Dnk ajralish usullari

1-bob. Nuklein kislotalar. Dezoksiribonuklein kislotaning (DNK) tuzilishi

1.2. Sekvensiya nuklein kislotalarni o'rganish usuli sifatida

Sekvensiya usullarini tahlil qilishga o'tishdan oldin nuklein kislotalar, xususan, DNK tushunchasi va ma'nosini aniqlash kerak.

Nuklein kislotalar tirik organizmlarning fosfor o'z ichiga olgan biopolimerlari bo'lib, irsiy ma'lumotlarni saqlash va uzatishni ta'minlaydi. Ularning makromolekulalari nukleotidlar bilan ifodalangan qayta-qayta takrorlanuvchi birliklardan iborat. Va ular mantiqan polinukleotidlar deb atalgan [2]. Nuklein kislotalarning asosiy xususiyatlaridan biri ularning nukleotid tarkibidir. Nukleotid (nuklein kislotalarning tarkibiy birligi) uchta komponentdan iborat:
azotli asos. Pirimidin yoki purin bo'lishi mumkin. Nuklein kislotalar 4 xil turdagi asoslarni o'z ichiga oladi: ulardan ikkitasi purinlar sinfiga va ikkitasi pirimidinlar sinfiga kiradi.
qolgan fosfor kislotasi.
Monosaxarid - riboza yoki 2-dezoksiriboza. Nukleotidning bir qismi bo'lgan shakar beshta uglerod atomini o'z ichiga oladi, ya'ni. pentoza hisoblanadi. Nukleotidda mavjud bo'lgan pentoza turiga qarab, nuklein kislotalarning ikki turi ajratiladi - riboza o'z ichiga olgan ribonuklein kislotalar (RNK) va deoksiriboza o'z ichiga olgan dezoksiribonuklein kislotalar (DNK).
Nukleotid asosan nukleozidning fosfat efiridir. Nukleozid ikki komponentdan iborat: monosaxarid (riboza yoki deoksiriboza) va azotli asos.
Azotli asoslar - nia - geterotsiklik organik birikmalar, nuklein kislotalar tarkibiga kiruvchi pirimidin va purin hosilalari. Qisqartirilgan belgi uchun bosh lotin harflari ishlatiladi. Azotli asoslarga ham DNK, ham RNK tarkibiga kiruvchi adenin ( A ), guanin ( G ), sitozin ( C ) kiradi. Timin ( T ) faqat DNKda, urasil ( U ) esa faqat RNKda uchraydi.1-jadvalda asosiy azotli asoslarning tuzilishi keltirilgan.

1-jadval
Asosiy azotli asoslarning tuzilishi

azotli asos	adenin	Guanin	Timin	Sitozin	Uratsil
Nukleozid	Adenozin A	Guanozin G	Timidin T	Sitidin C	Uridin U

Dezoksiribonuklein kislotaning (DNK) tuzilishi

DNKning asosiy tuzilishi polinukleotid zanjirida dezoksiribonukleozid monofosfatlarning (dNMP) almashinish tartibidir.
Polinukleotid zanjiridagi har bir fosfat guruhi, molekulaning 5'-uchidagi fosfor qoldig'i bundan mustasno, ikkita qo'shni deoksiribozaning 3' va 5'-uglerod atomlarini o'z ichiga olgan ikkita efir bog'larini hosil qilishda ishtirok etadi. monomerlar orasidagi bog'lanish 3', 5'- fosfodiester bilan belgilanadi [10].
DNKning terminal nukleotidlari tuzilishiga ko'ra farqlanadi: 5' uchida fosfat guruhi, 3' uchida esa erkin OH guruhi joylashgan. Bu uchlar 5' va 3' uchlari deb ataladi. DNK polimer zanjiridagi dezoksiribonukleotidlarning chiziqli ketma-ketligi odatda bir harfli kod yordamida qisqartiriladi, masalan - A - G - C - T - T - A - C - A - 5'-dan 3'-uchgacha.
DNKning ikkilamchi tuzilishi. 1953 yilda J. Uotson va F. Krik DNKning fazoviy tuzilishi modelini taklif qildilar. Ushbu modelga ko'ra, DNK molekulasi bir-biriga nisbatan va umumiy o'q atrofida burilgan ikkita polinukleotid zanjiridan hosil bo'lgan spiral shakliga ega. Ikki tomonlama spiral o'ng qo'lli, undagi polinukleotid zanjirlari antiparallel, ya'ni. agar ulardan biri 3' → 5' yo'nalishi bo'yicha yo'naltirilgan bo'lsa, ikkinchisi 5' → 3' yo'nalishi bo'yicha yo'naltirilgan bo'ladi.

DNKning qo'sh spiral. DNK molekulalari komplementar nukpeotid ketma-ketligiga ega ikkita antiparallel zanjirdan iborat. Zanjirlar bir-biriga nisbatan o'ng qo'lli spiralda o'ralgan bo'lib, har bir burilishda taxminan 10 ta asosiy juftlik mavjud.

DNK molekulalari bir zanjirning 5' uchida va ikkinchi zanjirning 3' uchida joylashgan [25].
DNK zanjirlarining barcha asoslari qo'sh spiral ichida, pentozafosfat magistral esa tashqarida joylashgan. Polinukleotid zanjirlari bir-biriga nisbatan komplementar purin va pirimidin azotli asoslari A va T (ikkita bog') va G va C (uchta bog') o'rtasidagi vodorod aloqalari orqali tutiladi. Ushbu kombinatsiya bilan har bir juft uchta halqani o'z ichiga oladi, shuning uchun bu tayanch juftlarining umumiy hajmi molekulaning butun uzunligi bo'ylab bir xil bo'ladi. Bir juftlikdagi boshqa asoslar birikmalari bilan vodorod aloqalari mumkin, ammo ular ancha zaifdir. Bir zanjirning nukleotidlar ketma-ketligi ikkinchi zanjirning nukleotidlar ketma-ketligini to'liq to'ldiradi. Bir-birini to'ldiruvchi asoslar spiralning o'zagida joylashgan. Ikki zanjirli molekulaning asoslari o'rtasida gidrofobik o'zaro ta'sirlar paydo bo'lib, qo'sh spiralni barqarorlashtiradi.
DNK ning uchinchi darajali tuzilishi (DNKning supercoiling). Har bir DNK molekulasi alohida xromosomaga qadoqlangan. Diploid inson hujayralarida 46 xromosoma mavjud. Hujayraning barcha xromosomalari DNKsining umumiy uzunligi 1,74 m ni tashkil qiladi, lekin u diametri millionlab marta kichikroq bo'lgan yadroga o'ralgan. Hujayra yadrosida DNKni tartibga solish uchun juda ixcham struktura hosil bo'lishi kerak. DNKning siqilishi va supero'ralishi DNK tuzilishidagi ma'lum ketma-ketliklar bilan o'zaro ta'sir qiluvchi turli xil oqsillar yordamida amalga oshiriladi. Barcha eukaryotik DNK bilan bog'lovchi oqsillarni 2 guruhga bo'lish mumkin: giston va giston bo'lmagan oqsillar. Hujayralarning yadro DNKsi bilan oqsillar majmuasiga xromatin deyiladi [19].
Nuklein kislotalarni o'rganish usullari (molekulyar genetik usullar) katta va xilma-xil usullar guruhi bo'lib, oxir-oqibat o'rganilayotgan DNK mintaqasi (allel, gen, xromosoma mintaqasi) tuzilishidagi o'zgarishlarni birlamchi asoslar ketma-ketligini dekodlashgacha aniqlash uchun mo'ljallangan. 4]. Bu usullar DNK va RNKning “manipulyatsiyasi”ga asoslangan. 1970—1980-yillarda odam molekulyar genetikasining jadal rivojlanishi va keyinchalik inson genomini muvaffaqiyatli oʻrganish natijasida molekulyar genetik usullar tibbiy genetik amaliyotda keng qoʻllanila boshlandi. DNK tadqiqoti uchun ishlatiladigan fermentlarning bir qismi 2-jadvalda keltirilgan.

jadval 2
Genetika muhandisligida qo'llaniladigan asosiy fermentlar

Ferment	Reaktsiya	Qo'llash sohasi
Cheklovlar	Muayyan nukleotidlar ketma-ketligida DNKni parchalash	DNK fragmentlarini olish, kimerik DNK molekulalarini yaratish
Nukleaza	DNKning ikkala 5' va 3' uchlarining degradatsiyasi	DNK molekulalarida terminal deletsiyalarning shakllanishi
DNK ligaza	DNK molekulalari orasidagi bog'lanishni katalizlaydi	DNK bo'laklarini "tikish"
DNK polimeraza I	DNK shablonidan ikki zanjirli DNK sintezi	Ikki zanjirli DNK sintezi
DNase - I	DNKda bir zanjirli uzilishlarni kiritadi	DNKdagi hududlarni xaritalash
Eksonukleaza - III	DNKning 3 uchidan nukleotidlarni olib tashlaydi	DNK ketma-ketligi
ekzonukleaza	DNKning 5 uchidan nukleotidlarni olib tashlaydi.	DNK ketma-ketligi
Teskari transkriptaza	RNK shablonidan DNKni sintez qiladi	mRNK dan cDNK sintezi: DNK xaritasi

So'nggi paytlarda molekulyar biologiya katta cho'qqilarni zabt etdi, bu 1970-yillarning ikkinchi yarmida ishlab chiqilgan DNK sekvensiyasining tezkor usullari tufayli mumkin bo'ldi. DNKdagi nukleotidlar ketma-ketligi haqidagi ma'lumotlar juda muhim va zarur bo'lib chiqdi. Shu bilan birga, shuni ta'kidlash kerakki, hozirgi DNK ketma-ketligi faqat boshida bo'lganiga o'xshaydi [10]. Muayyan tadqiqotchilar oldida turgan vazifalarga asoslanib, DNK ketma-ketligining har xil turlari mavjudligini aytishimiz mumkin. Ko'pgina laboratoriyalar individual genlar va boshqa DNK bo'laklarining muntazam ketma-ketligini amalga oshiradilar, boshqalari esa ba'zi organizmlarning butun genom ketma-ketligini amalga oshirishni boshlaydilar. Ushbu protsedura haqiqiy ishlab chiqarishga aylandi, bu erda ko'plab operatsiyalar to'liq avtomatlashtirilgan. Ikkinchisi nafaqat molekulyar biologiyaning, balki fan va texnikaning turdosh sohalarining ham yutug‘idir [6].

Shunday qilib, DNK ketma-ketligi, jumladan, uning ko'plab tarkibiy qismlari, o'z evolyutsiyasining chorak asrida bir qator ko'plab o'zgarishlar va yaxshilanishlarni boshdan kechirdi. Fan rivojining hozirgi bosqichida ketma-ketlik usullaridan unumliroq foydalanish borasida bir fikrga kelinmagan. Shunday qilib, hozirgi bosqichda an'anaviy DNK sekvensiyasida ba'zi odamlar bir zanjirli DNK shablonlaridan foydalanishni afzal ko'radilar, ba'zilari ikki zanjirlilarni afzal ko'radilar, boshqalari esa DNK ketma-ketligini faqat tsiklik ketma-ketlik yordamida aniqlaydilar. Xuddi shunday holat ishlatiladigan teglar turi bilan ham kuzatiladi, bu erda tanlov klassik 32P radionuklididan eng so'nggi floresan bo'yoqlarga qadar bo'ladi.
Shunday qilib, ketma-ketlik - bu DNK molekulasidagi nukleotidlar ketma-ketligini aniqlashga imkon beradigan usullarning umumiy nomi. Hozirgi vaqtda butun DNK molekulasi uchun ishlaydigan yagona sekvensiya usuli mavjud emas; ularning barchasi quyidagicha tartibga solinadi: birinchidan, DNKning katta miqdordagi kichik bo'limlari tayyorlanadi (DNK molekulasi ko'p marta klonlanadi va tasodifiy joylardan "kesiladi"), so'ngra har bir bo'lim alohida o'qiladi. Qiziqarli ketma-ketliklar mos keladigan fragmentni, masalan, PCR orqali klonlash orqali yaratilishi mumkin. Maxam-Gilbert sekvensiyasi usuli DNKning ma'lum bir asosda kimyoviy bo'linishiga asoslangan. Yana bir fermentativ usul (Senger usuli) mos keladigan analog zanjiriga kiritish joyida bir ipli shablon yordamida komplementar DNK zanjirining sintezini to'xtatuvchi nukleotid analoglaridan foydalanishga asoslangan. Sekvensiya barcha xromosomalarning to'liq nukleotidlar ketma-ketligini, har qanday genomning butun DNKsini, har qanday organizmni aniqlash imkonini beradi. Bu usul har qanday genlarning nukleotidlar ketma-ketligini aniqlash imkonini beradi, bu esa ularni sintez qilish imkonini beradi [21].
Klonlash yoki oddiygina Petri idishida hujayralarni o'stirish yoki (bu juda sekin yoki biron sababga ko'ra ishlamaydigan hollarda) polimeraza zanjiri reaktsiyasi deb ataladigan usul yordamida amalga oshiriladi. Qisqacha va noto'g'ri, u shunday ishlaydi: birinchi navbatda, DNK denatüre qilinadi, ya'ni. vodorod aloqalarini yo'q qilish, individual iplarni olish. So'ngra primerlar deb atalmish DNKga biriktiriladi; bu DNK polimeraza biriktira oladigan DNKning qisqa bo'limlari - aslida DNK zanjirini nusxalash (replikatsiya qilish) bilan shug'ullanadigan birikma. Keyingi bosqichda polimeraza DNKni ko'paytiradi, shundan so'ng jarayon takrorlanishi mumkin: yangi denaturatsiyadan so'ng, individual iplar ikki baravar ko'p bo'ladi, uchinchi tsiklda - to'rt baravar va hokazo [22].
Bu ta'sirlarning barchasi, asosan, DNK, primerlar va polimeraza aralashmasining haroratini o'zgartirish orqali erishiladi; Bizning maqsadlarimiz uchun bu juda to'g'ri jarayon bo'lishi va undagi xatolar kamdan-kam bo'lishi va chiqishi bir xil DNK bo'limlarining ko'p nusxalari bo'lishi muhimdir. Turli xil ketma-ketlik usullari bir-biridan klonlash usullarida emas, balki bir xil DNKning ko'p nusxalaridan olingan "sho'rva" ni qanday o'qishda farqlanadi.
Endi DNK ketma-ketligini aniqlashning zamonaviy usullarining barcha mavjud tamoyillari va analitik imkoniyatlarini uchta asosiy turga bo'lish mumkin: klassik - kapillyar elektroforez va pirosekvensiya yordamida ketma-ketlashtirish; yangi ("ikkinchi" avlod) - bir vaqtning o'zida millionlab DNK parchalarini ketma-ketlashtirish, ularning har biri ko'p minglab yoki yuz minglab uning klonlari klasteri bilan ifodalanadi - bu yuqori samarali pirosekvensiya, tsiklik ligaza va yarimo'tkazgich sekvensiyasi; floresan yorliqli prekursorlardan foydalangan holda molekulyar klasterlar bo'yicha ketma-ketlik; millionlab bitta DNK fragmentlaridan ma'lumotlarni oldindan klonlashsiz o'qiy oladigan eng yangi ("uchinchi" avlod) sekvensiya usullari . Ular orasida bitta molekula ketma-ketligi texnologiyasi, real vaqt rejimida bitta molekula ketma-ketligi va nanoporalarni ketma-ketlashtirish kiradi. Bizning tadqiqotimizda biz ikkita eng mashhur ketma-ketlik usullarini ko'rib chiqamiz: Maxam-Gilbert va Segner usullari. Shuningdek, biz eng so'nggi ketma-ketlik usullari va texnologiyalarining xususiyatlarini muhokama qilamiz [23].

1.2. Maxam va Gilbertning modifikatsiyalangan usuli bilan nukleotidlar ketma-ketligini aniqlash

Maxam va Gilbert usuli DNKning kimyoviy degradatsiyasiga asoslangan. U 1976 yilda Maxam va Gilbert tomonidan taklif qilingan va ularning nomi bilan atalgan. Usulning mohiyati quyidagicha: DNK fragmentining uchlaridan biri 32P fosfor izotopi bilan belgilanadi. Yaqinda radioaktiv yorliq oʻrniga lyuminestsent yorliq joriy etildi [1]. Shuningdek, u nukleotidlarga "biriktirilishi" mumkin va har bir nukleotid turi uchun boshqa rang tanlanishi mumkin. Belgilangan DNK preparati to'rt qismga bo'linadi va ularning har biri to'rtta asosdan birini yoki ikkitasini maxsus ravishda yo'q qiladigan reagent bilan ishlanadi va reaktsiya sharoitlari har bir DNK molekulasida faqat bir nechta jarohatlar paydo bo'lishi uchun tanlanadi.

Yo'q qilish 2 bosqichda davom etadi. Birinchi bosqichda azotli asos o'zgartiriladi va keyin ajraladi. Ikkinchi bosqichda DNK gidrolizi asosiy parchalanish joylarida amalga oshiriladi. Purin asoslari dimetil sulfat bilan o'zgartiriladi. Adenin qoldiqlari uchinchi azot atomida metillanadi, guanin qoldiqlari N7 holatida metillanadi. Agar bunday modifikatsiya 0°C da 0,1 M HCl bilan ishlansa, u holda metilladenin parchalanadi. Ishqoriy muhitda (0,1 M NaOH) +90 ° C haroratda keyingi inkubatsiya paytida shakar-fosfat aloqasi asosning parchalanish joylarida yo'q qilinadi. Zararlangan molekulalarni piperidin bilan davolash metilguanin qoldiqlarida DNK gidrolizlanishiga olib keladi. Pirimidin asoslari gidrazin bilan o'zgartiriladi. Tuzsiz muhitda sitozin ham, timin ham o'zgaradi, 2 M NaCl ishtirokida faqat sitozin o'zgaradi. Piperidin bilan keyingi davolashda DNK modifikatsiya nuqtalarida parchalanadi. Bazalarning kimyoviy modifikatsiyasi va ulardagi DNK molekulalarining parchalanishining boshqa reaksiyalaridan ham foydalanish mumkin [31]. Natijada, uzunliklari vayron qilingan asosdan molekulaning oxirigacha bo'lgan masofa bilan belgilanadigan etiketli fragmentlar to'plami olinadi. Barcha to'rtta reaktsiyada hosil bo'lgan fragmentlar to'rtta qo'shni bo'lakda elektroforezga duchor bo'ladi; keyin radioavtografiya o'tkaziladi va radioaktiv yorlig'i bo'lgan parchalar rentgen plyonkasida "izlar" qoldiradi. Bosimlarning holatiga ko'ra, vayron qilingan poydevor belgilangan uchidan qaysi masofada joylashganligini va bu asosni bilish - uning holatini aniqlash mumkin. Shunday qilib, rentgen plyonkasidagi bantlar to'plami DNKning nukleotidlar ketma-ketligini aniqlaydi. Xuddi shunday, floresan bo'yash kuzatiladi. Agar to'rtta nukleotidning har biri uchun floresan yorlig'ining boshqa rangi tanlangan bo'lsa, elektroforez paytida ular 1 chiziqqa qo'llaniladi. Keyin nukleotidlarning joylashishi turli rangdagi zarbalar bilan belgilanadi va o'qish jarayonini avtomatlashtirish oson [1].
Geterotsiklik asoslarning har bir turi uchun selektiv modifikatsiya reaktsiyalari shunday amalga oshiriladiki, har bir DNK molekulasida o'rtacha bu turdagi faqat bitta bo'g'in o'zgartiriladi. Molekula tarkibidagi ma'lum turdagi barcha birliklar ekvivalent bo'lganligi sababli va modifikatsiya qiluvchi vosita bilan bir xil tezlikda reaksiyaga kirishganligi sababli, jami bu turdagi har bir birlik qisman o'zgartiriladi. DNKni ikkilamchi amin yoki gidroksidi bilan keyingi ishlov berish DNK zanjiridan o'zgartirilgan geterotsiklik asoslarning ajralishiga va geterotsikllarning parchalanish joylarida polinukleotid zanjirining parchalanishiga olib keladi (1-rasm) [2].
O'zgartirishlar 5'-terminal nukleotid birligida yorliqlangan DNK 32P da amalga oshiriladi. Radioaktiv yorliq -32P-ATP va T4-polinukleotid kinaz yordamida fosforlanish orqali kiritiladi [5].



Shakl 1. Ikkilamchi amin yoki gidroksidi bilan ishlov berilgandan so'ng DNK zanjiridan o'zgartirilgan birliklarning ajralishi.

Shunday qilib, kimyoviy parchalanish natijasida turli uzunlikdagi DNK bo'laklari to'plami olinadi. Ushbu bo'laklarning uzunligi o'zgartirilgan turdagi monomer birliklarining holatiga mos keladi. Terminal radioaktiv yorlig'i DNKning kimyoviy parchalanishi mahsulotlarining uzunligini aniqlashda mos yozuvlar nuqtasi bo'lib xizmat qiladi (2-rasm).

Olingan fragmentlar to'plami PAAGda elektroforez orqali fraksiyalanadi, bu uzunligi bo'yicha faqat bitta monomer birligi bilan farq qiluvchi oligo (poli) nukleotidlarni ajratish imkonini beradi. DNKdagi nukleotidlar ketma-ketligini to'g'ridan-to'g'ri gel avtografidan o'qish mumkin [8].
Etarlicha uzun DNKning birlamchi tuzilishini tahlil qilish uchun ishlab chiqilgan Maxam va Gilbert usuli qisqa (8-16 mer) oligodeoksiribonukleotidlarga ham tegishli. Biroq, bu holda, kimyoviy modifikatsiyalash reaktsiyalari modifikatsiya darajasini oshirish uchun yanada og'irroq sharoitlarda (reaktsiya vaqti va haroratni oshirish) amalga oshiriladi.



Shakl 2. DNKning kimyoviy degradatsiyasi.

Muayyan turdagi monomerik birliklarda DNKning parchalanishi uchun ishlatiladigan reaktsiyalar to'plami juda katta va doimiy ravishda yangilanadi: guanin qoldiqlari uchun - dimetil sulfat bilan ishlov berish (3-rasm); adenin va guanin qoldiqlari uchun - 50% chumoli kislotasi bilan apurinizatsiya (Barton bo'yicha); adenin va sitozin qoldiqlarida - 1,2 n ta'sirida geterotsiklik asoslarning parchalanishi. natriy gidroksidi va timidin va sitozin qoldiqlari uchun - gidrazin bilan ishlov berish (4-rasm).

Hozirgi vaqtda Maxam-Gilbert sekvensiyasining ikkita asosiy varianti keng qo'llaniladi. Ulardan birinchisida DNKni kimyoviy modifikatsiyalash reaksiyalari eritmada amalga oshiriladi, ikkinchisida esa DNK qattiq fazada (masalan, DEAE-tsellyuloza) oldindan immobilizatsiya qilinadi. Birinchi usul ko'proq an'anaviy bo'lib, uning ko'plab modifikatsiyalari turli o'lchamdagi DNK fragmentlarini, shu jumladan oligonukleotidlarni ketma-ketlashtirish uchun muvaffaqiyatli ishlatilgan. Shu bilan birga, ikkinchi usul bir qator afzalliklarga ega. Bu kamroq mehnat talab qiladi va kamroq vaqt talab etadi, o'rganish osonroq va minimal jihozlar to'plami bilan ishlashga imkon beradi. Umuman olganda, ikkala usul ham juda maqbul natijalarni beradi va ulardan birini tanlash laboratoriyaning o'ziga xos shartlari bilan belgilanadi.




Shakl 3. Guanin qoldiqlari uchun selektiv parchalanish reaktsiyasi



Shakl 4. Timidin va sitozin qoldiqlari uchun selektiv parchalanish reaktsiyasi.
Maxam-Gilbert bo'yicha kimyoviy parchalanish yo'li bilan DNKni ketma-ketlashtirish usuli Sanger bo'yicha DNK sekvensiyasining fermentativ usuli bilan solishtirganda nisbatan past mahsuldorlikka qaramay, bu usul bugungi kunda ham mashhur bo'lib qolmoqda. Shunday qilib, zarur bo'lgan hollarda sintetik oligonükleotidlarni sekvensiyalash uchun kimyoviy parchalanish usuli qo'llaniladi. Ushbu usul kuchli ikkilamchi tuzilishga ega bo'lgan ayniqsa "qiyin" hududlarni yangi DNK zanjirining fermentativ konstruktsiyasi yordamida ketma-ketlashtirish mumkin bo'lmaganda qo'llaniladi. Kimyoviy degradatsiya yo‘li bilan DNK sekvensiyasining afzalliklaridan biri shundaki, u DNK fragmentining genomik yoki klonlangan ketma-ketligini qandaydir mos vektorda (ya’ni, in vivo replikatsiya qilingan) aniqlaydi, ammo in vitroda yangi sintezlangan nusxa emas. dideoksiterminatorlar bilan fermentativ usul. Maxam-Gilbert DNK sekvensiyasi usuli va Sanger usuli o'rtasidagi yana bir farq shundaki, uni amalga oshirish qo'shimchada mavjud bo'lgan deyarli har qanday cheklash endonukleazani aniqlash joyidan boshlanishi mumkin. shuning uchun bu joyni o'rab turgan nukleotidlar ketma-ketligining kichik bir qismini ham oldindan bilishni talab qilmaydi. Shu munosabat bilan, kimyoviy parchalanish orqali DNK sekvensiyasi usuli ba'zan kengaytirilgan DNK fragmentlarining nukleotidlar ketma-ketligini aniqlash bo'yicha keng ko'lamli loyihalar uchun boshlang'ich nuqta bo'lib xizmat qiladi [9].
Maxam-Gilbert DNK sekvensiyasi usulining asosiy kamchiligi ishlatiladigan reagentlarning ko'pchiligining yuqori toksikligi bo'lib, ular bilan ishlash va ularni keyinchalik yo'q qilish muayyan qoidalarga rioya qilishni talab qiladi.
Xulosa qilib aytganda, biz Maxam-Gilbert sekvensiyasi jarayonining asosiy tarkibiy qismlarini ajratib ko'rsatishimiz mumkin: Maxam-Gilbert bo'yicha DNK ketma-ketligi printsipi , DNK bo'laklarini etiketlash. Maxam-Gilbertga , Maxam-Gilbert bo'yicha DNK parchalarini tayyorlash , DNK o'zgartirilgan asoslarda bo'linish , elektroforez va Maxam-Gilbertga muvofiq avtoradiografiya .

2-bob . Segner usuli bo'yicha DNK ketma-ketligi

2.1. DNK sekvensiyasining ishonchliligi

Sanger tomonidan ishlab chiqilgan va uning nomi bilan atalgan boshqa usul kimyoviy emas, balki fermentativ yondashuvga asoslangan. Sanger DNK polimeraza I dan foydalandi. Hujayrada bu ferment replikatsiya jarayonida ishtirok etib, yangi sintez qilingan DNK fragmentlari (Okazaki fragmentlari) orasidagi bo'shliqlarni to'ldiradi [22]. Probirkada fermentning ishlashi uchun DNK prekursorlari, dezoksiribonukleotid trifosfatlar (dNTP), shuningdek, bir ipli shablon kerak bo'lib, ularda kichik ikki ipli mintaqa - sintez boshlanadigan primer bo'lishi kerak (5-rasm). ).

Shakl 5. DNK sekvensiyasining fermentativ usuli
Dezoksiriboza 3'-OH bo'lmagan modifikatsiyalangan dideoksiribonukleotidlar ham to'rtta DNK asosining har biri uchun sintez qilingan. DNK polimeraza bu prekursorlarni DNK tarkibiga kiritadi. Biroq , DNKga kiritilgandan so'ng, o'zgartirilgan asos keyingi deoksiribonukleotid bilan fosfodiester aloqasini hosil qila olmaydi. Natijada, bu zanjirning o'sishi (uzayishi) dideoksiribonukleotid (ddNTP) DNKga kiritilgan joyda to'xtaydi (tugaydi). Shuning uchun ular cho'zilish terminatorlari deb ataladi.
Sanger reaktsiyasi aralashmasi DNK zanjiridan iborat bo'lib, uning nukleotidlar ketma-ketligi aniqlanishi kerak, bu zanjirning oxirgi segmentini (primer) to'ldiruvchi "yorliqlangan" DNKning qisqa bo'lagi, to'rtta ddNTPdan biri va tegishli dNTP. qat'iy belgilangan nisbat (ular raqobat qilishlari uchun), shuningdek, boshqa uchta dNTP. To'rtta aralashma tayyorlanadi, ularning har biri to'rtta ddNTPdan birini o'z ichiga oladi. Naychalarning har birida turli uzunlikdagi etiketli bo'laklar to'plami hosil bo'ladi. Ularning uzunligi nuqsonli nukleotid zanjirning qayerda joylashganligiga bog'liq. Olingan yorliqli DNK bo'laklari poliakrilamid jelida (bitta nukleotid aniqligi bilan) ajratiladi, avtoradiografiya o'tkaziladi va to'rtta namunadagi fragmentlarning tarqalish sxemasidan DNK nukleotidlari ketma-ketligi aniqlanadi [24].
Tezkor ketma-ketlik usullari ishlab chiqilgandan so'ng, o'ziga xos, oldindan belgilangan ketma-ketlikka ega bo'lgan nisbatan uzun oligonükleotidlarni sintez qilishning teng darajada tez va oddiy usullari paydo bo'ldi. Endi uch-to'rt kun ichida 12-20 ta nukleotidlar ketma-ketligini sintez qilish mumkin. Ushbu protsedurani avtomatlashtirish sintezni yanada osonlashtiradi va tezlashtiradi. Qurilmalar paydo bo'ldi - bu ishni bir necha soat ichida bajaradigan DNK sintezatorlari.
(polimeraza zanjiri reaktsiyasi) ning keng joriy etilishi tufayli DNK fragmentlarini izolyatsiya qilish, rekombinant genlarni yaratish, shuningdek, DNK va cDNKni to'g'ridan-to'g'ri sekvensiyalash hamma uchun ochiq usullarga aylanmoqda . PCRning mohiyati DNK polimeraza yordamida shablonning qarama-qarshi uchlaridan bir vaqtning o'zida qo'shimcha iplarni sintez qilish uchun primer sifatida DNK segmentining ikkita zanjirining qarama-qarshi uchlarida nukleotidlar ketma-ketligi bilan maxsus gibridlanishga qodir ikkita primer oligonükleotiddan foydalanishdir. Takroriy tsikllar davomida (DNKning termal denatüratsiyasi, tavlanishi va primerlarning fermentativ tugallanishi) primerlarning birlamchi tuzilishiga mos keladigan nukleotidlar ketma-ketligi bilan qoplangan diskret fragment miqdori eksponensial ravishda ortadi [23].
Sanger usulining qo'llanilishi klonlangan DNKning bir zanjirli nusxalarini olish qobiliyatiga bog'liq. Shu maqsadda M13 bakteriofagiga asoslangan vektorlardan foydalanish mumkin. Ikki zanjirli begona DNK fag DNK ning ikki zanjirli replikativ shakliga (RF) klonlanishi mumkin, DNK zanjirlaridan faqat bittasi transformatsiyadan so'ng oqsil qoplamiga o'raladi. M13mp tipidagi barcha vektorlar o'xshash polilinker ketma-ketliklaridan foydalanadi, shuning uchun polimeraza reaktsiyalarini boshlash uchun bir xil universal primer mos keladi. Genlar aralashmasini (masalan, genlar oilasi) kuchaytirishda M13 vektorlarida PCR mahsulotlarini klonlash kerak, natijada har bir fag faqat bitta qo'shimchani o'z ichiga oladi. Genlar aralashmasining to'g'ridan-to'g'ri ketma-ketligi bilan jelning turli chiziqlarida bir xil joylashgan bir nechta chiziqlar kuzatiladi. Bitta genni kuchaytirganda, to'g'ridan-to'g'ri sekvensiya oraliq subklonlashdan foydalanmasdan amalga oshirilishi mumkin [23].
PCR uchun optimal primerni tanlash kuchaytirilayotgan DNK fragmentining 5'- va 3'-terminal ketma-ketligiga bog'liq. Bundan tashqari, M13 vektorining polilinker joyiga PCR mahsulotini kiritish uchun primerlarning 5' uchida tegishli cheklash joylari kiritilishi kerak. Bunday holda, PCR kuchaytirilishi va undan keyin mahsulotning cheklanishi uni bir xil ferment tomonidan cheklangan M13 DNKga qo'shish imkonini beradi. Kuchaytirilishi kerak bo'lgan fragmentning turli uchlarida turli xil cheklovchi fermentlar uchun joylarni kiritish yaxshiroqdir, chunki bu vektor DNKning o'z-o'zidan tavlanishiga yo'l qo'ymaydi va klonlangan qo'shimchaning ma'lum bir yo'nalishda (deb ataladigan) joylashishini ta'minlaydi. yo'naltirilgan klonlash). Astarlarni tanlashda quyidagi omillarni hisobga olish kerak [27].
a. Kuchaytirilishi kerak bo'lgan genlar oilasida primerga kiritilgan saytga o'xshash saqlanib qolgan ichki cheklash joyi yo'qligiga ishonch hosil qilish kerak.
b. 5' cheklash joyi kiritilgandan so'ng, primerning oxiri uzaytirilishi kerak, aks holda cheklash fermenti primerni ajratmaydi. Har bir ferment uchun talab qilinadigan haddan tashqari uzunlik va cheklash vaqtlari New England BioLabs katalogida keltirilgan.
Ikki zanjirli rekombinant M13 DNK ketma-ketlikdan oldin bitta zanjirli shaklga aylantirilishi kerak. Buning uchun u vakolatli E. coli hujayralariga aylantirish orqali boshqariladi. Bir zanjirli rekombinant faglarni o'z ichiga olgan plastinkalarni olib tashlash, bakterial madaniyatda o'stirish va deproteinizatsiya qilish kerak [27].
Keyin kultura 1,5 ml mikrotsentrifuga naychasiga o'tkaziladi va mikrotsentrifugada 12000 g 5 daqiqa davomida sentrifugalanadi. 1 ml supernatantni (tarkibida sof fag bor) ikkinchi 1,5 ml li probirkaga o‘tkazing, 200 mkl polietilen glikol qo‘shing va xona haroratida kamida 15 daqiqa davomida inkubatsiya qiling. 12000 g da 5 daqiqa davomida santrifüj qilish orqali fagni yig'ing va supernatantni to'plang. Santrifüjni tez takrorlang va supernatantning barcha izlarini to'liq olib tashlang. Keyin DNK natriy asetat bilan cho'ktiriladi, 70% etanol bilan yuviladi va vakuum ostida quritiladi. DNKni 30 µl suvda eritib yuboring. Olingan DNK bitta zanjirli sekvensiya shablonidir.
Hozirgi vaqtda o'rtacha uzunlikdagi har qanday DNK segmentining aniq nukleotidlar ketma-ketligini aniqlash butunlay hal qilinadigan muammodir. Bir necha yuzlab pro- va eukaryotik genlarning ketma-ketligi allaqachon aniqlangan. Genning ketma-ketligini va genetik kodni bilish, u kodlagan oqsilning aminokislotalar ketma-ketligini aniqlash oson. Ilgari, oqsilning tuzilishini aniqlash uchun ajratilgan va tozalangan oqsilni to'liq va juda mashaqqatli tahlil qilish kerak edi. Endi oqsilning tuzilishini to'g'ridan-to'g'ri sekvensiyadan ko'ra nukleotidlar ketma-ketligi orqali aniqlash osonroq. Proteinlar ketma-ketligi bir necha oy yoki hatto yillar davom etsa-da, DNKni bir necha hafta ichida tartiblash mumkin.
DNK ketma-ketligi, shuningdek, oqsillarni kodlamaydigan, ammo genlar ifodasi va DNK replikatsiyasini tartibga solishda ishtirok etadigan hududlarni kashf qilishga olib keldi. 1996 yilda xamirturush genomi, 1998 yilda - Arabidopsis genomi, 2000 yilda - inson genomi, lekin bu holda biz faqat nukleotidlar ketma-ketligini o'rnatish haqida gapiramiz, chunki genomning alohida bo'limlarining genetik tuzilishi va funktsiyalari mavjud. hali aniqlanmagan, bu qiyinroq vazifa [29].
Yuqorida aytilganlardan ko'rinib turibdiki, Dideoksiterminatorlar yordamida Sanger fermentativ DNK sekvensiyasi usuli ishlab chiqilganidan beri u ko'plab modifikatsiyalarga va barcha turdagi yaxshilanishlarga duchor bo'lgan. Turli darajada, bu jarayonning deyarli barcha tarkibiy qismlari o'zgargan. Shunday qilib, ularning keyingi ketma-ketligi uchun DNK shablonlarini olish yondashuvlari boshqacha bo'ldi, birinchi yillarning asosiy fermenti, E. Coli DNK polimeraza I ning Klenovskiy fragmenti amalda qo'llanilmadi, urug' molekulalariga qarashlar o'zgardi, dNTP va o'zgartirildi . ddNTPlar paydo bo'ldi, etiketli molekulalarni tanlash kengaydi, shu jumladan va radioaktiv bo'lmagan, elektroforetik ajratish, radioavtografiya va nukleotidlar ketma-ketligini "o'qish" bosqichlari sezilarli darajada yaxshilandi, kompyuter dasturiy ta'minoti beqiyos o'sdi. PCRning paydo bo'lishi va DNK nukleotidlari ketma-ketligini fermentativ usul bilan aniqlashning asosiy bosqichlarini avtomatlashtirish haqida gapirmasa ham bo'ladi, ammo boshqa boblarda [30] ko'rib chiqiladi.
Nukleotidlar ketma-ketligi ko'rinishida olingan ma'lumotlarning ishonchliligi kichik ahamiyatga ega bo'lib, unga doimo jiddiy e'tibor berilgan. Birlamchi ma'lumotlarni tahlil qilishda noaniqliklarni aniqlash, shuningdek, keng ko'lamli DNK sekvensiyasi loyihasining butun jarayonini nazorat qilish uchun maxsus kompyuter dasturlari ishlab chiqilgan. Bu, ayniqsa, bitta laboratoriyada bir nechta yirik loyihalar amalga oshirilayotgan va ma'lumotlar oqimi juda yuqori bo'lgan hollarda muhim ahamiyatga ega. Kaleidaseq dasturi [11] bunday tajribalarni boshqarish uchun mo'ljallangan.
Birlamchi ma'lumotni yig'ish bosqichida xatolar ulushi qo'llaniladigan sekvensiya usuliga, yorliq turiga, ishlatiladigan fermentga, avtomatik yoki qo'lda sekvenserga bog'liq va DNK segmentiga va eksperimentatorning tajribasiga qarab o'zgaradi. . Sekvensiyaning aniqligi bilan bog'liq holda tadqiqotchi oldida turgan maqsad alohida ahamiyatga ega. Shunday qilib, EST deb ataladigan cDNK molekulalarining qisqa bo'limlarini ketma-ketlikda va gen identifikatorlari sifatida xizmat qilganda, bunday ma'lumotlarning ishonchliligiga jiddiy ahamiyat berilmaydi va ba'zi hisob-kitoblarga ko'ra, ular 1% dan ortiq xatolarni o'z ichiga olishi mumkin, bu boshqa hollarda mutlaqo qabul qilinishi mumkin emas. .
matritsaning boshida va oxirida joylashgan hududlarda to'plangan . Shunday qilib, odatda, ma'lum miqdordagi xatolar shablonning dastlabki ikki o'nlab nukleotidlari uchun xos bo'lib, 400-500 nukleotiddan keyin sezilarli darajada oshadi. AQShning 80 ta turli laboratoriyalari tomonidan har xil turdagi lyuminestsent yorliqlar yordamida nukleotidlar ketma-ketligini aniqlashning aniqligi bo'yicha maxsus tadqiqot o'tkazildi, ularga bir xil DNK namunalari berildi. Keyingi tahlillar shuni ko'rsatdiki, laboratoriyalarni ketma-ketlik aniqligiga ko'ra uch guruhga bo'lish mumkin [31].
Birinchi guruh DNKni 100-500 nukleotid oralig'ida deyarli 100% aniqlik bilan ketma-ketlashtirishga muvaffaq bo'ldi; 500 dan 600 gacha nukleotidlarni aniqlashning aniqligi sezilarli darajada kamaydi. Ikkinchi guruh uchun deyarli 100% aniqlik faqat 100-400 oralig'ida mavjud bo'lsa, uchinchi guruh faqat 10Q-300 nukleotidlar oralig'ida 92-100% aniqlikni ta'minlay oldi. Biroq, yakuniy bosqichda DNK ketma-ketligining aniqligi kamida 99,95% bo'lishi kerak, bu 10 000 nukleotid uchun 5 ta xatoga to'g'ri keladi. Shuni ta'kidlash kerakki, 99,99% yoki 10 000 nukleotidga 1 ta xato yaqinda erishilishi mumkin bo'lgan standart hisoblanadi. Genomik loyihalarda qo'llaniladigan tasodifiy yondashuv strategiyalari va buning natijasida erishilgan genomning 7-8 marta qoplanishi, ortiqcha ma'lumotlarga qo'shimcha ravishda, bir xil bo'limlarni bir necha marta "o'qish" shaklida muhim afzalliklarni ta'minlaydi (va, bundan tashqari, DNKning ikkala zanjiri bo'ylab), bu olingan natijalarning zarur ishonchliligiga olib keladi [32].
Zamonaviy tadqiqotchilar maxsus algoritm tufayli o'qish ramkasini buzadigan nukleotidlarni kiritish va yo'q qilish shaklida umumiy "indel" belgisini olgan kodlash mintaqalarida ma'lum turdagi xatolarni aniqlay oladigan va tuzatadigan dasturni ishlab chiqdilar. . Yaqinda yaratilgan PHRED dasturi birlamchi ma'lumotlarni yig'ish bosqichida ma'lum nukleotidlarni "o'qish"dagi o'ziga xos "xatolar" ni bashorat qilish imkonini beradi, bu esa uni yirik loyihalar uchun juda qulay qiladi. Shunday qilib, ushbu dastur yordamida genom sekvensiyasi bo'yicha loyihalarni amalga oshiruvchi 6 ta Amerika laboratoriyalarining birlamchi ma'lumotlari tahlili o'tkazildi. Natijada, ma'lum nukleotidlarni aniqlashda ushbu dastur tomonidan bashorat qilingan "xatolar" asosan haqiqiylariga to'g'ri kelganligi ma'lum bo'ldi, ammo adolat uchun shuni ta'kidlash kerakki, ikkinchisi hali ham bir oz kamroq edi. Ilgari, birlamchi DNK sekvensiyasi materialida yuzaga kelishi mumkin bo'lgan xatolarni bashorat qilishga qaratilgan shunga o'xshash dastur boshqa mualliflar tomonidan taklif qilingan.
Shunday qilib, DNK ketma-ketligining ishonchliligi masalasi ochiqligicha qolayotganini ko'rish mumkin. Tadqiqotchilar ushbu yo'nalishda sezilarli yutuqlarga erishganiga qaramay, aniqroq ishonchlilik dasturlarini ishlab chiqish hozirda davom etmoqda.

2.2. DNK ketma-ketligini aniqlashning eng yangi usullari

Uchinchi avlod ketma-ketligi (NNGS) usullari oldingi usullarning asosiy kamchiliklarini tuzatish uchun mo'ljallangan, xususan: murakkab namuna tayyorlash, bitta o'qishning qisqa uzunligi, tahlil qilingan har bir DNK fragmentidan signalni kuchaytirish zarurati, uzoq tsikl vaqtlari, va ko'plab takroriy ketma-ketliklarga bo'lgan ehtiyoj.

Yagona molekulalar ketma-ketligi texnologiyasi.
2008 yilda Helicos BioSciences o'z qurilmasida birinchi marta yagona DNK fragmentlarining nukleotidlar ketma-ketligini dastlabki kuchaytirmasdan ajratish usulini namoyish etdi [12]. Ushbu texnologiya - "tSMS" (haqiqiy Single Molecule Sequencing) kompaniya tomonidan ishlab chiqilgan substrat yuzasining ultra past fonida porlashi, reagentlarni sekvensiyalash va vizualizatsiya usuli tufayli juda yuqori sezuvchanlikka ega . Yangi usulga ko'ra, DNK kichik bo'laklarga bo'linadi va oxirida yorug'lik belgisi bo'lgan adenin molekulalarining uzoq ketma-ketligi maxsus ferment yordamida har bir fragmentning bir uchiga biriktiriladi. Timin molekulalarining ketma-ketligi har bir fragmentni alohida tahlil qilish imkonini beruvchi masofada maxsus substratga biriktirilgan. Namunalar substratga yoyilganda, uning yuzasida biriktirilgan timindan olingan ketma-ketliklar DNK fragmentlari bilan bog'liq bo'lgan adenin ketma-ketligiga qo'shimcha ravishda bog'lanadi. Keyinchalik, substrat skanerdan o'tkaziladi va DNK molekulasining har bir biriktirilgan segmentining joylashuvi teglar porlashi bilan topiladi. Keyin yorliq olib tashlanadi va to'rt turdagi etiketli nukleotidlarning har biri navbatma-navbat qo'shiladi, bog'lanish joylarida luminesans aniqlanadi, shundan so'ng biriktirilgan nukleotidlardan teglar olib tashlanadi va etiketli nukleotidlarning keyingi turi kiritiladi. Shunday qilib, nukleotid bilan nukleotid, ketma-ketlik komplementar DNK zanjiri bo'ylab yakunlanadi, bu uzunligi 55 bp gacha bo'lgan qismlarni ketma-ketlashtirishga imkon beradi.
Kompyuter har bir reaksiyadan keyin millionlab miltillashlarning holatini qayd qiladi. Bunday tizim kuniga milliardlab nukleotidlarni 99,999% gacha bo'lgan aniqlik bilan 20 marta o'xshashlik bilan o'qishni ta'minlaydi [12]. Biroq, ushbu texnologiyaga asoslangan qurilma ("Heli Scope") juda qimmat bo'lib chiqdi, nukleotidlar ketma-ketligini qisqa o'qish uzunligida reagentlarning iste'moli yuqori. 2012 yil noyabr oyida Helicos Biosience bankrot deb e'lon qilindi va o'z faoliyatini to'xtatdi.
Yagona molekulalarning real vaqtda ketma-ketligi.
2009 yilda Pacific Biosciences tomonidan ishlab chiqilgan Single Molecule RealTime (SMRT) sekvensiyasi usuli joriy etildi. Ushbu kompaniyaning sekvenseri har bir DNK fragmentini o'nlab marta "o'qish" imkonini beradi, shu bilan birga uning nukleotidlar ketma-ketligini aniqlashning konsensus aniqligi 99,9% ga etadi. Ushbu usulning texnologiyasi uzunligi 10 000 bp gacha bo'lgan bir zanjirli DNK fragmentlarini real vaqt rejimida ketma-ketlashtirishga asoslangan. va boshqalar DNK polimeraza yordamida [31]. DNK polimerazasining yagona molekulalari shaffof oynada joylashgan maxsus hujayralar tubiga biriktirilgan. Ruxsat etilgan ferment atrofidagi maydon maxsus lazer bilan yoritiladi.
Har bir hujayraga to'rt turdagi nukleotidlar qo'shiladi, ular turli yorug'lik belgilari bilan belgilanadi. Lazer tahlil qiladigan maydon shunchalik kichikki, yorliqli nukleotidlar uning yorug'ligini qurilma tomonidan qayd etilishi uchun unchalik uzoq vaqt qolmaydi. Agar DNK fragmenti polimeraza tomonidan saqlanib qolsa, uning qo'shimcha zanjiri tugashi paytida har bir biriktirilgan nukleotidning signali skanerlangan maydonda o'rnatiladi. Keyingi nukleotid qo'shilgandan so'ng, uning yorug'lik belgisi olib tashlanadi.
Ushbu texnologiyaga asoslangan PacBio RS qurilmasi yuqori ichki xarajatga ega, lekin ayni paytda tez namuna tayyorlash, yuqori tezlik va DNK sekvensiyasining arzonligi.
Nanoporlar orqali tartiblash.
Tez DNK sekvensiyasi uchun nanopora massivlaridan foydalanish imkoniyati Yevropa va AQShning ilmiy markazlarida 15 yildan ortiq vaqt davomida o‘rganilib kelinmoqda. Nanoporlar biologik bo'lishi mumkin bo'lgan nanoholesdir, masalan, lipid ikki qatlamli membranadagi teshik hosil qiluvchi oqsil yoki qattiq holat (kremniy nitridi yoki grafen kabi sintetik materiallardan tayyorlangan). Nanopor sekvensiyasi nukleotid asoslari orasidagi jismoniy farqni DNK molekulasida aniqlash uchun ishlatadi. Bir necha ming nukleotid uzunlikdagi manfiy zaryadlangan bir zanjirli DNK fragmenti diametri 2-5 nm bo'lgan membranadagi teshikdan tortilib, nukleotidlar navbat bilan o'tib ketayotganda elektrodlar yordamida teshiklardagi elektr o'tkazuvchanligining o'zgarishi qayd etiladi. Har bir turdagi bazalar ularning orasidagi o'lchamdagi farq tufayli elektr o'tkazuvchanligining o'ziga xos o'zgarishiga to'g'ri keladi, shuning uchun ular teshikni katta yoki kamroq darajada va turli muddatlarda yopadi. Shunga ko'ra, elektr o'tkazuvchanligi ham o'zgaradi. Biroq, ushbu texnologiyani amalga oshirish uchun kamida ikkita jiddiy texnik to'siq mavjud: nanoporlar orqali DNK harakatini boshqarish uchun ishonchli yondashuvning yo'qligi va etarlicha kichik sensorlarni yaratishdagi texnik qiyinchiliklar [12].
Bir versiyada, DNK bo'lagining nanoporlar orqali o'tishini sekinlashtirish uchun uning uchiga magnit mikrosfera biriktirilgan. Molekulani mikrosfera tomonidan tortib olish uchun magnit ishlatiladi, kiritilgan elektr maydoni bir vaqtning o'zida DNKni teskari yo'nalishda tortib, uni nanoporaning teshigiga tortadi. Shunday qilib, nanoporlar orqali DNK harakati tezligi ushbu kuchlarning muvozanati bilan belgilanadi.
Shu bilan birga, nukleotidlar ketma-ketligini o'qish standart tartiblash usullariga qaraganda yuz minglab marta tezroq sodir bo'ladi. Bunday holda, inson genomining ketma-ketligi atigi 20 soat davom etadi, chunki shablonni bir necha marta kuchaytirish talab qilinmaydi [11].IBM tomonidan taklif qilingan texnologiyaning yana bir varianti ko'p qatlamli (dielektrik-metall) membranadan foydalanadigan DNK tranzistoridir. . Membrananing manzilli metall qatlamlari orasidagi kuchlanishning o'zgarishi nanoporlar ichida elektr maydonlarini hosil qiladi, ularni tsiklik ravishda yoqish va o'chirish orqali DNKni nanoporlar bo'ylab har bir tsiklda bitta nukleotid qadami bilan siljitish mumkin. datchiklar bilan to'rtta mumkin bo'lgan bazalar.
DNK sekvensiyasini amalga oshirishning boshqa variantlari ham mavjud, ammo hozirda nanopor sekvenserlarini tadqiq qilish va ishlab chiqish rivojlanish bosqichida.
Yaqinda Oxford Nanopore Technologies kompaniyasi o'zining tijoriy apparat ta'minoti uchun nanoporga asoslangan sekvensiya texnologiyasini amalda yakunlaganini e'lon qildi. Ushbu kompaniyaning "GridION" va "MinION" nomlari ostida birinchi nano o'lchovli sekvenserlari chiqarilishi 2015 yilda bo'lishi mumkin. Ushbu texnologiyaning xatolik darajasi 0,1-1% ni tashkil qiladi va bitta DNK fragmentlarini o'qish uzunligiga etadi. ko'p o'n minglab nukleotidlar. Bu DNK ketma-ketligi sohasidagi yana bir yutuq bo'ladi, chunki bu jarayonga sarflangan vaqt va uning narxi kattalik darajasida kamayadi.
Bugungi kunga kelib, uchinchi avlod sekvensiyasining amalda qo'llanilgan usullaridan faqat SMRT (Tinch okeani biosciences) platformasi ishlamoqda. Ehtimol, bir necha yil ichida nanoporlar orqali DNK sekvensiyasi usuli dominant bo'lib, ikkinchi avlodning amalda qo'llaniladigan usullarini almashtiradi [12].
Shunday qilib, mavjud ketma-ketlik usullari DNK nukleotidlari ketma-ketligini aniqlash bilan bog'liq bo'lgan turli xil vazifalarni bajarishga qaratilgan. Eng so'nggi ketma-ketlik usullari tez orada o'zlarining o'tmishdoshlarini almashtirishi mumkin, shu jumladan klassik DNK sekvensiyasi usullari uchun amaliy muqobil bo'ladi.
deoksiribonuklein kislotaning ketma-ketligi


Xulosa
Nuklein kislotalar ketma-ketligi hozirgi vaqtda molekulyar biologiyada odatiy usulga aylandi. Genetik kodni bilish tufayli potentsial oqsillarni kodlaydigan nukleotidlar ketma-ketligi hududlarini aniqlash mumkin bo'ldi. Ushbu manba nukleotidlar ketma-ketligining funktsional tuzilishi haqida asosiy ma'lumotlarni beradi. Sekvensiya - bu barcha xromosomalarning to'liq nukleotidlar ketma-ketligini, har qanday genomning, har qanday organizmning butun DNKsini aniqlash imkonini beruvchi usullar, tamoyillar va texnologiyalarning umumiy nomi. Bu usul har qanday genning nukleotidlar ketma-ketligini aniqlash imkonini beradi, bu esa ularni sintez qilish imkonini beradi.
Zamonaviy DNK tartiblash usullarining barcha mavjud tamoyillari va analitik imkoniyatlari shartli tasnifga ega. Ularni uchta asosiy turga bo'lish mumkin: klassik - kapillyar elektroforez va pirosekvensiya yordamida ketma-ketlik; yangi --yuqori o'tkazuvchanlikdagi pirosequencing, siklik ligatsiya va yarimo'tkazgichlar ketma-ketligi; floresan yorliqli prekursorlar yordamida molekulyar klasterlar bo'yicha ketma-ketlik; eng so'nggilari - bitta molekula ketma-ketligi texnologiyasi, real vaqt rejimida bitta molekula ketma-ketligi va nanopora ketma-ketligi. Bizning tadqiqotimizda biz ikkita eng mashhur ketma-ketlik usullarini ko'rib chiqdik: Maxam-Gilbert va Segner usullari. Shuningdek, biz eng so'nggi ketma-ketlik usullari va texnologiyalarining xususiyatlarini muhokama qilamiz.
Maxam-Gilbert usuli va Sanger usuli bir xil printsipga asoslanadi. Birinchisi asoslarning tabiatiga ko'ra o'ziga xos DNK parchalanishidan foydalanadi, ikkinchisi 4 nukleotidning istalgan birida tugaydigan statistik DNK sintezidan foydalanadi. Shunday qilib, ikkala usulning asosi to'rt nukleotidning har birida tugaydigan DNK bo'laklarining to'liq (statistik) to'plamini olishdir .
Kimyoviy usul (Maksam-Gilbert usuli) o'rganilayotgan DNK unchalik katta bo'lmaganda (200-500 zveno) foydalanish osonroq. Agar biz yuqori molekulyar og'irlikdagi DNKning ketma-ketligi haqida gapiradigan bo'lsak, alohida bo'laklarni izolyatsiya qilish bilan cheklovchi fermentni ajratish protsedurasini kiritmaslik uchun polimeraza nusxalash usulidan (Sanger usuli) foydalanish yaxshiroqdir. Uzun bir zanjirli DNKni (masalan, bakteriofaglar) fermentativ ketma-ketlikda sintez qilish uchun hozirda ko'p vaqt va mehnat talab etmaydigan urug'lik oligonukleotidlari to'plamidan foydalanish mumkin. Ikki zanjirli yuqori polimerli DNK uchun eng qulay usul universal primer yordamida (ular ko'plab kompaniyalar tomonidan ishlab chiqariladi) ko'r-ko'rona fermentativ ketma-ketlik va kompyuter yordamida ma'lumotlarni qayta ishlashdir. Kimyoviy usul ham qo'llanilishi mumkin, ammo bu holda vektordan o'rganilgan DNK bo'laklarini aksizizatsiya qilish kerak va bu butun protsedurani murakkablashtiradi.
So'nggi ketma-ketlik usullariga kelsak, shuni ta'kidlash kerakki, ular oldingi usullarning asosiy kamchiliklarini tuzatish uchun mo'ljallangan, xususan: murakkab namuna tayyorlash, bitta o'qishning qisqa uzunligi, tahlil qilingan har bir DNK fragmentidan signalni kuchaytirish zarurati. , uzoq sikl vaqti va ko'p takroriy ketma-ketlik zarurati.
Shunday qilib, mavjud ketma-ketlik usullari DNK nukleotidlari ketma-ketligini aniqlash bilan bog'liq bo'lgan turli xil vazifalarni bajarishga qaratilgan. Eng so'nggi ketma-ketlik usullari tez orada o'zlarining o'tmishdoshlarini almashtirishi mumkin, shu jumladan klassik DNK sekvensiyasi usullari uchun amaliy muqobil bo'ladi.