2. Zamonaviy bioinformasion ma'lumot bazalari turlari. Dnk va rnk nukleotidlar ketma,ketliklari ma'lumot bazalari (GenBank, embl, ddbj). Meta,bazalar. Genom bazalari

7-ma’ruza. Molekulyar filogenetika.
Genom struktur komponentlarini vizuallashtirish vositalaridan biri – FlyBase Genome Browser (http://www.fruitfly.org/sgi-bin/annot/browse). U interaktiv holatda qandaydir bir genning tuzilishi, BAC-klonlarni, transpozon elementlarini joylashishi o‘rganish imkonini beradi. Qoidaga ko‘ra bunday vizuallashtirgichlar tadqiqotning talabi va chiqarilayotgan grafik axborotlarning vaziyatga bog‘liq ravishda moslanishiga ko‘ra genom elementlari menyusi bilan ta’minlanadi. Bugungi kunda bu kabi menyular istalgan genom ma’lumotlar bazasi uchun asosiy qism hisoblanmoqda.
Endi boshqa model organizmlarga bag‘ishlangan genom ma’lumotlar bazasiga to‘xtalamiz. WormBase – Cayenorhabditis elegans nematodasi (to‘garak chuvalchang) genlari struktura va funksiyasiga doir integratsiyalangan ma’lumotlar bazasi (reyez://www. wormbase.org). Ushbu organizm yaqin yillarda genetik ob’ekt organizmlar qatoriga qo‘shilgan bo‘lsada, tuzilishining soddaligi va rivojlanishining o‘ziga hosligi uni yetakchi tadqiqot ob’ektlari qatoriga olib chiqdi. Gap shundaki, nematodalarning rivojlanishi aniq determinatsiyalangan, ya’ni birinchi kundan boshlab xar bir hujayraning taqdiri aniq belgilab qo‘yilgan va bo‘linish miqdori hamda xar bir organdagi hujayralarning miqdori chegaralangan -1000 tadan sal ortiq. Nematodaning bunday tuzilishi uni molekular mexanizmlari, ayniqsa hujayralararo ta’sirlanishlar va signal yo‘llarini oson aniqlash imkonini beradi.
WormBase ma’lumotlar bazasida maxsus savollarni o‘rganish imkonini beruvchi ma’lumotlarning probazalari yoki yo‘ldosh bazalariga yo‘naltirgichlarni ham ko‘rishimiz mumkin bo‘ladi. Barcha bazalar bo‘yicha sodda va murakkab qidiruvni amalga oshiruvchi vositlar bor.
Cayenorhabditis elegans genomi struktur komponentlari xosil qiluvchilarni ko‘rib chiqamiz. Qandaydir bir geni va qo‘shni genlarning tuzilishi yoki 3’- gen soxalarini ajratib olish mumkin. Barcha rasmlar interaktiv hisoblanganligi uchun ta’minlangan yo‘naltirgichlar bo‘yicha tanlangan ob’ektni tavsiflovchi saxifaga o‘tishi mumkin bo‘ladi.
Yuksak tuzilgan umurtqasiz hayvonlarga doir ma’lumotlar bazasi sharxini yakunlash uchun ikki qanotlilar (Diptera) genomiga aloqador informatsion resurslar bilan tanishib chiqaylik. Yashash joyi nuqtai nazaridan ko‘plb ikki qanotlilar: pashsha va chivinlar katta tibbiy axamiyatga ega. Hususan bu hashorotlar faqatgina qon so‘ribgina qolmasdan, ko‘plab havfli kasalliklarni ham qo‘zg‘atuvchilari sanaladi. Birgina bezgak kasalligi bilan chorak milliard yer axolisi kasallangan. Shu sababli, ikkinchi bo‘lib genomi tahlil qilingan ikki qanotli organism- Afrikada bezgak kasalligini qo‘zg‘atuvchi Anopheles gamibiae bo‘lgan. Mosquito Genomes esa bir qator muxim axamiyatga ega bo‘lgan tashuvchilarning genom proyektlari, tibbiy-genetik ma’lumot bazalari va xokazolar uchun yo‘naltirgichlarni o‘zida jamlagan internet resursi hisoblanadi. Shundan kelib chiqqan holda bezgak kasalligini tashuvchi Alveolata tipiga kiruvchi bir hujayrali sodda organizm Plasmodium falsiparum genomi ham 2000 yilda to‘liq sekvenirlangan.
AnoBase-ma’lumotlar bazasi Anopheles gamibiaega doir genom va biologik axborotlarni saqlaydi. Bu ma’lumotlar bazasida ham genetic harita, birlamchi ketma –ketliklar, gen ko‘rsatkichi kabilarga yo‘naltirgichlar joylashgan.
O‘simlik genomiga bag‘ishlangan ma’lumot bazalari bilan ham tanishib chiqaylik. Arabidopsis thaliana krestguldoshlar oilasiga kiruvchi bu o‘simlik hech qanday qishloq ho‘jalik axamiyatiga ega emas. Lekin o‘simlik organizmlari rivojlanishining genetik mexanizmlari va to‘qima va organlarning bajaradigan vazifasi, ayniqsa gullash tog‘risidagi dastlabki tasavvurlar aynan shu osimlik yordamida paydo bo‘lgan.
Ushbu o‘simlik genomining sekvenirlanishi 2000 yilda Arabidopsis thaliana genomining sekvenirlanishi va annotatsiyasi bo‘yicha xalqaro loyixa - Arabidopsis Genome Initiative qoshida amalga oshirilgan. Ma’lumotlar bazasi yoki TAIR (The Arabidopsis Information Resource) gen yo‘naltirgichi yordamida ushbu o‘simlik haqida to‘liq ma’lumotga ega bo‘lish mumkin bo‘ladi.
Qishloq ho‘jaligi axamiyatiga ega bo‘lgan ko‘plab o‘simlik organizmlari yirik agrotexnik firmalarning kuch va vositalari yordamida genom ketma –ketligi tahliliga jalb etilmoqda. Bu kabi o‘simliklar qatoriga guruch – Oryza sativa, beda – Medicago truncatula, bug‘doy – Triticum aestivum, arpa – Hordeum vulgare, soya – Glysine max, makkajohori- Zea mayslarni kiritish mumkin.
E’tiborimizni xordali ya’ni umurtqali hayvonlar genomiga bag‘ishlangan axborot resurslariga qarataylik. Dastlab sodda tuzilgan xordali hayvonlar genom ketma –ketligi tahlil etila boshlagan. Masalan, Siona intestinalis assidiyasi va ignatanali dengiz tipratikani kabi organizmlar genetik tadqiqotlarda keng qo‘llanib kelinadi.
Sodda tuzilgan umurtqali organizmlar orasida akvarium balig‘i – Danio rerioning genomi tahlil etilgan. Tahlil natijalari va genning vazifalari to‘g‘risidagi ma’lumot esa ZFIN (The Zebrafish Information network) ma’lumotlar bazasida jamlangan.
Yendi yuksak tuzilgan organizmlardan sut emizuvchilar sinfiga kiruvchi uy sichqoni – Mus Musculus genom resurslari bilan tanishib chiqaylik. Uy sichqonining genom tahlilini qoralama variant 2002 yilda tayyor bo‘lgan edi.
Bu organizm ko‘p vaqtdan beri molekular va umumiy genetika, tibbiyot genetikasi va ayniqsa inson bilan bog‘liq bo‘lgan xodisalarni tadqiq etishda model organizm sifatida qo‘llanib keladi. Bundan tashqari sichqon oziq –ovqat, parfyumeriya, farmakologik vositalarini sinab ko‘richda ham standart ob’ekt sanaladi.
Uy sichqonining genetika, genomika va biologiyasi haqida axborotga Mouse Genome Informatics (MGI) orqali ega bo‘lish mumkin.
ODAM GЕNOMI LOYIHASI
Inson genomi ketma –ketligini tahlil etish loyixasi (ingl. The Human Genome Project, HGP) — xalqaro ilmiy –tadqiqot loyixasi bo‘lib, DNKni tashkil etuvchi nukleotidlar ketma –ketligini aniqlash va inson genomidagi 30,000-40,000 genlarni namoyon etish uning asosiy vazifasi hisoblanadi.
Ushbu loyiha 1990 yilda AQSH Milliy sog‘liqni saqlash markazi qoshida Jeyms Uotson raxbarligi ostida boshlangan edi. 2000 yilda genom strukturasining qoralama varianti, 2003 yilda esa to‘liq variant ommaga namoyish etilgan edi. Ammo ba’zi gen sohalari ustida tadqiqot ishlari hozirgi kungacha davom etib kelmoqda. Inson genomi ketma –ketligini tahlil etish bo‘yicha halqaro loyihadan tashqari yana bir qator shaxsiy kompaniyalar ham tadqiqot ishlarini olib borishgan. Masalan: Selera Genomics kompaniyasi o‘z ishini halqaro loyixaga nisbatan avval tamomlagan. Sekvenirlash ishlarining asosiy xajmi AQSH, Kanada va Buyuk Britaniya universitet va tadqiqot markazlarida amalga oshirilgan edi.
Loyixa ochilishidan bir oz vaqt o‘tib, 1999 yilda Inson genomini o‘rganish bo‘yicha halqaro loyixa (HUGO‚ Human Genome Project) yuzaga keladi. “Inson genomi” loyixasi insoniyat tarixidagi eng qimmat va axamiyati bo‘yicha muxim sanalgan loyixalardan biri xisoblanadi. 1990 yilda ushbu loyixaga umumiy xolda 60 mln. dollar sarf etilgan bo‘lsa, 1998 yilda birgina AQSH hukumatining o‘zi 253 mln. mablag sarflaydi, hususiy kompaniyalarniki esa undan ham ko‘p. HUGOning markaziy ofisi Vashington yaqinidagi Betes shaxrida joylashgan va sog‘liqni saqlash institutlari qatoriga kiradi. Bu markaz 6 ta davlatning ilmiy ishlarini jamlagan: Germaniya, Angliya, Fransiya, Yaponiya, Xitoy va AQSH. Xozirgi kunga kelib genomika bo‘yicha 20 dan ortiq laboratoriyalar mavjud va HUGO vakillarining soni 50.dan ortiq davlatni tashkil etadi.
Loyixaning asosiy maqsadi inson genomi tuzilishini tahlil etish bo‘lsada, loyiha doirasida yana boshqa bir qator organizmlar genomi ham tahlil etilgan, bu kabi organizmlar qatoriga bakteriya, meva pashshasi va uy sichqoni kabi sut emizuvchi hayvonlar kirgan. Dastlab inson genomi gaploid to‘plamida saqlanuvchi uch milliarddan ortiq ketma –ketliklarni aniqlash rejalashtirilgan bo‘lsada, keyinchalik bir qator guruhlar inson genomining diploid toplamini sekvenirlash taklifi bilan chiqishgan.
Genom loyixasining dastlabki qadamlaridayoq dunyo olimlari qo‘lga kiritilgan yangiliklarning ochiqligi to‘g‘risida bir qarorga kelishadi, ya’ni yangi axborotlardan barcha ishtirokchilar, ularning loyixga qo‘shgan xissasidan qatiy nazar foydalanishlari mumkin. Biror bir laboratoriya qandaydir DNK fragmentining nukleotid ketma –ketligini yahlil etib, uni AQSHdagi markaziy ma’lumotlar bazasiga yo‘llaydi. Bioinformatika bilan shug‘ullanuvchi olimlar esa shu kabi ma’lumotlar bazasida joylashgan axborotlardan o‘z xisob ishlarida foydalanadilar. “Inson genomi” loyixasiga a’zo davlatlar inson xromasomalarini o‘zoro taqsimlab olishgan. Misol uchun, Rossiya 3, 13 va 19-xromasomalar tahlili bilan shug‘ullangan.
Xozirda ma’lumotlar bazasida inson va boshqa organizmlar genomiga tegishli milliardlab nukleotid juftlari joylashtirilgan. Bunday ulkan axborotlar ustida ko‘plab tahlil ishlarini olib boorish kerak: biror genning boshlanish va tugash uchastkalari qayerda joylashganligini, boshqaruvchi uchastkalarni taxmin qilish vxk. Genom ketma –ketligini tahlil etish kitobni harflab o‘qish bilan barobar, genni topish so‘zning qanday yasalishini tushunish bilan barobar. Tahlil etilgan ketma –ketlikning ishonchlilik darajasi bugungi kunda 85%ni tashkil etadi. Bioinformatika boshlang‘ich axborotni beradi. Ushbu ma’lumot keyinchalik tadqiqotlarda tekshirib ko‘riladi. Bioinformatika genning joylashgan o‘rni xaqida taxminlarni taqdim etsa, tadqiqotchi olim esa shu fragmentni ajratib olib, xaqiqatdan ham aytilgan oqsil sinteziga javobgar ekanligini tekshirib ko‘radi. Ba’zan bioinformatiklar taxmini yanglish chiqishi ham mumkin.
Ma’lum bo‘lishicha har hil millatlarning genomida ham o‘ziga hosliklari bor ekan, yani insonning genomi bo‘yicha uning qaysi millat vakili ekanligi xaqida ma’lumotga ega bo‘lsa bo‘ladi. Bunday yondashuv bioinformatikani tarix, lingvistika, arxeologiya bilan bog‘laydi xamda millatlarning qaysi millatlar bilan bog‘liqligini ko‘rsatadi. Misol uchun, slavyanlar (ruslar) ona tomondan (asosan bolaga ona tomondan o‘tuvchi mitoxondriya DNKsi orqali o‘rganiladi) nemislarga yaqin turadi. Y-xromasomani o‘rganish ustida olib borilayotgan izlanishlar ota tomonidan kim bilan qarindosh ekanligi to‘g‘risida ham ma’lumotlarga ega bo‘lish imkonini beradi.
Eng avvalo, etnik kelib chiqishiga qarab dori bositalarini tanlash mumkin bo‘ladi. Chunki ko‘pkina belgilar insonning qaysi etnik guruxga talluqli ekanligi bilan bog‘liq ravishda o‘xshash bo‘ladi. Shuning uchun bu kabi tadqiqotlar qiziqarli bo‘lishidan tashqari kelajakda individual tibbiyot uchun ham asos bo‘lishi mumkin. Genomikani chuqur o‘rganish orqali kassalliklarni davolashdan tashqari ularni oldini olish ham mumkin bo‘ladi.
Xar bir somatik hujayrada 23 juft xromasoma bo‘ladi: xar bir xromasomaga bittadan DNK molekulasi to‘g‘ri keladi. Bitta hujayradagi 46 ta DNK molekulasining umumiy uzunligi 2 m.ni tashkil etadi, nukeotid juftlarining miqdori 6.4 mlrd.ni tashkil etadi. Odam tanasidagi DNKning (ularning soni o‘rtacha 5x1013) umumiy uzunligi 1011 km.ni tashkil etadi, bu quyoshdan yergacha bo‘lgan masofadan ming marotaba katta. Insondagi genlar soni esa 30 -40 ming atrofida bo‘ladi.
Insondagi genlar soni to‘g‘risidagi qarashlar loyixa boshlanganidan so‘ng 2 barobar kamaygan (80-100 mingdan), ko‘plab “ma’noga ega bo‘lmagan” uchastkalar topilgan. Ularning tuzilishi ham genlarning tuzilishiga nisbatan farq qiladi va genomning asosiy qismini tashkil etadi-95%. Insondagi genlar esa 5% genomda joylashadi. Ilmiy nuqtai nazardan “ma’noga ega bo‘lmagan” sohalar kodlanmaydigan uchastkalar deb ataladi. Bakteriyalarda bunday uchastkalar umuman, achitqilarda esa deyarli bo‘lmaydi. Organizm darajasi yuksalib borgani sari kodlanmaydigan sohalar ham oshib boradi. Kodlanmaydigan soxalar evolyutsiya rezervuari, qoshimcha qismlar ombori bo‘lishi mumkin. Balki genomda qandaydir nosozliklar vujudga kelganida aynan shu soxalar ishga tushib, shikastlangan genni normal holatga o‘tkazar.
Kodlanmaydigan DNK orasida mutatsiya natijasida nobud bo‘lgan, “buzuq” genlar ham bo‘lib, ularni psevdogenlar deb atashadi.
Ikkinchidan, bizning ajdodlarimiz–neandertal va kromanionlar virusli kasalliklar bilan og‘rishgan. Ba’zan viruslar genomga kirib u yerda abadiy qolib ketgan bo‘lishi mumkin. Bundan tashqari bizning genomimizda bir qator qaytariladigan uchastkalar ham bor.
Tuzilishi bo‘yicha inson genomi sichqonnikiga 10-15% farq qiladi, shempanzedan esa 1.23% ga farq qiladi: inson genomi tarkibida ko‘plab begona elementlar-retrofivuslar ko‘p bo‘lib, maymunlarda esa ular deyarli mavjud emas.
Loyixaning asosiy maqsadi inson xromasomasining mukammal haritasini tuzish, barcha xromasomalarning to‘liq birlamchi strukturasini aniqlashdan iborat edi.
Alohida olingan xar qanday organizmning genomi yagonadir (bitta tuxum hujayra va klonlangan organizmlardan tashqari), shuning uchun inson genomi ketma –ketligini aniqlashda xar bir genning bir qancha variantlarini sekvenirlab, solishtirish kerak bo‘ladi. Lekin,odam hujayrasida uchraydigan barcha DNKlarni aniqlash inson genomi loyixasi vazifasiga kirmagan; ba’zi geteroxromatin sohalar (umumiy murakkabligi 8 % atrofida) hozirgi kungacha sekvenirlanmay kelmoqda.
Inson genomining uch milliardlik loyixasi 1990 yilda AQSH energetika vazirligi va Milliy sog‘liqni saqlash vazirligi tomonidan rasmiy tarzda ishga tushirilgan edi va 15 yil davom etishi rejalashtrilgan. Unga AQSHdan tashqari Xitoy, Fransiya, Yaponiya va Buyuk Britaniya genetic olimlari ham qo‘shilgan.
Genomika sohasida qo‘lga kiritilgan yangi yutuqlar va xisoblash texnologiyalarining yanada takomillashuvi natijasida inson genomining “qoralama” variant 2000 yilda yakunlangan. Bu haqida o‘sha vaqtda AQSH prezidenti bo‘lgan Bil Klinton va Britaniya primer-ministri Toni Bler tomonidan 26 iyun sanasida e’lon qilingan edi. Sekvenirlash ishlarining jadal davom ettirilishi natijasida 2003 yil aprel oyida, ya’ni rejalashtirilgan muddatdan 2 yil oldin inson genomining to‘liq tahlil etilganligi to‘g‘risida e’lon qilingan. 2006 yil may oyida “Nature” jurnalida ohirgi xromasoma –Xromasoma 1.ning ketma –ketligi chop etilgan edi.
“Inson genomining to‘liq ketma –ketligi” bo‘yicha bir qator yondashuvlar mavjud. Ba’zi qarashlarga ko‘ra genom to‘liq tahlil etilgan bo‘lsa, boshqalariga ko‘ra hali yakunlanmagan. Ommaviy matbuotda “genom loyihasi”ning yakunlanganligi xususida bir qator maqolalar e’lon qilingan edi. Loyiha tahlilining tarixi grafigi bo‘yicha ham inson genomining katta qismi 2003 yil ohirlarida yakunlangan. Lekin o‘sha davrda tugallanmay qolgan bir qator sohalar ham bor edi:
Eng avvalo, sentromera deb nomlanuvchi, xar bir xromasomaning markaziy qismi. U yerda DNK qaytariluvchi ketma –ketligining katta miqdori saqlanadi. Ularni zamonaviy texnologiyalar yordamida ham sekvenirlash bir oz mushkul. Sentomeralar million (o‘n millionlab bo‘lishi ham mumkin) juft nukleotid uzunligiga ega va ko‘p hollarda sekvenirlanmay qoladi.
Ikkinchidan, telomera deb nomlanuvchi xromasoma uchlari ham qaytariluvchi ketma –ketliklardan iborat bo‘lib, ko‘pchilik xromasomalarda ushbu qism taxlil qilinmagan. Telomeralargacha bo‘lgan ketma-ketliklarning aynan qaysi qismi taxlil qilinmay qolishi xaqida aniq bir ma’lumotlar yo‘q, ammo sentomeralar kabi ularda ham sekvenirlanishga qarshilik ko‘rsatuvchi texnologik cheklanishlar bo‘ladi.
Uchinchidan, xar bir indvidning genomida multigenlar oilasiga qarashli bo‘lgan bir necha lokuslar mavjud bo‘lib, ularni xozirda asosiy usullardan biri bo‘lgan DNK fragmentlash usuli yordamida taxlil qilish qiyinchiliklarni keltirib chiqaradi. Xususan olganda, bu oila vakillari immun tizimida muhim axamiyatga ega bo‘lgan oqsillarni kodlaydi.
Sanab o‘tilgan regionlardan tashqari, butun genom bo‘ylab tarqalib ketgan “teshik”lar ham bo‘lib, ularning ba’zilari nisbatan yirikdir. Ammo, yaqin yillarda ushbu bo‘shliqlarning o‘rni to‘ldiriladi degan umid yo‘q emas. Qolgan DNKning katta qismi qaytariluvchi nukleotidlardan iborat bo‘lib, ularda biror ma’noga ega qismning mavjud bo‘lish ehtimoli ham u qadar katta emas. Lekin ushbu qismlar ham to‘liq tahlil etilmagaunicha bu xaqida aniq bir xulosaga kelib bo‘lmaydi.
Inson DNKsining ketma –ketligi ma’lumotlar bazasida saqlanadi va bu ma’lumotlardan istalgan odam foydalanishi mumkin. Ushbu ma’lumotlar bazasining o‘zida kompyuter dasturlari ishlab chiqilgan bo‘lib, bu dasturlarsiz ma’lumotlarni izohlashning iloji yo‘q, bo‘lsa ham juda mushkul.
Har bir inson qaysidir darajada o‘ziga hos tuzilgandir, shuning uchun “Inson genomi” loyihasida chop etilgan ma’lumotlar a’lohida organismning aniq ketma –ketliklarini saqlamaydi. Bu kam miqdordagi anonim donorlarning kombinatsiyalangan genomidir. Olingan genom ketma –ketligi keyinchali turli indvidlar genomidagi farqlarni aniqlashda asos bo‘lib hizmat qiladi. Bu yerda asosiy kuch bir nukleotidli polimorfizmlarni namoyon etishga qaratilgan bo‘ladi.
Loyixa avvalida olimlar o‘z oldilariga inson DNKsini 95% ini sekvenirlashni maqsad qilib qo‘ygan edilar. Tadqiqotchilar bu masalani ortig‘i bilan bajardilar, 99.99% inson genomi sekvenirlangan. Loyixa o‘z maqsadiga yetgan bo‘lsada, hozirgi kunda ham ish olib borib, erishilgan natijalarni mukkammallashtirib bormoqda.
Loyixa moddiy tomondan AQSH xukumati, Senger instituti qo‘llab quvvatlovchi Britaniyaning Wellcome Trust deb nomlanuvchi xayriya jamg‘armasi va butun dunyo bo‘ylab tarqalgan boshqa guruhlar tomonidan qo‘llab quvvatlangan. Genom o‘rtacha 150 000 juft nukleotiddan iborat bo‘laklarga ajratilib, ushbu bo‘laklar sun’iy bakterial xromasomaga joylashtirilgan. Bu vektorlar gen muxandisligi usuli yordamida o‘zgartirilgan bakteriya xromasomasidan tuzilgan bo‘lib, ularni bakteriya hujayrasiga joylashtirib, replikatsiya mexanizmi yordamida nusxasini olsa bo‘ladi. Keyin xar bir genom bo‘lagi “fragmentlashtirish” usuli yordamida aloxida-aloxida sekvenirlangan va olingan ketma –ketliklar kompyuter texnologiyasi yordamida yagona matnga terilgan. Butun xromasoma strukturasi ko‘rinishini tiklash uchun jamlangan DNK bo‘lagi uzunligi o‘rtacha 150 000 juft nukleotidni tashkil etgan. Bunday tizim “fragmentlashtirishning iyerarxik usuli” nomi bilan mashxur bo‘lib, dastlab genom o‘lchami turlicha bo‘lgan bo‘laklarga bo‘linib, bu bo‘laklarning xromasomada joylashgan o‘rni oldindan ma’lum bo‘lishi kerak.
1998 yilda amerikalik tadqiqotchi Kreyg Venter va Celera Djenomiks deb nomlanuvchi firmasi shaxsiy kapital hisobiga moliyalashtirilgan anologik tadqiqotlarni yo‘lga qo‘yadi. 1990 yillarda, “Inson genomi” loyixasi endi ish boshlaganda Venter ham AQSH sog‘liqni saqlash institutida ishlagan. Mablag‘i 3 mlrd. dollarni tashkil etuvchi davlat loyixasidan farqli ravishda, Venter loyixasining maqsadi inson genomini arzonroq (3 million $) va tezroq sekvenirlash bo‘lgan.
Celera inson genomini sekvenirlashda xavfli yo‘ldan borib, ilgari 6 million nukleotid juftigacha kattalikka ega bo‘lgan bakteriya genomini sekvenirlashda qo‘llanilgan usuldan foydalanilgan. Inson genomi esa 3 milliard nukleotid juftdan iborat. Dastlab Celera “faqat 200 yoki 300 ” genlarni taxlili bilan shug‘ullanishi xaqida e’lon qilgan edi. Ammo keyinroq “asosiy strukturalarni to‘liq tavsifi” uchun 100-300 maqsadlarni o‘z ichiga oluvchi “intelektual shaxsiy mulk ximoyasi”ni izlayotganligi to‘g‘risida ma’lum qildi. Nixoyat, firma muddatdan oldin 6500 butun yoki nisbiy genlar uchun patentga ariza bilan murojat qilgan. Ammo hususiy firma davlat loyixasidan farqli ravishda o‘z ma’lumotlarini ochiq e’lon qilmagan, sanoat miqiyosida foydalanishga rozilik bermagan.
2000 yilda AQSH prezidenti Bill Klinton inson genomi ketma –ketligi patentlanishi mumkin emas, u barcha foydalanishi mumkin bo‘lgan xolatda bo‘lishi kerak deb e’lon qildi. Prezidentning e’lonidan keyin Celera kompaniyasi aksiyalari tushib ketadi, bu butun biotexnologiya sektorini tushib ketishiga sabab bo‘ldi, bundan shaxsiy kompaniyalar 50 milliard dollar zarar ko‘rgan.
«Nature» (davlat loyixasi ilmiy maqolalarini nashr ettirgan) va «Science» (Celera ilmiy maqolalari natijalarini e’lon qilgan) jurnallari ketma –ketliklarning qoralama variantlarini ishlab chiqishda qo‘llanilgan usullarni tavsifini keltirishgan. Bunday qoralama variant butun genomning taxminan 83% egallagan (150 000 teshiklarga ega 90 % euxromatin uchastkalar). 2001 yil fevral oyida loyixa ikkala gurux tomonidan ham tugallanganligi e’lon qilindi. 2003 va 2005 yillarda 92% ketma –ketlik tahlil etilgan.
O‘zoro raqobat loyixa jadalligiga o‘z ta’sirini ko‘rsatmay qolmadi, davlat loyixasi ishtirokchilari o‘z strategiyasini qayta ko‘rib chiqishdi.
Dastlab ikkala loyixa o‘z natijalarini birlashtirish ustida kelishuvga kelishgan edi, ammo Celera o‘z natijalarini GenBank ma’lumotlar bazasi orqali ommaviy e’lon qilishdan bosh tortgach bu hamkorlik o‘z yakunini topgan. Celera “Inson genomi” loyixasiga doir ma’lumotlardan foydalangan, ammo o‘z ma’lumotlaridan foydalanishni taqiqlab qo‘ygan.
Xozirgi kunda inson genom ketma –ketliklarini bilish katta foyda keltirmoqda. Bundan tashqari, model organizmlar genomining sekvenirlanishi biologiya va tibbiyotda katta yutuqlarni qo‘lga kiritilishiga zamin bo‘ldi.
2004 yilda Inson Genomini Sekvenirlash bo‘yicha Xalqaro Konsorsium (ingl. International Human Genome Sequensing Consortium) inson genomidagi genlar soniga doir ma’lumotlarni yangiladi. Inson genomidagi genlar soni 20,000 -25,000 ni tashkil etadi. Ilgari bu raqam 30.000-40.000 atrofida deb xisoblanar edi. Loyixa boshlangunga qadar esa insondagi genlar soni 2,000,000 atrofida deb xisoblab kelingan.
Genom ma’lumotlarining interpretatsiyasi ustida olib borilayotgan ishlar xali ham dastlabki boshqichda turibdi. Loyixaning amaliy natijalari ish tugallanishidan avval paydo bo‘lgan edi. Bir qator loyihalar ko‘krak bezi saratoni, qon ivishining buzilishi, kistozli fibroz, buyrak kasalliklari kabi bir qator potologiyalarni genetik tahlilini amalga oshirish bo‘yicha sodda usullarni taklif etishgan. Biolog tadqiqotchi saraton kasalligining biror shaklini tahlil qila turib mazkur gen bo‘yicha qidiruvni amalga oshirishi mumkin. Inson genomiga bog‘liq ma’lumotlar bazasini kuzatib, boshqa olimlarning mazkur gen to‘g‘risida keltirgan ma’lumotlari, gen hosilasining fazoviy strukturasi, uning vazifasi kabi bir qator ma’lumotlarga ega bo‘lishi mumkin.

Polimeraza zanjir reaksiyasi (PZR)

Polimeraza zanjir reaksiyasi -molekular -biologik usul bo‘lib, in vitro aniq bir DNK fragmenti nusxasini juda katta miqdorda ( 1012 marotabagacha) oshirish imkonini beradi. Bu usul 1983 yilda Keri Myullis tomonidan kashf etilgan bo‘lib, ushbu kashfiyoti uchun 1993 yilda M. Smit bilan birga kimyo yo‘nalishida Nobel mukofoti sovrindori bo‘lgan.
Usul sun’iy sharoitda fermentlardan foydalangan xolda DNKning aniq bir uchastkasini ko‘p marotaba tanlov asosida nusxa olishiga asoslangan. Shu bilan bir qatorda faqatgina berilgan shartlarni qondiruvchi DNK uchastkasidan nusxa olinadi va u tadqiq qilinayotgan sharoitda mavjud bo‘lishi kerak. Tirik organizmlar hujayrasida kechuvchi DNK replikatsiyasi jarayonidan farqli ravishda PZR yordamida DNKning nisbatan kichik uchastkalari amplifitsirlanadi (odatda 3000 juft nukleotiddan ortmaydi, lekin shunday usullar mavjudki nukleotid jufti sonini 20 minggacha "ko‘taradi" -u Long Range PCR deb nomlanadi).
Xaqiqatdan, PZR DNK fragmentining ko‘p marotabalik sun’iy replikatsiyasi sanaladi. DNK -polimerazalar shunday tuzilganki, faqatgina matritsa va monomerlarga ega xolatda yangi DNKni sintez qilolmaydi. Buning uchun ularga sintezni boshlab beruvchi tomizg‘i ya’ni praymer kerak bo‘ladi. Praymer - bu DNK-matritsaga komplementar bo‘lgan qism, bir zanjirli nuklein kislota fragmentidir. Hujayrada replikatsiya jarayonida bunday praymerlar maxsus praymaza fermenti tomonidan sintezlanadi va keyinchalik DNK bilan o‘rin almashinuvchi RNK molekulalari xisoblanadi. Ammo, PZR.da sun’iy sintezlangan DNK molekulalaridan foydalaniladi. Chunki bu yerda RNKni yo‘qotish va uning o‘rniga DNKni sintezlash bosqichlarining keragi yo‘q. PZR.da praymerlar amplifitsirlanuvchi uchastkani ikkala tomondan chegaralab oladi.
PZR.ning ishlash mexanizmini. Dastlab, reaksion qorishmaga DNK-matritsa, praymerlar, DNK-polimeraza, erkin nukleozidlar (yangi sintezlanuvchi DNKning bo‘lajak "xarf"lari), hamda polimeraza ishini yaxshilovchi bir qator boshqa moddalar (ularni reaksiyada qo‘llaniluvchi maxsus buferlarga joylashtirishadi) joylanadi.



^{ПЗР схемаси. М. Карра расми.}

PZRning xar bir siklidan so‘ng butun DNK miqdorining ortib borishi.

Matritsaga komplementar bo‘lgan DNKni sintezlash uchun praymerlardan biri u bilan vodorod bog‘ini xosil qilishi kerak (bu otjig deb nomlanadi). Lekin, matritsa bunday bog‘ni ikkinchi zanjir bilan xosil qilib olishi mumkin. Demak, dastlab DNKni qizdirib olish kerak -bunda vodorod bog‘lari uziladi. Bu ish oddiy qizdirish orqali amalga oshiriladi (t 95 °C gacha) -bosqich denaturatsiya deb nomlanadi. Ammo, endi yuqori xarorat sabab praymerlar matritsaga bog‘lana olmaydi. Xarorat 50-65 °c ga qadar pasaytirilganda praymerlar matritsa bilan bog‘lanadi, shundan so‘ng xarorat bir oz ko‘tariladi (polimerazaning optimal ishlash xaroratiga qadar, o‘rtacha 72 °c). Shunda polimeraza matritsaga komplementar bo‘lgan DNK zanjirini sintezlay boshlaydi -buni elongatsiya deb atashadi (8-rasm). Mana shunday bir bosqichdan so‘ng kerakli fragmentning nusxasi ikki karra ortadi. Ammo, buni yana bir bor qaytarishga xech narsa qarshilik qilmaydi. Qaytarish bir emas bir necha o‘n marotaba bajariladi. Xar bir qaytarilishdan so‘ng mavjud DNK fragmentining miqdori ikki marotabaga ortib boraveradi, chunki yangi xosil bo‘lgan molekulalar keyingi sikl uchun matritsa sifatida qo‘llaniladi (9-rasm). Aslini olganda PZRning effektivligi u qadar yuqori emas, ideal xolatda esa shunday, real sonlar ham shunga yaqinroq bo‘ladi.
PZR natijalarini juda tez ko‘rish mumkin: PZRdan so‘ng reaksion qorishmani elektroforezdan o‘tkazish kifoya, olingan nusxalar mavjud yorqin chiziq ko‘rinadi.
Qizdirilganda inaktivatsiyalanuvchi polimerazani ilgari xar siklda qo‘shishga to‘g‘ri kelar edi, lekin keyinchalik termofil bakteriyalardan ajratib olingan termostabil polimerazalardan foydalanila boshlangan, u qizdirish jarayonlariga osonlik bilan bardosh berganligi sababli, PZRni amalga oshirish jarayoni kuchli darajada soddalashdi (ko‘pincha Thermophilus aquatius bakteriyasidan ajratib olingan Taq-polimerazadan foydalaniladi).
Reaksiya qorishmasidagi suvning kuchli darajada bug‘lanishini oldini olish uchun uning yuza qavatini qoplab turuvchi moy qo‘shiladi, va\yoki termosikler (PZR jarayoni o‘tkaziluvchi qurilma) qizdiriluvchi qopqog‘idan foydalaniladi. U probirkalar xaroratini tezlik bilan o‘zgartirganligi sababli, ularni bir termostatdan boshqasiga ko‘chirib o‘tkazishga zarurat qolmaydi. Qizdirilgunga qadar, xususan sikl boshlangunicha spetsifik bo‘lmagan sintezning oldini olish uchun ko‘p xollarda "Qaynoq startli" PZR.dan foydalaniladi: barcha DNK va polimeraza o‘zoro parafin qavati bilan ajratiladi, u yuqori xaroratda bug‘lanib, kerakli sharoitda ularning o‘zoro ta`sirlashuviga imkon yaratadi. Ba’zida esa past xaroratda ishlamaydigan, modifikatsiyaga uchragan polimerazalar qo‘llaniladi .
PZRning turli hil nozik tomonlari xaqida yana ko‘plab gapirish mumkin, ammo, natijalarni aniqlovchi klassik forezga al’ternativ bo‘lgan usullar xaqida to‘xtalish muximroq sanaladi. Misol uchun, reaksiya boshlanishidan avval reaksiya amalga oshuvchi probirkaga DNK mavjud sharoitda fluoressensiyalanuvchi moddalarni qo‘shish ochiq ko‘rinuvchi variantlardan biri sanaladi. Bunda dastlabki va so‘nggi fluoressensiyani o‘zoro solishtirish orqali DNKning miqdori ortgan yoki ortmaganligini bilish mumkin bo‘ladi. Lekin bu usul spetsifik emas: biz aynan kerakli DNK fragmenti sintezlanganmi yoki bo‘lmasa qandaydir praymerlar o‘zoro yopishib, boshqarib bo‘lmaydigan darajada ketma -ketliklarni xosil qilib olganligini aytib bera olmaymiz.
"Real vaqt"dagi PZR ("real-time PCR") nisbatan qiziq variant sanaladi. Bu usulni amalga oshirishning bir qancha yo‘llari mavjud, lekin barchasida ham g‘oya bir hil: to‘g‘ridan -to‘g‘ri reaksiya borish jarayonida maxsulot yig‘ilib borishini kuzatib borish mumkin (fluoressensiya orqali). Mos ravishda, "real vaqt"da PZRni amalga oshirish uchun xar bir probirkadagi fluoressensiyani qo‘zqatish va xisoblash imkoniga ega bo‘lgan maxsus anjom kerak bo‘ladi. Buning eng oson yechimi -DNK mavjud sharoitda fluoressensiyalanuvchi moddalarni probirkaga qo‘shish xisoblanadi. Ammo ushbu usulning minus tomonlari yuqorida takidlab o‘tildi.
"Real vaqt"dagi PZR - qat`iy tarzda "real vaqt rejimidagi fluoressensiyani qayd qilish bilan boruvchi PZR" yoki "miqdoriy PZR" deb nomlanadi.

10. Biologik makromolekulalarni vizualizasiyalashtirishning zamonaviy usullari

Agarda ketma –ketlik taxlilida qandaydir yutuqlarga erishilgan bo‘lsa, yuqori strukturalarni to‘liq taxlil etish uchun hali ko‘p yillar davomida ish olib borishga to‘g‘ri keladi. Ketma –ketliklarni to‘g‘ri joylashtirish muammosi –zamonaviy molekulyar biologiyaning asosiy mavzusi hisoblanadi. Aminokislotalarning chiziqli ketma–ketligi qanday qilib oqsilning uchlamchi strukturasini belgilaydi. 1961 yilda ribonukleazaning to‘liq denaturatsiyaga uchraganligi va fermentativ faolligi va dastlabki strukturasining to‘liq qayta tiklanganligi namoyish etilgan. Shundan so‘ng birlamchi struktura uchlamchi strukturani belgilaydi degan xulosaga kelingan. Dastlab oqsil molekulalarning joylashishini belgilovchi qonuniyatlar belgilangan. 1998 yilda ikkilamchi strukturani belgilovchi usul 50-60% ishonchlilik darajasiga ega bo‘lgan. Biologik makromolekulalarning birlamchi strukturasi asosida ularning fazoviy strukturalarini aniqlash, ularning to‘g‘ri taxlanish qonuniyatlarini tushunish uchun RasMol, PyMol, Modeller kabi bir qancha bioinformasion dasturlar mavjud. Ular yordamida ketma-ketligi aniqlangan makromolekulalarni vizualizasiyalashtirish mumkin.

Ikkilamchi strukturani aytib berish uchun uchta asosiy yo‘nalish mavjud:

1. Shu kungacha ma'lum bo‘lgan uchlamchi strukturalardan olingan parametrlarni qo‘llovchi emperik statistik yondashuvlar
2. Vodorod bog‘lar potensiali, zaryad, gidrofoblik, taxlanganlik darajai kabi fizik –kimyoviy xususiyatlarga asoslangan usullar
3. Ikkilamchi strukturani taxmin qilish uchun gomologik oqsillarning ma'lum bo‘lgan strukturalaridan foydalanuvchi, bashorat qiluvchi algoritmlar.
Yeng yaxshi usullardan biri standart emperik metodlar –Chon va Fasmanga asoslanib, gomologik bo‘lmagan oqsillardagi mumkin bo‘lgan konformasiyalardan foydalanadi. Lekin, uning ham ishonchlilik darajasi u qadar yuqori emas -65%. Bu konformasion potensiallarni baholash uchun qo‘llaniluvchi ma'lumot bazalari adekvatlik darajasining kichikligi bilan belgilanadi.
Molekulyar modellashtirish –molekulalar strukturasini va uning hususiyatlari haqidagi ma'lumotlarga tayangan holda uning molekulasini vizuallashtirish jarayonidir. Buning natijasida molekulalarning fazoviy strukturasini namoyon etuvchi uchlamchi strukturalar shakllanadi. Molekulyar modellashtirish usullari kompyuterli kimyo, hisoblash biologiyasi va molekulyar sistemalardagi bog‘lanishlarning tiplarini individual ko‘rinishda tasvirlash uchun qo‘llaniladi.
Oddiy tizimlarni molekulyar modellashtirish jarayonida hisoblash ishlari qo‘lda bajarilishi mumkin. Lekin, murakkab tizimlarni molekulyar modellashtirish jarayonida ayniqsa, molekulyar dinamikasini tadqiq etish jarayonida hisoblash va vizuallashtirishning kompyuterli usullaridan foydalaniladi. Bunday texnika kompyuterli molekulyar modellashtirish deb nomlanadi ( inglizchada Somputer Assisted Molecular Modeling-CAMM). Molekulyar modellashtirishning asosiy belgisi bu sistemalarni kichik qismlar asosida, atomlar yoki uncha katta o‘lchamga ega bo‘lmagan atomlar guruxi hisoblanadi. Aynan shu hususiyati bilan molekulyar modellashtirish elektronlar ham hisobga olinadigan kvant kimyosidan farqlanadi.
Molekulyar mexanika –molekulyar modellashtirishning bir usuli boo‘lib, modelning fizik asoslarini ochib berish uchun klassik mexanika qonunlaridan foydalaniladi. Atomlar mos ravishdagi zaryadlar bilan ifodalanadi. Qo‘shni atomlar orasidagi bog‘lanishlar molekulaga hos kimyoviy bog‘lar vositasida mustaxkam bo‘ladi va Van-der-Vals kuchlari yordamida bu bog‘lar yanada mustaxkamlanadi. elektrostatik bog‘lanishlar Kulon qonuni asosida tushuntiriladi. Fazodagi atomlarga Dekart yoki ichki kordinatalari biriktiriladi: dinamik hisoblashlarda tezlik va mos keluvchi harorat kiritilishi mumkin. Molekulyar dinamik hisoblashlar boshqa tomondan sistemaning vaqtga nisbatan funksiya ko‘rinishida namoyon etadi. Minimallashtirish va molekulyar dinamika uchun Nyutonning ikkinchi qonuni qo‘llaniladi. Harakatning bu qonunini turli algoritmlar vositasida integrallanishi atomlarning fazodagi va vaqt birligi ichidagi treaktoriyasining olinishiga olib keladi. Atomga ta'sir etuvchi kuch potensial energiyaning manfiy hosilali funksiyasi singari aniqlanadi.
Molekulalar vakuumda modellashtirilishi mumkin va shu bilan birga erituvchi, masalan suv vositasida ham bajarilishi mumkin. Vaakumdagi sistemalarning qiymatlari „gaz faza“dagi hisoblashlar, shuningdek erituvchi molekulasini o‘z ichiga oluvchi qiymatlarni „aniqberilgan erituvchi bilan“ qiymatlari deb atalishi mumkin. Hisoblashlarning boshqa guruxi erituvchining mavjudligini aniq bo‘lmagan erituvchi bilan“ qiymatlar deb ataluvchi potensial funksiyaning qo‘shimcha a'zolari bilan hisobga olinadi.
Hozirgi kunda molekulyar modellashtirish metodlari noorganik, biologik va polimer sistemalarning termodinamikasi, dinamikasi va strukturalarini o‘rganishda qo‘l kelmoqda. Biologik nuqtai nazardan oqsillarning barqarorligi, konformasion o‘zgarishlar va oqsillar, DNK, membranalardagi molekulyar tanish muammolari molekulyar modellashtirish usullari asosida o‘rganiladi.