Академии наук т. П. Побежимова, А. В. Колесниченко, О. И. Грабельных
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ
Download 1.37 Mb. Pdf ko'rish
|
pobezhimova полярография
|
2.2
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ В ПОЛИАКРИЛАМИДНОМ ГЕЛЕ С ДОДЕЦИЛСУЛЬФАТОМ НАТРИЯ (ПААГ с ДДС-NA) (ДЕНАТУРИРУЮЩИЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ) Принцип метода. Белки денатурируют анионным детергентом - додецилсульфатом натрия. Электрофорез в ПААГе с ДДС-Na обладает высокой разрешающей способностью и позволяет фракционировать белки в зависимости от их молекулярной массы (Остерман, 1985; Скоупс, 1985) (Рис. 14). Обработка додецилсульфатом натрия обеспечивает денатурацию белка и 53 разрыв -S-S- связей, но для полной денатурации необходимо присутствие β-меркаптоэтанола. Додецилсульфат натрия сильно связывается с белками за счет гидрофобных взаимодействий, так что достаточно только 0,1%-ного раствора этого детергента, чтобы насытить им полипептидные цепи. При этом связывается приблизительно 1 молекула детергента на 2 аминокислотных остатка. Хотя в данной системе невозможно разделить белки одинаковых размеров, тем не менее, этот метод дает наивысшее разрешение и самые четкие зоны по сравнению с любым другим методом. С помощью смеси стандартных полипептидов известной молекулярной массы гель можно прокалибровать в отношении зависимости подвижности молекул от их размеров. Рис. 14. Разделение белка в ПААГ по Лэммли. М-маркеры, 1 – 4 – анализируемые белки. Система электрофореза с ДДС-Na была разработана Лэммли (Laemmli, 1970). Рабочий гель полимеризуют на длину 10 см, 54 формирующий на 1 см. Особенностью ступенчатого электрофореза является полимеризация в одной пластине двух гелей: рабочего – мелкопористого и непосредственно над ним формирующего – крупнопористого. Кроме степени пористости эти гели резко различаются по рН и молярности буферов, в которых они полимеризуются. В формирующем геле небольшой протяженности (1-3 см) фракционирования белков не происходит. Основное назначение этого геля состоит в том, чтобы собрать смесь белков перед переходом в рабочий гель в одну узкую полосу. Для рабочего геля она является исходной зоной для фракционирования, а это резко повышает его разрешающую способность. Важнейшее преимущество гелей – это их стабилизирующее действие, проявляющееся в снижении до минимума конвекционной и диффузионной подвижности белков. Поэтому белковая полоса остается узкой все время, пока белок движется через гель, и это приводит к тому, что достигается полное разделение белков с очень близкой подвижностью. Крупнопористый формирующий гель полимеризуют в 0,0625 М трис-HCl, рН 6,8. Рабочий гель полимеризуют в 0,0375 М трис- HCl, рН 8,8. Полимеризацию инициируют, добавляя к раствору свежеприготовленный персульфат аммония, вместе с веществом, захватывающим свободные радикалы; для этого обычно используют ТЕМЕD (N,N,N’,N’-тетраметилэтилендиамин). Download 1.37 Mb. Do'stlaringiz bilan baham: 
|