida kislotalar va gaz xosil bo‘ladi, muhitning rN nordon tomonga siljiydi va indikator muhitni rangini o‘zgartiradi. Bakteriologik amaliyotda lakmusli sut (Minkovich muhiti), Giss (Xissa) muhitlari keng qo‘llaniladi. Giss muhitida bakteriyalarni turli uglevodlarni fermentatsiya qilish xususiyati o‘rganiladi. Enterobakteriyalarni farqlashda peptonli uglevod, Andrede indikatori qo‘shilgan va muhitga gaz hosil bo‘lishini aniqlash uchun uzunligi 3 sm bo‘lgan shisha naycha, uning bir tomoni berk, solib qo‘yiladi. Agar bakteriyalar uglevodni parchalasa indikatorni rangi o‘zgaradi, gaz hosil bo‘lsa shisha naychaga gaz yig‘iladi. Giss muhitida bir nechta uglevodlar qo‘llanganligi sababli, bakteriyalar bir uglevodni parchalashi, ikkinchisini esa parchalamasligi mumkin. SHuning uchun uglevodlar qatori olachipor (rangli qator) bo‘lishi mumkin, nomlash shundan kelib chiqgan. Uglevodlardan amaliyotda ko‘pincha monosaxaridlar (glyukoza,arabinoza, mannoza), disaxaridlar (laktoza, maltoza, 87 saxaroza) polisaxaridlardan (kraxmal, glikogen, inulin, dekstrin) va glikozidlardan esa (adonit, inozit, salitsin) ishlatiladi. 3. Bakteriyalar tomonidan ma’lum moddalarni parchalashini, tiklanishini o‘rganuvchi muhitlar (metilen ko‘ki qo‘shilgan sutli muhit, nitratli muhit). Masalan enterokokklar metilen ko‘ki qo‘shilgan sutli muhitda, uni reduksiyaga uchratib, muhitni oqartirib qo‘yadi, S. pyogenis esa muhitni rangini o‘zgartirmaydi.
4. Bakteriyalar tomonidan ma’lum moddalarni o‘zlashtira (assimilatsiya) olishini aniqlovchi muhitlar. Amaliyotda eng ko‘p sitratli agar (Simmons muhiti) qo‘llaniladi. Masalan Salmonella avlodi vakillari Simmons muhitida yaxshi o‘sadi muhit ko‘karadi, ichak tayoqchasi esa sitratli agarda moddalarni assimilatsiya qila olmaydi, muhitni rangini o‘zgartirmaydi. Oziqli muhitlarni tayyorlash. Asosiy muhitlar. Triptik gidrolizat pastasi ma’lum hajmdagi distirlangan suvda eritiladi, rN o‘rnatiladi, tegishli idishlarga quyilib, og‘zi paxta-dokali probkalar bilan berkitiladi va avtoklavda sterillanadi. Oziqli agar kukuni ma’lum hajmdagi suvga solinadi va 10-15 daqiqa davomida qaynatiladi, so‘ngra oziqli Petri kosachalariga yoki probirkalarga quyiladi. Qiyalantirilgan oziqli agar tayyorlash uchun, ichiga agar quyilgan probirkalar stol ustida qiyshaytirilgan holda qotiriladi. Qonli, zardobli va assitli muhitlar. Eritilgan va 45-50°S gacha sovutilgan oziqli agarga steril sharoitda 5-10% fibrinsizlantirilgan qon yoki shu miqdorda qon zardobi, yoki 25% li assit suyuqlik ko‘shiladi, yaxshilab aralashtiriladi va tezda Petri kosachasiga, probirka yoki boshqa laboratoriya idishiga quyiladi. Suyuq muhit tayyorlash uchun oziqli bulonga yuqorida ko‘rsatilgan mikdorda zardob yoki assit suyuqlik qo‘shiladi. Uglevodli muhitlar. Oziqli agar yoki bulonga 0,5-1% di glyukoza yoki boshqa uglevod qo‘shiladi. Oquvchan bug‘ yoki 0,5 atm bosimida bug‘ bilan sterillanadi. Elektiv oziqli muhitlar. 1% peptonli suv, rN 8,0. Vabo vibrioni uchun elektiv muhit bo‘lib, boshqa mikroblarga nisbatan juda tez ko‘payadi. Muhitning ishqoriy reaksiyasi, vabo vibrionining o‘sishiga to‘sqinlik qilmaydi, lekin boshqa mikroorganizmlarning o‘sishini sekinlashtiradi. 88 Ishqoriy agar (IA). Qattiq muhit: oziqli agar, rN 7,8. Oldingi muhitga o‘xshash, vabo vibrioniga elektiv hisoblanadi. Myuller muhiti. Tif-paratif bakteriyalar uchun elektiv hisoblanadi, chunki ular ichak tayoqchasiga nisbatan tetrationat natriyga (bu birikma oziqli bulonga Lyugol eritmasi va natriy giposulfit qo‘shilganda hosil bo‘ladi) deyarli chidamli. Tuxum sarig‘ining tuzli a r a r i (TSTA). Muhitning tarkibida natriy xlorid yuqori konsentratsiyada (8-10%) bo‘ladi. Bu esa, stafilokokkning o‘sishi uchun to‘sqinlik qilmay, balki muhitni shu mikrob uchun elektiv holatga keltiradi. Muhit letsitovitellaza hosil qiladigan stafilokokklarni shunday ferment ajratmaydigan stafilokokklardan farq qilishga yordam beradi. SHu muhitda letsitovitellaza musbat mikrob koloniyalari atrofida sadaf rangli halqa hosil bo‘ladi (ferment tovuq tuxumi sarig‘idagi letsitini parchalaydi, shuning uchun eritilgan va 45°S gacha sovitilgan oziqli, tuzli agarga tuxim sarig‘i qo‘shiladi). Differensial-diagnostik muhitlar. Giss muhiti. 1% li peptonli suvga 0,5% uglevodlardan biri alohida-alohida (glyukoza, laktoza, maltoza, mannit va boshqalar) va Andrede indikatori (NaOH ning 1 n. eritmasidagi nordon fuksin) qo‘shiladi. So‘ngra probirkalarga quyilib, ichiga po‘kak (uzunligi 3 sm bo‘lgan shisha naycha, uning bir tomoni berk) solinadi. Po‘kak shisha naycha uglevodlarning parchalanishi natijasida hosil bo‘ladigan gazsimon mahsulotlarni yig‘ish maqsadida solinadi. Oquvchan bug‘ yoki 0,5 atm bosimidagi bug‘ bilan sterillanadi; bunda-po‘kak oziqli muhit bilan to‘ladi. Muhit 7,2 - 7,4 rN da rangsiz bo‘lib, uglevodlar parchalangandan so‘ng qizil tusga kiradi. Sanoatda uglevodli, VR-indikatorli (suvli havorang bo‘yoq va rozol kislota aralashmasi) yarim suyuq muhitlar poroshok shaklida paketlarda ishlab chiqariladi. VR-indikatori neytral reaksiyali muhitda rangsiz bo‘lib, nordon muhitda ko‘k, ishqoriy muhitda esa, qizil rangga aylanadi. Hosil bo‘ladigan gaz yarim suyuq agar ustunchasini parchalab yuboradi. Endo muhiti. Poroshok shaklda paketlarda chiqariladi. U quritilgan oziqli agar, 1% li laktoza va indikator - asosiy fuksin, rangsizlantirilgan natriy sulfitdan tashkil topgan. Ishlatishdan oldin ma’lum miqdordagi poroshok distillangan suvga solinadi, 89 qaynatiladi, so‘ngra Petri kosachalariga quyiladi. YAngi tayyorlangan muhit rangsiz yoki oq pushti rangli bo‘ladi. Laktoza musbat bakteriyalarning koloniyalari metallga o‘xshab yaltiraydigan, to‘q-qizil rangga bo‘yaladi; laktozamanfiy bakteriyalar esa, rangsiz koloniyalarni hosil qiladi, chunki fuksin ma’lum muhitning rN da rangsiz bo‘lsa, laktoza parchalanishi natijasida hosil bo‘lgan kislota muhitning rN ni nordon tamonga o‘zgartiradi va fuksin natriy sulfitdan ajralib qizaradi, bu esa bakteriya koloniyasini qizil rangga bo‘yalishiga olib keladi. Levin muhiti. Kukun ko‘rinishida paketlarda chiqariladi. U quritilgan oziqli agar bilan laktoza, K2NRO4, metilen ko‘ki va eozindan tashkil topgan. Endo muhiti kabi tayyorlanadi. Muhit to‘q-binafsha rangda bo‘ladi. Laktoza musbat bakteriyalar to‘yingan, havo rangli, laktoza manfiylar - rangsiz koloniyalarni hosil qiladi. Buning mexanizimi ham Endo muhitidagi kabi kislota hosil bo‘lishiga asoslangan. Laktoza parchalansa muhitning rN nordon tomonga surilish natijasida muhitning to‘q binafsha rangi o‘zgarib metilin ko‘ki ta’sirida koloniya to‘q havo ranggiga kiradi. Masalan ichburug‘ qo‘zg‘atuvchilari laktozani parchalamaydi, muhit rN o‘zgarmaydi, ularning koloniyalari rangsiz oqimtir bo‘ladi, ichak tayoqchasi koloniyasi esa to‘q havo rangiga kiradi Ploskiryov muhiti (J baktoagari). Quruq holda chiqarilib, laktoza, brilliant yashili, o‘t kislotalar tuzlari, mineral tuzlar va indikator (neytral qizil) oziqli agardan iborat. Bu muhit faqat differensial-diagnostik bo‘lib qolmasdan, balki selektiv hamdir. CHunki u ko‘p mikroblarning (ichak tayoqchasi va boshqalar) o‘sishini to‘xtatadi va ko‘pgina kasal qo‘zg‘atuvchi bakteriyalar (ich terlama, paratif, dizenteriya ko‘zg‘atuvchilar) ning o‘sishini ta’minlaydi. Laktoza manfiy bakteriyalar bu muhitda rangsiz, laktoza musbatlar esa, och qizil koloniyalarni hosil qiladi. Bu muhitning mexanizimi ham kislota hosil bo‘lishga asoslangan. Uch qandli mochevina qo‘shilgan (Olkenitskiy bo‘yicha) muhit. 100 ml distillangan suvga 2,5 g quruq oziqli agar,1 g laktoza, 1 g saxaroza, 0,1 g glyukoza, 1 g mochevina, 0,02 g Mora tuzi, 0,03 g tiosulfat natriy,0,4 ml 0,4% qenol qizilini suvli eritmasi.

Genom DNK ajratish uchun eritmalar va asboblarni tayyorlash