2-Mavzu: Transkripsiya, translyatsiya va oqsil sintezi Transkripsiya jarayoni

Real-time PCR ma’lumotlarini kompyuterda tahlil qilish. Ma'lum bir vaqtda hujayra yoki to'qimalarda gen ekspressiyasini o'rganish hujayraning oqsil sintezi imkoniyatlari to'g'risida tushuncha beradi. Gen ekspressiv tahlillari, masalan, genlarni profillash, muhim vosita bo'lib, nanotoksiklik tadqiqotlarida keng qo'llaniladi. Gen ekspresiyasini aniqlashning bir qancha usullari mavjud, masalan, shimoliy blot tahlili, ribonukleazdan himoya qilish tahlili (RPA), gen ekspressiyasini ketma-ket tahlil qilish (SAGE), teskari transkripsiya-polimeraza zanjiri reaktsiyasi (RT-PCR), real vaqtda polimeraza miqdoriy zanjiri. reaktsiya (qRT-PCR), PCR massivlari va mikro-massivlar. Ushbu usullar orasida Northern blot tahlil qilish yanada mustahkam texnikalar paydo bo'lishiga qaramay mRNK darajasini aniqlash va miqdorini aniqlashning standart usuli bo'lib qolmoqda. Shimoliy blotlash RNK ​​namunalarini o'lchamlari bo'yicha ajratish uchun elektroforezdan foydalanishni o'z ichiga oladi, so'ngra maqsadli ketma -ketlikning bir qismini to'ldiruvchi gibridizatsiya probi bilan mRNKni aniqlaydi. RPA - bu eritmadagi aniq RNK miqdorini aniqlash uchun juda sezgir usul. U maqsadli uyali RNK yoki poli (A) tanlangan mRNKda bajarilishi mumkin. SAGE usuli, shuningdek, PCR massivlari va mikro -massivlari, har xil eksperimental sharoitda hujayralar yoki to'qimalarda genlarning qisman yoki global ifodasini o'rganish uchun ishlatiladi. Ushbu bobda biz RT-PCR va real vaqtda PCR yordamida gen ekspressiyasini aniqlash usullarini tasvirlab beramiz. RT-PCR-maqsadli genlarning ifoda darajasini aniqlash uchun nisbatan sodda, arzon, o'ta sezgir va o'ziga xos vosita. Haqiqiy vaqtda PCR-bu DNK yoki cDNK kabi PCR shablonlarining nusxa sonini aniqlashning miqdoriy usuli bo'lib, u ikki turdan iborat: prob va kalkulyatorga asoslangan. TaqMan PCR deb nomlanuvchi zondga asoslangan real vaqtda PCR uchun bir juft PCR primerlari va qo'shimcha florogenli oligonukleotid probi kerak bo'ladi, u ham muxbirli lyuminestsent bo'yoq, ham söndürücü bo'yoq qo'shiladi. Interkalatorga asoslangan (SYBR Green) usuli PCRda yangi sintezlangan ikki qatorli DNK bilan bog'laydigan va lyuminestsent hosil qiladigan ikki qatorli DNK bo'yog'ini talab qiladi. Ikkala usulda ham har bir namunadagi flüoresansni PCR paytida tez -tez kuzatib turadigan sezgir kamera bilan jihozlangan maxsus termosikler kerak. RT-PCR va real vaqtda PCR asosidagi asosiy usullar-bu RNKni to'liq ajratish, teskari transkripsiya (RT) va PCR. Teskari transkripsiya RNKga bog'liq DNK polimeraza yordamida RNKdan DNK sintezini o'z ichiga oladi. PCR DNKning bir yoki bir nechta nusxasini kattalikning bir necha buyrug'i bo'yicha ko'paytirishi mumkin, bu ma'lum bir DNK sekansining minglab millionlab nusxalarini hosil qiladi. Bu erda biz RT-PCR va real vaqtda PCR uchun batafsil protseduralarni joriy qilamiz.
Haqiqiy vaqtda PCR texnologiyasi an'anaviy PCRdan foydalanadi. PCR - bu DNKdan nusxa ko'chirish va kuchaytirish jarayonidir (40). 2-rasmda ko'rsatilgandek, PCR reaksiyaga primer vazifasini bajarish uchun qo'shilgan qisqa, ketma-ket o'ziga xos oligonukleotidlar yordamida DNKning alohida bo'laklarini ko'paytirish uchun DNK polimerazalaridan foydalanadi. Bu fermentlardan birinchi va eng ko'p ishlatiladiganlari Taq DNK polimeraza (dan Thermus aquaticus), holbuki Pfu DNK polimeraza (dan Pirokokk furiozi) DNKni nusxalashda yuqori aniqlik tufayli keng qo'llaniladi. Bu fermentlar bir -biridan tubdan farq qilsa -da, ikkalasi ham ularni PCR uchun foydali qiladigan ikkita asosiy qobiliyatga ega: 1) ular DNK shabloni va primerlari yordamida DNKning yangi zanjirlarini yaratishi mumkin 2) ular issiqlikka chidamli. Oxirgi atribut zarur, chunki har bir DNK nusxa ko'chirish jarayonidan so'ng, hosil bo'ladigan ikki tarmoqli DNK (dsDNK) reaktsiya naychasining yuqori haroratida (∼95 ° C) bitta bo'laklarga "erishi" kerak. Keyin reaksiya oligonukleotid primerlarining hozir bitta torli shablonli DNK bilan birlashishi va DNK polimeraza fermentini bitta komplementar nukleotidlarni qo'shib, DNKning yangi to'liq zanjirini yaratish uchun cho'zishni boshlashi uchun sovutiladi. Shunday qilib, dsDNA hosil bo'ladi. Keyingi nusxa ko'chirish tsikli paydo bo'lishidan oldin bu yangi dsDNA eritilishi kerak. Shuning uchun, agar reaktsiya mukammal samaradorlik bilan ishlasa, har bir PCR tsiklidan keyin o'ziga xos dsDNA ikki barobar ko'p bo'ladi. Aslida, reaktsiyalar mukammal samaradorlikni saqlay olmaydi, chunki PCR ichidagi reaktivlar ko'p tsikllardan so'ng iste'mol qilinadi va reaksiya platoga etadi (3 -rasm). Bundan tashqari, to'plangan mahsulotni o'z-o'zini yoqish ham "plato effekti" ga hissa qo'shishi mumkin (49). Haqiqatan ham, PCRlarning atributi real vaqtda PCR texnologiyasini juda zarur qiladi. Reaksiya plato ta'siridan oldin DNKni faqat ma'lum miqdorgacha samarali kuchaytira oladigan bo'lgani uchun, PCR tugagandan so'ng mahsulot miqdorini aniqlab, boshlang'ich DNK miqdorini ishonchli hisoblashning iloji yo'q. Boshqacha aytganda, PCRdan oldin aniq maqsadli DNK ketma -ketligi qancha bo'lishidan qat'i nazar, PCRdan keyin shunga o'xshash miqdordagi kuchaytirilgan DNK bo'lishi mumkin va boshlang'ich va yakuniy miqdor o'rtasidagi har qanday aniq bog'liqlik yo'qoladi. Haqiqiy vaqtda PCR bu muammoni DNK amplifikatsiyasi reaktsiya jarayonining boshida samarali sodir bo'lishidan foydalangan holda hal qiladi va shuning uchun bu "eksponensial fazada" mahsulot hosil bo'lishini o'lchaydi (3-rasm). Bu o'lchov o'ziga xos boshlang'ich DNK miqdoriga bog'liq va shu bilan uning miqdorini aniqlashga imkon beradi.
Haqiqiy vaqtda PCR - biologiya natijalarini tahlil qilish. Haqiqiy vaqtda PCRda DNK miqdorini aniqlashning ikkita asosiy usuli mavjud. Bular quyidagi rasmda ko'rsatilgan. Biri DNK interkalatsiyalanadigan yoki kichik yivli nishonlovchi bo'yoqlardan foydalanadi, bu esa bog'lashda yaxshilangan lyuminestsentni ko'rsatadi. Har bir amplifikatsiya tsikli bilan, shablon DNK miqdori oshgani sayin, bog'langan ftoroforlar soni va shuning uchun lyuminestsent signalning intensivligi oshadi. Ommabop lyuminestsent interkalatsiyali bo'yoqlarga SYBR ® Green I va SYBR ® Gold kiradi. Ularning asosiy ustunligi-bu narx, lekin ular o'ziga xos emas va faqat dsDNA-ni bog'laydi, faqat maqsad emas.
Ikkinchi usulda florofor bilan belgilangan ketma-ketlikdagi DNK problari ishlatiladi. Aniqlash uchun turli xil kimyoviy moddalar ishlatiladi. Eng mashhur turi 5'-3 'eksonukleaz faolligidan foydalanadi Taq oligonukleotidni chaynash uchun polimeraza, ftorofor va söndürücü mos ravishda 5'- va 3'- uchida. Polimerazaning ekzonukleaza faolligi ftoroforni söndürücüden ajratishga yordam beradi, bu esa floresansning oshishiga olib keladi. Ammo keyin, lyuminestsent intensivligidan nuklein kislota miqdorini qanday aniqlash mumkin?