Drosophila melonogaster genomidagi mutatsion kontekslar tahlili

Drosophila melonogaster genomidagi mutatsion kontekslar tahlili

Drosophila melanogasterdagi yangi spontan mutatsiyalarning tezligi va xususiyatlarini o'rtacha 262 avlod davomida yaqin qarindoshlar o'rtasidagi o'zaro bog'lanish orqali saqlanib qolgan uchta mutatsiya to'planishi (MA) chizig'ini sintez bo'yicha butun genom sekvensiyasini amalga oshirish orqali xulosa qildik. Biz har bir MA chizig'ini D. melanogaster mos yozuvlar genom ketma-ketligiga moslashtirish orqali yangi mutatsiyalar mavjudligini sinab ko'rdik va keyin bu moslashuvlarni asos bo'yicha taqqosladik.

Biz empirik tarzda aniqladikki, bitta nukleotid mutatsiyasini aniq chaqirish uchun har bir satr ichida kamida beshta o'qish kerak. Biz jami 174 ta bitta nukleotidli mutatsiyani xaritaga tushirdik, bu bitta nukleotid mutatsiya tezligini har bir nasl uchun sayt uchun 3,5 × 10 -9 ni tashkil qildi. Sanger ketma-ketligi bilan tekshirilgan ushbu mutatsiyalarning 40 ta tasodifiy namunasida noto'g'ri musbatlar yo'q edi. MA chiziqlaridagi mutatsiyalar sonining o'zgarishi kichik va ahamiyatsiz edi. O'tish va transversiya mutatsiyalari soni mos ravishda 86 va 88 ni tashkil etdi, bu o'tish mutatsiyasining tezligi transversiya tezligining 2x ga yaqinligini bildiradi. Biz A yoki T → G yoki C mutatsiyalari kabi G yoki C → A yoki T ni 1,5 marta kuzatdik, bu G yoki C → A yoki T mutatsiyasining tezligi A yoki T → G yoki C mutatsiyasining 2 × ga yaqin ekanligini anglatadi. . Shuning uchun genomning asosiy tarkibi faqat mutatsiya bilan aniqlangan muvozanatda emas. Mutatsion muvozanatda bashorat qilingan G + C tarkibi (33%), ko'chma element qoldiqlarida kuzatilganga o'xshaydi. Eng yaqin qo'shni mutatsion kontekstga bog'liqlik ahamiyatsiz bo'lib, bu Drosophilada zaif hodisa ekanligini ko'rsatadi . Shuningdek, biz transkripsiyalangan va transkripsiyalanmagan hududlar o'rtasidagi mutatsiya tezligida sezilarli bo'lmagan farqlarni ko'rdik, bu esa har qanday transkripsiya bilan bog'langan tuzatish jarayoni zaif ekanligini anglatadi. Tasdiqlangan yettita qisqa indel mutatsiyadan oltitasi oʻchirish boʻlib, Drosophilada mavjud deb taxmin qilingan oʻchirish tarafkashligiga mos keladi .
Spontan mutatsiyalarning tezligi va xususiyatlari evolyutsion biologiya va molekulyar evolyutsiyaning ko'plab savollari uchun muhimdir. Misol uchun, neytrallik sharoitida molekulyar evolyutsiya tezligi mutatsiya tezligiga teng bo'lishi kutiladi, shuning uchun turlar orasidagi molekulyar divergensiya soatga o'xshash molekulyar evolyutsiyani qabul qilib, turlarning ajralib chiqish vaqtlarini aniqlash uchun ishlatilishi mumkin. Aksincha, turlar orasidagi jim joylarda molekulyar farqlanish tezligi mutatsiya tezligini baholash uchun ishlatilishi mumkin. Biroq, bu betaraflik farazini talab qiladi va turning paydo bo'lish vaqti va ajralish sanalari uchun qiymatlar ham kerak.
Mutatsion to‘planish (MA) tajribalari yangi mutatsiyali o‘zgaruvchanlikni bevosita o‘rganishning muqobil usuli hisoblanadi. MA liniyalari homozigot progenitor shtammini bo'linish orqali boshlanadi , keyin o'z-o'zidan mutatsiyalar to'planishiga imkon beradi, ko'pincha o'nlab avlodlar uchun. Chiziqlar tabiiy tanlanish samaradorligini pasaytiradigan yaqin qarindoshlik (odatda to'liq juft juftlashish yoki o'z-o'zidan o'tish) bilan saqlanadi, shuning uchun mutatsiyalarni aniqlash tezligi mutatsiya tezligiga yaqin bo'lishi kutilmoqda. MA tajribalarini tahlil qilishning klassik usuli MA liniyalarining fenotipik qiymatlari ma'lumotlaridan foydalanadi. Misol uchun, genom boshiga mutatsiya tezligi mutatsiyalar to'planishi t avlodlar ( Bateman 1959 ; Mukai 1964 ) uchun fitnes uchun o'rtacha va o'rtasidagi-MA liniyasi o'zgarishlar asosida taxmin qilinishi mumkin . Biroq, ma'lumki, bu usul genomik mutatsiya tezligini kam baholaydi ( Linch va Walsh 1998 ). Yangi mutatsiyalarni to'g'ridan-to'g'ri o'rganish uchun endi mutatsiyalarni aniqlash texnologiyasi yoki sekvensiyadan foydalangan holda MA liniyalari genomlarida paydo bo'ladigan mutatsiyalarni izlash mumkin. Mukay va Kokerxem (1977) Drosophila melanogaster MA liniyalarida yangi allozim variantlarini izlagan har bir sayt uchun mutatsiya tezligining MA asosidagi molekulyar bahosini ishlab chiqdi . Biroq, faqat uchta tarmoqli-morf varianti topildi, shuning uchun mutatsiya tezligini baholash aniq emas edi. Yaqinda MA liniyalari genomlarining qismlarini yangi mutatsiyalar uchun skanerlash texnologiyasi Caenorhabditis elegans ( Denver va boshq. 2000 , 2004 ) va D. melanogasterning ( Haag-Liautard va boshq. 2007 , 2008) mitoxondrial va yadro genomlariga qo'llanildi . Biroq, har bir yadro genomining juda kichik qismlari skanerdan o'tkazildi va nisbatan kam mutatsiyalar aniqlandi. Yangi yuqori o'tkazuvchanlik sekvensiyasi texnologiyalarining paydo bo'lishi ko'plab organizmlar, shu jumladan murakkab eukaryotlar uchun deyarli to'liq genom ketma-ketligini olish imkonini beradi. Keyin yangi mutatsiyalarni MA chizig'i genomlari ketma-ketligini taqqoslash orqali aniqlash mumkin. Misol uchun, ov miltig'i pyrosequencing so'nggi paytlarda xamirturush MA liniyalari genom ketma-ketligini olish uchun ishlatilgan ( Linch va boshq. 2008 ) va bu har bir nukleotid mutatsiya tezligi va mutatsiya spektrini baholash imkonini berdi.
o'rtacha 262 avlod o'z-o'zidan mutatsiyalar to'planishi ( Fernandez va López-Fanjul 1996 ) sodir bo'lgan uchta D. melanogaster MA liniyasining ov miltig'i ketma-ketligi haqida xabar beramiz . MA liniyalari to'g'ridan-to'g'ri ketma-ketlik bilan birgalikda yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasini (DHPLC) denaturatsiya qilish orqali mutatsiyani aniqlash yordamida biz ilgari o'rgangan chiziqlarning bir qismidir ( Haag-Liautard va boshq. 2007 , 2008) . Oldingi tadqiqotimizda har bir baza juftiga mutatsiya tezligini taxmin qilganimiz turlar orasidagi jim bo'lgan joyning farqlanishiga asoslangan taxmindan sezilarli darajada yuqori edi va yadro genomi bo'yicha zararli mutatsiya tezligi (U) har bir avlod uchun bir hodisadan oshdi . Bu erda biz Illumina (sobiq Solexa) sekvensiyasi-sintezi ( Bentley va boshq. 2008 ) dan har bir satrda sayt uchun o'rtacha 11 o'qishni qamrab olish chuqurligidan foydalanamiz. Biz har bir MA qatoridan ketma-ket o'qishlarni D. melanogaster mos yozuvlar genomiga bir oz boshqacha algoritmlardan foydalanadigan ikkita aligner - MAQ va Novoalign yordamida tekislaymiz. MAQ, har bir o'qishning dastlabki 28 ta bazasida ikki yoki uchta mos kelmasligiga imkon beruvchi noaniq hizalanishni amalga oshiradi ( Li va boshq. 2008 ). Bu erda bo'lgani kabi, juftlashtirilgan o'qishlarsiz, faqat bitta nukleotidli mutatsiyalarni MAQ bilan xaritalash mumkin. Novoalign affin bo'shliq jazolari bilan ko'proq hisoblash intensiv Needleman-Wunsch algoritmidan foydalangan holda ketma-ketlikni o'qishni tekislaydi, shuning uchun kiritish-o'chirish (indel) mutatsiyalarini xaritalash imkoniyati mavjud. Genom moslashuvidan kelib chiqib, biz genom moslashuvini asos bo'yicha taqqoslash orqali mutatsiyalar deb ataymiz. Biz bitta nukleotidli mutatsiyalar va indel mutatsiyalarning kichik to'plamini PCR mahsulotlarini Sanger ketma-ketligi bilan tekshiramiz. Shuningdek, biz bitta nukleotidli mutatsiyalarning ko'pchiligini dastlabki mutatsiya chaqiruvida ishlatilmaydigan past sifatli o'qishlarni tekshirish orqali tekshiramiz. Biz genomning oldingi tadqiqotimizga qaraganda ancha yuqori qismini skanerlaymiz va bizning ma'lumotlar to'plamimiz mutatsiya tezligidagi qatorlar orasidagi o'zgarishlarni sinab ko'rish, o'tishni aniq baholash: transversiya nisbati va xromosoma va kontekst uchun testlarni o'tkazishga imkon beradigan darajada katta. -mutatsiya tezligining o'ziga xos o'zgarishi. Illumina o'qishlari orasida tasodifiy bo'lmagan xatolar uchun aniq dalillarni ham topamiz.
O'tish:
Natijalar
D. melanogaster genomiga havolani o'qiydi.
Uzunlikdagi 36 yoki 50 ta asosli ketma-ketlik o'qishlari MAQ aligner ( Li va boshq. 2008 ) yordamida mos yozuvlar D. melanogaster genom versiyasi 5.9 bilan moslashtirildi, MAQ-3 hizalamalarini yaratish uchun har bir o'qish uchun uchta mos kelmaslik imkonini berdi. Baza uchun o'rtacha o'qish chuqurligi MAQ har qanday sifatda moslasha olganligini o'qiydi 11,1 va bu ketma-ket uchta qatorda juda mos keladi ( 1-jadval ). Taxminan 10% asosiy o'qishlar har qanday sifat chegarasida moslashtirilmagan. MAQ-3 tekislashlari bo'yicha har bir bazaga o'qishlar sonining taqsimlanishi Qo'shimcha rasmda ko'rsatilgan. O'qish chuqurligi 0 bo'lgan joylar bundan mustasno, o'qish chuqurligining o'zgarishi o'rtacha chuqurlikdan o'rtacha 2,2 × yuqori. Shu sababli, Puasson taqsimoti ostida kutilganidan ko'ra chuqurlikda sezilarli darajada ko'proq o'zgarishlar mavjud. MAQ Illumina-dan olingan asosiy sifat va har bir o'qilgan baza uchun xaritalash sifati haqida xabar beradi. Illumina o'qishlaridagi asosiy sifatlar phred ballariga o'xshashdir ( Ewing and Green 1998 ) va asosiy qo'ng'iroqning xato bo'lish ehtimolini ko'rsatadi. Xaritalash sifatlari butun genom ma'lumotnomasida topilgan bir xil sifatdagi mosliklar sonidan kelib chiqadi va o'qish haqiqatda ko'rsatilgan pozitsiyaga mos kelishi ehtimolini ko'rsatadi. Xaritalash sifatining past ko'rsatkichlari genomda o'qishni joylashtirish mumkin bo'lgan 1 ta sayt mavjudligini ko'rsatadi. Tahlil qilingan barcha holatlarda biz yuqori xaritalash sifatini (ya'ni, ≥40) ishlatdik va yuqori asosiy sifat ( b20 ; asosiy sifat ≥ 20) va past asosiy sifat ( b5 ; asosiy sifat ≥ 5) MAQ-3 hizalamalarini yaratdik. Ular uchun o'rtacha o'qish chuqurligi mos ravishda 8,1 va 9,9 ni tashkil qiladi ( 1-jadval ). Uchta ketma-ketlikning konsensusi saytlarning 0,27% da D. melanogaster mos yozuvlar ketma-ketligidan farq qildi.
1-jadval.
Barcha Illumina o'qishlari uchun bazalarning umumiy soni va o'rtacha qamrov chuqurligi va turli xil asosiy sifat chegaralaridan foydalanadigan ikkita MAQ-3 genomini moslashtirish



O'rtacha chuqurlik nolga teng bo'lgan joylarni o'z ichiga olmaydi.
MAQ filtrlashdan so'ng ketma-ketlik xatosi tezligining empirik bahosini olish uchun biz har bir satrdagi saytdagi eng tez-tez uchraydigan nukleotid bilan mos kelmaydigan saytdagi o'qishlar ulushini hisobladik. Biz ushbu tahlilni ≥5 o'qish bo'lgan saytlar bilan chekladik, chunki bu yuqorida biz mutatsiyalarni yuqori ishonch bilan chaqirish mumkinligini empirik ravishda aniqlagan chegaradir (pastga qarang). MAQ-3 b20 va b5 hizalamalari uchun o'qiladigan har bir bazaning taxminiy xatolik darajasi mos ravishda 1,2 × 10 -3 va 1,0 × 10 -2 ni tashkil qiladi . Shuning uchun ko'plab xatolar MAQ tomonidan ma'lumotlardan filtrlanadi, ayniqsa yuqori asosiy sifatda, chunki asbobdan ketma-ketlik xatosi darajasi ushbu qiymatlardan yuqori. O'z-o'zidan paydo bo'ladigan mutatsiyalar ( Haag-Liautard va boshq. 2007 ) va har bir MA chizig'idagi past samarali populyatsiya soni (ya'ni, bu holda ikkita) tufayli, chiziq ichidagi heterozigotlik bu xatolik darajasini baholashga ozgina hissa qo'shadi. Bu mutatsiyalarning juda qisqa davom etish muddatiga olib keladi.
Yadro genomining yagona nukleotidli mutatsiyalarini chaqirish
Nomzod mutatsiyalarni aniqlash uchun biz uchta MA liniyasi MAQ-3 b20 yadro genomini moslashtirishni sayt bo'yicha taqqosladik. Agar satrlar orasidagi o'qishlarda farq bo'lsa va har bir satr ichidagi barcha o'qishlar to'liq yoki to'liq mos kelishiga yaqin bo'lsa, nomzod mutatsiyasi chaqiriladi (Usullarga qarang). Biz nomzod mutatsiyalar sonini va uchta MA chizig'i to'g'ri konsensus nukleotidiga ega bo'lgan saytlar sonini hisobladik (Usullarda aniqlanganidek) va uchta chiziq orasida saytdagi minimal o'qish chuqurligini qayd etdik. Har bir sayt uchun mutatsiya tezligining taxminiy qiymati

Bu erda n - MA qatorlar soni (ya'ni, 3), t - mutatsiyalar to'planishining o'rtacha avlodlari soni (ya'ni, 262). Minimal o'qish chuqurligi funktsiyasi sifatida mutatsiya tezligini baholash 2-jadvalda ko'rsatilgan . Mutatsiyaning taxminiy tezligi o'qish chuqurligi bilan salbiy bog'liq bo'lib, chiziqlar orasidagi farqlar soni ketma-ketlik yoki xaritalash xatolari tufayli ko'paytirilishini aniq ko'rsatmoqda. Biroq, 5 va undan yuqori chuqurlikdagi o'qish chuqurligi uchun mutatsiya tezligini baholash barqarorlashadi: o'qish chuqurligi 4 va ≥5 uchun mutatsiya tezligi sezilarli darajada farq qiladi (Fisherning aniq testi; P = 0,005), 5 va ≥6 chuqurlik uchun esa stavkalar sezilarli darajada farq qilmaydi ( P = 0,19). Agar ketma-ketlik yoki xaritalash xatoliklari tasodifiy ravishda har bir o‘qish uchun baza boshiga 1,2 × 10 −3 tezlikda sodir bo‘ladi deb faraz qilsak (yuqorida MAQ-3 b20 moslashuvi uchun taxmin qilinganidek), minimal o‘qish chuqurligi 2 ga teng bo‘lgan saytlar uchun xatoliklarning kutilayotgan soni 10,2 ni tashkil qiladi. (ya'ni, 7,1 × 10 6 [bunday saytlar soni, 2-jadval ] × [1,2 × 10 −3 ] 2 ), kuzatilgan raqam esa 448. Xuddi shunday, minimal o'qish chuqurligi bo'lgan saytlar uchun kutilayotgan xatolar soni 3 - 0,02, kuzatilgan raqam esa 57. Kuzatilgan raqamlarning kutilganidan oshib ketishi tasodifiy bo'lmagan ketma-ketlik yoki xaritalash xatolarining hissasi bo'lishi kerakligini ko'rsatadi, ya'ni ba'zi saytlarda nukleotidlarni noto'g'ri chaqirish ehtimoli boshqalarga qaraganda ancha yuqori. Minimal o'qish chuqurligi ≥5 bo'lgan saytlardan foydalangan holda, aniqlangan mutatsiyalarning umumiy soni 174 tani tashkil qiladi va har bir sayt uchun o'rtacha mutatsiya tezligining taxmini 3,07 × 10 -9 ni tashkil qiladi .
2-jadval.
Aniqlangan yagona asosli nomzod mutatsiyalar soni, saytlar soni va uchta chiziq MAQ-3 b20 genomlari moslashuvida haqiqiy nukleotidga ega bo'lgan saytlar uchun taxminiy mutatsiya tezligi



Chuqurlik - uchta MA chizig'i orasidagi har bir saytdagi minimal o'qish chuqurligi.
Yuqoridagi mutatsiyani chaqirish algoritmi noto'g'ri negativlarni keltirib chiqarishi va mutatsiya tezligini past baholashi mumkin, chunki mutatsiyalar deyarli har doim mos yozuvlar ketma-ketligiga nomuvofiqlik bilan bog'liq, shuning uchun mutatsiyalarni o'z ichiga olgan o'qishlar yuqori sifatda moslashish ehtimoli kamroq. Bu bizning ma'lumotlarimizda yaqqol ko'rinib turibdi, chunki mutantlar uchun o'rtacha o'qish chuqurligi ≥5 chuqurlikda mutatsiya deb ataladigan joylarda yovvoyi turga qaraganda kamroq ( 3-jadval ). Shuning uchun mutatsiyalarni o'z ichiga olgan saytlar mutatsiyani qabul qilish uchun biz belgilagan besh o'qish chegarasidan pastga tushish ehtimoli yuqori bo'ladi. Biz mutantlar va yovvoyi turlar o'rtasidagi o'qish chuqurligidagi farqdan ma'lumotlarni qayta namuna olish orqali etishmayotgan mutatsiyalarni tuzatish uchun foydalandik (Usullarga qarang). Bu mutatsiyani chaqirish algoritmi MAQ-3 hizalamalaridagi mutatsiyalarning taxminan 13 foizini o'tkazib yuborganligini taxmin qiladi. To'g'rilangan yagona bazaviy mutatsiya tezligi keyin 3,46 × 10 -9 (taxminan 95% ishonch chegaralari 2,96 × 10 -9 va 4,01 × 10 -9 ). Mutatsiyalarning biroz yuqori qismi MAQ hizalamalarida o'tkazib yuborilishi taxmin qilinmoqda, bu har bir o'qish uchun ikkita nomuvofiqlikni ta'minlaydi (MAQ-2; 3-jadval ), lekin tuzatilgan mutatsiya tezligini baholash juda o'xshash. Muqobil alignerdan (Novoalign) foydalanib, ko'proq mutatsiyalar chaqiriladi va kamroq o'tkazib yuborilishi taxmin qilinadi va tuzatilgan mutatsiya tezligi taxmini ham MAQ dan (3-jadval) mos keladi .
3-jadval.
Mutatsiya ≥5 o‘qish chuqurligida chaqirilgan joylarda mutantlar va yovvoyi turlar uchun chuqurliklarni o‘qing, o‘tkazib yuborilgan mutatsiyalarning taxminiy ulushi va uchta genom moslashuvi tahlilidan olingan tuzatilmagan va tuzatilgan mutatsiya tezligi.

MAQ-2 va MAQ-3 moslamalari har bir o'qish uchun mos ravishda ikki va uchta nomuvofiqlikka imkon beradi. Ularning ikkalasi ham asosiy sifatda 20 va xaritalash sifati 40.

Biz ta'sirlangan MA liniyalarida nomzod mutatsiyalarni o'z ichiga olgan amplikonlardan foydalangan holda MAQ tomonidan chaqirilgan yagona nukleotidli mutatsiyalarning tasodifiy namunasini tekshirish uchun kuchaytirilgan PCR mahsulotlarining Sanger ketma-ketligidan foydalandik. Sinov qilingan 40 ta mutatsiyaning barchasi tasdiqlangan (1-jadval).
Past sifatli genom moslashuvi yordamida yadro genom mutatsiyalarini tekshirish
Shuningdek, biz yadroviy genomning moslashuvini pastroq asosiy sifat chegarasi ( b5 ; MAQda asosiy sifat ≥5) yordamida yaratdik va ulardan yuqori sifatli b20 maʼlumotlar toʻplamidagi mutatsiyalarning notoʻgʻri chaqirilishini tekshirish uchun foydalandik. Ushbu b5 ma'lumotlar to'plamida yuqori sifatli tekislashdan ko'ra har bir sayt uchun o'rtacha 1,8 ko'proq o'qiladi ( 1-jadval ). b5 ma'lumotlar to'plamida xatolarning umumiy soni ko'proq bo'lsa-da , har bir sayt uchun xatolik chastotasi juda kichik bo'lishi kutilmoqda. Agar b5 ma'lumotlaridagi qo'shimcha o'qishlarning >1 ta mutant chizig'i uchun mos yozuvlar bazasi bilan kelishilgan bo'lsa, biz mutatsiyani "inkor qilingan" deb tasnifladik (mutant asos emas). Agar mutatsiya inkor etilmagan bo'lsa, mutant asos bilan kelishilgan b5 ma'lumotlarida 1 ta qo'shimcha o'qilgan bo'lsa, u "tasdiqlangan". Ushbu mezonga ko'ra, inkor etilmagan, 132 tasi tasdiqlangan va 42 ta mutatsiya b5 moslashuvi ma'lumotga ega bo'lmagan.
Yadro genomining yagona nukleotidli mutatsiyalarining xossalari
Ushbu bo'limning maqsadlari uchun biz yuqorida tavsiflangan algoritm tomonidan chaqirilgan 174 mutatsiyani haqiqiy deb hisoblaymiz. D. melanogaster xromosoma qo'llari orasida mutatsiya darajasi sezilarli darajada farq qilmaydi ( 4-jadval ; ch 2 5 erkinlik darajasi [df] = 3,1; P = 0,68). Xususan, mutatsiya tezligi autosomalar va X xromosomalari o'rtasida sezilarli darajada farq qilmaydi ( 4-jadval ; Fisherning aniq testi, P = 0,13). Uchta MA chizig'ida chaqirilgan mutatsiyalar soni M126, M138 va M158 uchun mos ravishda 56, 58 va 60 edi. Shunday qilib, chaqirilgan mutatsiyalar sonidagi chiziqlar orasidagi o'zgarish ahamiyatsiz ( ch 2 2 df = 0,14; P = 0,93). Chiziqlar dastlab bir xil inbred genotipga ega edi, shuning uchun sezilarli o'zgarishlarning yo'qligi mutatsiya tezligini o'zgartirgan yangi mutatsiyalar to'planishi natijasida aniqlangan ta'sir yo'qligini ko'rsatadi. Biroq, biz mutatsiya tezligi o'zgarishini aniqlash uchun kam quvvatga egamiz. Misol uchun, biz Puasson taqsimlangan mutatsiya raqamlari farazi ostida 5% ahamiyatlilik darajasida mos ravishda 40% va 95% ehtimollik bilan bir qatorda mutatsiya tezligining 25% va 50% o'sishini aniqlashimiz mumkin.
4-jadval.
MAQ-3 moslashuvi uchun xromosoma qo'llari va D. melanogaster genomi uchun chaqirilgan mutatsiyalar soni, saytlar soni va mutatsiya tezligini baholash



Biz uchta MA chizig'ining har birida chaqirilgan asosiy nukleotid yordamida mutatsiyalarni qutblashtirdik. Mutatsion o'zgarishlar matritsasi 5-jadvalda ko'rsatilgan . O'tish mutatsiyalari mutatsiyalarning yarmidan bir oz kamroq qismini tashkil qiladi (ya'ni, 86 ta o'tish va 88 ta transversiya) va bu D. melanogaster guruhi ( Moriyama va Pauell) turlari o'rtasidagi sinonimik joylarda transversiya almashtirishga o'tish nisbatiga o'xshaydi. 1996 ). Shuning uchun bizning ma'lumotlarimiz D. melanogasterda 2: 1 ga yaqin o'tish: transversiya mutatsiyasiga moyilligini tasdiqlaydi . GC tarkibini kamaytiradigan mutatsiyalarning sezilarli darajada ko'pligi (ya'ni, 80 G yoki C → A yoki T ga nisbatan 53 A yoki T → G yoki C mutatsiyalari; ch 2 1 df = 5,5; P = 0,02), bu GC ni nazarda tutadi. genom tarkibi faqat mutatsiya bilan belgilanadigan muvozanatda emas. Xamirturushdagi butun genom ketma-ketligi shunga o'xshash kuzatuvlarni berdi ( Linch va boshq. 2008 ). Drosophila genomi 43% GC ni tashkil qiladi, shuning uchun G yoki C → A yoki T dan mutatsiya darajasi A yoki T → G yoki C dan 2,0 × ni tashkil qiladi va mutatsiya muvozanatidagi taxmin qilingan GC tarkibi shuning uchun 33% ni tashkil qiladi . Bu taxminiy neytral rivojlanayotgan "kelishda o'lik" transposable elementlarning bashorat qilingan muvozanat tarkibiga (35%) o'xshaydi ( Petrov va Hartl 1999 ; Singh va boshq. 2005 ).
5-jadval.
MAQ-3 moslashuvlarini solishtirish natijasida olingan yagona nukleotidli mutatsiya turlari raqamlari matritsasi

Qo'shni bazalar o'z-o'zidan mutatsiya tezligiga ta'sir qiladimi yoki yo'qligini aniqlash uchun biz mutatsiya sodir bo'lgan joylardan oldingi va keyingi bazalarning chastotalarini hisobladik. Biz har ikkala DNK zanjirini ekvivalent deb hisobladik, masalan, G dan oldingi har qanday boshqa asosga mutatsiyaga uchragan yovvoyi turdagi A asosi C dan keyin har qanday asosga mutatsiyaga uchragan yovvoyi turdagi T ga ekvivalent sifatida qaraladi. Kuzatilgan raqamlar Maxsus yovvoyi turdagi bazalardan oldingi yoki undan keyingi bazalar kutilganidan sezilarli darajada farq qilmaydi (2-jadval qo'shimcha), bu hech bo'lmaganda qo'shni bazalar darajasida kontekst effektlari juda zaif ekanligini ko'rsatadi. Biroq, kuzatuvlar soni katta emas, shuning uchun bu testlar kuchga ega emas.

Funktsional toifa bo'yicha tasniflangan yagona nukleotidli mutatsiyalar
D. melanogaster genom annotatsiyasidan foydalanib , biz yadro genom mutatsiyalarini ular konstitutsiyaviy yoki muqobil ravishda ifodalangan ekson, intron yoki intergenik DNKda sodir bo'lganligiga qarab tasnifladik ( 6-jadval ). Ekzonik mutatsiyalar sinonim yoki nosinonim deb tasniflangan. Nosinonim mutatsiyalarning hech biri bema'ni o'zgarishlarni keltirib chiqarmadi. Mutatsiya matritsasidan mutatsion o'zgarishlarni 12 ta mumkin bo'lgan mutatsiya turlarining nisbiy chastotalariga mutanosib ravishda tanlab olish orqali biz turli toifalardagi mutatsiyalarning kutilgan sonini hisoblab chiqdik ( 5-jadval ). Biz genomdagi joylarni tasodifiy tanlab olish orqali mutatsiyadan namuna oldik, toki bir joydagi baza mutatsiya matritsasidan namuna olingan yovvoyi turdagi bazaga mos kelguncha. Biz 10 000 ta tasodifiy tanlab olingan mutatsiyalarni yaratdik va keyin genom annotatsiyasini so'roq qilish orqali turli funktsional toifalardagi mutatsiyalarning nisbiy chastotalarini hisoblash uchun foydalandik. Sinonim bo'lmagan mutatsiyalar va boshqa barcha mutatsiyalar soni ( 6-jadval ) ularning kutilganidan sezilarli darajada farq qiladi ( ch 2 1 df = 2,2; P = 0,13), ammo sinonim bo'lmagan mutatsiyalarning ~ 25% defitsiti tanlov fiksatsiyaga xalaqit bergan bo'lishi mumkinligini ko'rsatadi. MA liniyalarida kuchli zararli aminokislota mutatsiyalari. Transkripsiyalangan va intergenik DNKda kuzatilgan mutatsiyalar soni kutilganiga juda o'xshash bo'lgani uchun bizning ma'lumotlarimizda transkripsiya bilan bog'liq ta'mirlash jarayoni haqida hech qanday dalil yo'q ( 6-jadval ).
6-jadval.
Funktsional toifa bo'yicha tasniflangan mutatsiyalar, MAQ-3 hizalamalarida kutilgan raqamlar bilan bir qatorda



Mitoxondriyal genom mutatsiyalari
Mitoxondriyal genom uchun o'rtacha o'qish chuqurligi M126, M138 va M158 uchun mos ravishda 816, 560 va 465 edi ( yadro genomi uchun 1-jadvalga qarang). Biz ilgari DHPLC va to'g'ridan-to'g'ri ketma-ketlikni mitoxondriyal genomning 50% dan ko'prog'ini bu erda o'rganilgan MA liniyalarining supersetida yangi mutatsiyalar uchun skanerlash uchun ishlatganmiz ( Haag-Liautard va boshq. 2008 ). Oldingi tajribamizda biz aniqlagan mutatsiyalarning aksariyati bir chiziq ichida geteroplazmatik edi. Ushbu tajriba doirasida ketma-ket joylashtirilgan uchta MA chizig'ida bizning oldingi tajribamiz M126 chizig'ida 0,14 taxminiy chastotada ajratilgan 10,093 pozitsiyasida bitta G → A o'tish mutatsiyasini aniqladi. Ushbu tajribada uchta MA chizig'i o'rtasida qat'iy farqlar yo'q, bu bizning oldingi tajribamizga mos keladi. Biz chiziqdagi bir joyda 200 ta o'qishning pastki chegarasini o'rnatdik va agar o'qishlarning kamida 5% saytdagi konsensus nukleotididan farq qilsa, mutatsiya deb ataladi. Bu ikkita nomzod mutatsiyasini, shu jumladan yuqorida aytib o'tilgan 10,093 pozitsiyasida G → A o'tishini aniqladi, ular M126 qatorida 0,12 chastotada ajratilgan. Bu bizning oldingi taxminimizga juda o'xshash. 18,984-pozitsiyadagi ikkinchi nomzod mutatsiyasi (C → T) M126 va M138 satrlarida mos ravishda 60% va 62% chastotalarda va M158da 50% chastotada ajralib chiqdi, garchi M158da o'qishlar soni bo'lsa ham. atigi 158. Shuning uchun bu juda o'zgaruvchan hotspot yoki, ehtimol, xaritalash artefaktini ko'rsatishi mumkin. Biz avvalgi tadqiqotimizda DHPLC tomonidan ushbu saytni skanerlay olmadik ( Haag-Liautard va boshq. 2008 ), chunki u ATga boy mintaqada va uni kuchaytirish qiyin.
Yadro genomining qisqa indel mutatsiyalari
Yadro indel mutatsiyasining tezligini baholash va indel mutatsiyalarning xususiyatlarini tavsiflash uchun biz Needleman-Wunsch algoritmidan foydalangan holda affin bo'shliq jazolari bilan bo'shliqlarni tekislashlarni yaratadigan Novoalign aligner (Novocraft Technologies) yordamida mos yozuvlar genom ketma-ketligiga moslamalarni yaratdik. MAQ tomonidan chiqishni qayta ishlagandan so'ng, biz har bir MA chizig'i uchun mos yozuvlar genomiga nisbatan chaqirilgan potentsial qisqa indekslarning joylarini oldik. Biz bir qatorga xos bo'lgan va taxminiy indeksni kesib o'tgan o'qishlarning >90% da chaqirilgan indekslarni topish uchun ushbu nomzod indekslarini solishtirdik. Muayyan o'qish chuqurligidagi satrning o'rtacha soniga bo'lish natijasida olingan taxminiy mutatsiya tezligi (3-jadval) past o'qish chuqurligida keskin ortadi. Bu, ehtimol, potentsial yagona nukleotid mutatsiyalariga o'xshash naqshga rioya qilgan holda, xatolarning hissasi bilan bog'liq ( 2-jadval ). Yuqori o'qish chuqurligida chaqirilgan mutatsiyalar soni juda kichik, shuning uchun indel mutatsiyalarni qabul qilish uchun empirik chegara chuqurligini aniqlash qiyin. 7 va 8 chuqurliklar uchun mutatsiyalar tezligi deyarli sezilarli darajada farq qiladi (Fisherning aniq testi, P = 0,06), ketma-ket yuqori o'qish chuqurliklari uchun mutatsiya tezligi o'rtasidagi kontrastlar ahamiyatsiz, shuning uchun biz o'qish chuqurligi ≥8 bo'lgan indellarni qabul qilish chegarasini o'rnatdik. . Biroq, ushbu mezondan foydalangan holda, Sangerning 35 ta nomzodlik mutatsiyalari bo'yicha ketma-ketligi kamida sakkizta o'qish chuqurligida chaqirilgan, ulardan faqat ettitasini tasdiqladi ( 7-jadval ; 4-jadval). Bu bizning ma'lumotlarimiz uchun indel tayinlash bilan bog'liq tasodifiy bo'lmagan xatoliklarning yuqori darajasidan dalolat beradi. Tasdiqlangan indekslar orasida o'chirishlar soni oltidan birga ko'p ( 7-jadval ).
7-jadval.
Novoalign tomonidan chaqirilgan Indel mutatsiyalari Sanger ketma-ketligi bilan tasdiqlangan



O'tish:
Munozara
Bizning tadqiqotimizdagi yagona nukleotidli mutatsiyalar tezligi euxromatik genomning 60 foizida xaritalangan 174 ta mutatsiyaga asoslanib, har bir nasl uchun sayt uchun 3,5 × 10 -9 ni tashkil qiladi. Bu bizning taxminimizga o'xshaydi 2,7 × 10 -9 (genomning 0,13% da xaritada ko'rsatilgan faqat sakkizta mutatsiyaga asoslanib), biz ilgari MA liniyalarining yuqori to'plamida DHPLC yordamida olingan ( Haag-Liautard va boshq. 2007 ). Ushbu hisob-kitoblar o'rtasidagi muvofiqlik turli xil genotiplardagi Drosophila MA liniyalari o'rtasida mutatsiya tezligining sezilarli o'zgarishi borligi haqidagi munozarani qo'llab-quvvatlaydi , chunki Florida-33 D. melanogaster MA liniyalaridan ( Houle va Nuzhdin 2004 ) mutatsiya tezligining taxmini 11,7 ni tashkil qiladi. × 10 -9 ( Haag-Liautard va boshq. 2007 ) va bu taxmin uchun pastki ishonch chegarasi (5,9 × 10 -9 ) bizning hozirgi taxminimizning yuqori ishonch chegarasi bilan mos kelmaydi (4,0 × 10 -9 ). Ikki tadqiqotdagi indel stavkalarini solishtirishning iloji yo'q, chunki hozirgi holatda biz noto'g'ri negativlar tezligini aniqlay olmaymiz va indellar uchun skanerlangan saytlar sonini taxmin qilish muammoli. Biroq, bu natijalar bizning oldingi tadqiqotimiz ( Haag-Liautard va boshq. 2007 ) va D. virilisdagi ( Petrov va boshq. 1996 ) turdagi indel polimorfizmining naqshiga mos keladigan, o'chirish tarafdorligining aniq dalillarini ko'rsatadi . Illumina texnologiyasidan foydalangan holda indel mutatsiyalarni yaxshiroq bashorat qilish juftlashtirilgan o'qishlar va/yoki uzoqroq o'qishlar bilan mumkin bo'lishi mumkin.
Har bir MA chizig'ida aniqlangan yagona nukleotidli mutatsiyalar soni sezilarli darajada o'xshashdir, bu mutatsiya tezligi tajriba davomida MA chiziqlari orasida doimiy bo'lganligini anglatadi. Shuning uchun yangi mutatsiya tezligi o'zgartiruvchi mutatsiyalarning aniqlanishi mumkin bo'lgan ta'siri yo'q. Shuningdek, biz xromosoma qo'llari orasidagi mutatsiya tezligining sezilarli o'zgarishini aniqlay olmadik. X xromosomasi xromosoma qo'llari orasida eng past mutatsiyaga ega bo'lsa-da, bu erkaklarga xos mutatsiyaga ishora qiladi, lekin uning tezligi autosomalardan sezilarli darajada farq qilmaydi. D. melanogaster guruhi turlarini solishtirganda X xromosomasida autosomalarga qaraganda yuqori nukleotidlar divergentsiyasi kuzatilgan ( Begun va boshq. 2007 ). Biroq, bu farqlarning kattaligi juda kichik va bizning ma'lumotlarimizdan statistik jihatdan farqlanmaydi.
Bizning ma'lumotlarimiz mutatsiya tezligiga qo'shni asosiy kontekstual ta'sirlarni ko'rsatmaydi. Ayniqsa, metillangan CpG dinukleotidlari bilan bog'liq bo'lgan kontekstga bog'liq bo'lgan mutatsiya muhim ahamiyatga ega bo'lgan sutemizuvchilardan farqli o'laroq, Drosophila'da bu hodisa haqida oldingi hisobotlar yo'qdek ko'rinadi ( Hwang and Green 2004 ; Siepel and Haussler 2004 ). Transkripsiya bilan bog'langan ta'mirlash jarayonining mavjudligiga kelsak, Drosophila ( Wang va boshq. 2007 ) va muridlarda ( Gaffney and Keightley 2006 ) transposable elementlarning farqlari intronik mintaqalarga qaraganda integenikda taxminan 5% -10% yuqori bo'lib, bunday jarayon ishlashi mumkin. Genik va intergenik toifalarda biz kuzatgan mutatsiyalar soni ushbu kattalikning ta'siriga mos keladi ( 6-jadval ), garchi mutatsiyalar soni teng mutatsiya tezligiga asoslangan holda kutilganidan sezilarli darajada farq qilmaydi. Biz aminokislota mutatsiyalari soni kutilganidan pastroq qisqarganiga oid ba'zi dalillarni ko'ramiz, bu esa ushbu mutatsiyalarning bir qismi (taxminan chorak) qat'iy tanlanganligini anglatadi, ammo bu rasmiy ahamiyatga ega emas. Ushbu mutatsiyalarga qarshi tanlov koeffitsientlari fiksatsiya ehtimoliga sezilarli ta'sir ko'rsatishi uchun MA chiziqlaridagi samarali populyatsiya hajmining o'zaro nisbatidan (ya'ni > 1/2) kattaroq bo'lishi kerak.
Mutantlar va yovvoyi tur o'rtasidagi o'qish chuqurligidagi farq uchun tuzatish kiritilgan bo'lsa, bitta bazaviy mutatsiya tezligining taxminlari MAQ va Novoalign alignerlariga juda o'xshash ( 3-jadval ). Biroq, bizning tadqiqotimiz noyob SNP larni (masalan, yangi mutatsiyalar) aniqlash uchun Illumina sekvensiyasi-sintezidan foydalanishda ehtiyot bo'lishni taklif qiladi, chunki biz ba'zi saytlar ketma-ketlik yoki xaritalash xatosining o'rtacha ehtimolidan yuqori bo'lgan tasodifiy bo'lmagan xatoning juda aniq dalillarini topdik. Masalan, o'qishning minimal chuqurligi ikki bo'lgan satrlar orasidagi farqni ko'rsatadigan saytlardagi farqlar ulushi kamida besh chuqurlikdagi saytlarga qaraganda ~ 20 baravar yuqori. Ushbu kam qamrovli saytlardagi xatolik darajasi mustaqil xatolarni nazarda tutgan holda, har bir sayt uchun o'rtacha xatolikdan ancha yuqori. Bu xatolar mustaqil deb taxmin qilish yoki beshdan kam o'qilgan saytlardan foydalanishga qarshi. Biz MA liniyalarimizni 454 Life Sciences (Roche) FLX texnologiyasi ( Lynch et al. 2008 ) yordamida yaqinda ketma-ketlashtirilgan xamirturush MA liniyalarining ikki baravar chuqurligiga ketma-ket joylashtirdik va saytni tahlilga kiritish uchun yuqoriroq minimal chuqurlik chegarasini belgiladik ( beshga qarshi uch). Bizning tahlilimiz yuqori qat'iylikni talab qildi, chunki Drosophila genomi xamirturush genomidan ~ 10 × kattaroq va Illumina o'qishlari Roche FLXga qaraganda qisqaroq. Usul mutatsiyalarni takrorlanuvchi yoki past murakkablikdagi hududlarda xaritalash imkonini bermaydi, chunki ularga xaritalash sifati past baholari beriladi. Agar bu hududlarda mutatsiya jarayoni g'ayrioddiy bo'lsa, unda mutatsiya tezligi va turlarning taqsimlanishi haqidagi taxminimiz noto'g'ri bo'ladi. O'tkazib yuborilishi kutilayotgan aniq sinf bu mikrosatellit mutatsiyalari. Yaqinda takrorlangan hududlardagi mutatsiyalar (nusxa raqami variantlari) chiziqlar ichida heterozigot bo'lib ko'rinadi, shuning uchun aniqlanmaydi. Bundan tashqari, biz bitta nukleotidli mutatsiyalar yovvoyi turdagi o'qishlarga qaraganda mos yozuvlar genomiga solishtirish ehtimoli kamroq ekanligini ko'rsatdik, shuning uchun indellarni o'z ichiga olgan o'qishlar bu muammodan ko'proq zarar ko'radi. Garchi nomukammal bo'lsa-da, bu va boshqa genom ketma-ketligi usullarining o'ta yuqori o'tkazuvchanligi, hech bo'lmaganda MA liniyalarida bitta nukleotidli mutatsiya tezligini aniqlash uchun oldingi mutatsiyalarni aniqlash usullarini ortiqcha qiladi. Bu, shuningdek , tabiiy populyatsiyalardan namuna olingan shaxslardagi mutatsiya tezligini baholash va inbred liniyalarda mutatsiyalar to'planishi natijasida yuzaga kelishi mumkin bo'lgan noto'g'ri fikrlarni chetlab o'tish uchun ota-onalar va ularning avlodlari genomlarini ketma-ketlashtirish ( Kondrashov 2008 ) kabi yangi imkoniyatlarni yaqinlashtiradi.
O'tish:
Usullari
Mutatsion to'planish chiziqlari
MA liniyalari uchun homozigot progenitor ("Madrid chiziqlari") muvozanatlashtiruvchi xromosomalar yordamida yaratilgan ( Caballero va boshq. 1991 ). Ushbu usul MA chizig'ining progenitoridagi qoldiq heterozigotlik ehtimolini istisno qilishi kerak. Oldingi tadqiqotimizda biz 277 ta genomik joyda mavjud Madrid MA liniyalarining katta to'plamining genomini skanerlash bilan bog'liq hech qanday dalil topmadik. Keyinchalik MA chiziqlari 47-avlodga qadar to'liq sib juftlash yoki ikkita birinchi qarindosh juftlash va 262-avlodga qadar to'liq sib juftlash orqali saqlanib qoldi ( Fernandez va López-Fanjul 1996 ). Maside et al . (2001) , ushbu tadqiqotda tahlil qilindi. Oldingi tadqiqotimizda, biz DHPLC tomonidan genomning kichik qismini yangi mutatsiyalar uchun skanerdan o'tkazdik ( Haag-Liautard va boshq. 2007 ), biz ushbu tadqiqot uchun tanlangan uchta MA chizig'ida yadroviy genom mutatsiyalarini aniqlamadik.
Butun genomli ov miltig'i ketma-ketligi
Uchta MA liniyasidan genomik DNKlar ishlab chiqaruvchilarning protokollariga muvofiq Illumina sekvensiyasi ( Bentley va boshq. 2008 ) uchun kutubxonalarni tayyorlash uchun shablon sifatida ishlatilgan. Illumina GAI asbobida 36 yoki 50 baza uzunlikdagi tasodifiy o'qishlar yaratilgan. Har bir MA liniyasi yuqori sifatli o'qishlarda ~ 10 × qamrovga erishilgunga qadar ketma-ketlashtirildi ( GAI oqimining ~ 0,75 qismi).
Malumot D. melanogaster genomiga moslashish
Biz MAQ (maq-0.6.8_x86_64-linux versiyasi) dan ov miltig'ining o'qilishini har bir MA qatoridan D. melanogaster versiyasi 5.9 genomidagi 120 381 546 evromatik asosga moslashtirish uchun foydalandik, shu bilan birga xaritalash sifati ≥40 va ikki xil asosiy sifatni belgiladik. MAQ hizalamalari standart parametrlar yordamida amalga oshirildi, bundan tashqari biz har bir o'qish uchun ruxsat etilgan nomuvofiqliklar sonini o'zgartirdik. Biz hisobot bergan tahlillarning aksariyati MAQ hizalamalariga tegishli bo'lib, har bir o'qish uchun uchta mos kelmaslik imkonini beradi (MAQ-3 bilan belgilanadi). Biz, shuningdek, har bir o'qish uchun ikkita nomuvofiqlikni ta'minlaydigan hizalamalarni ko'rib chiqdik (MAQ-2 bilan belgilanadi). Natijalar bitta nukleotidli mutatsiyani chaqirish uchun "pileup" formatiga aylantirildi. Ushbu formatda har bir satr mos yozuvlar genomining bazasiga mos keladi va unga mos keladigan har bir nukleotidning o'qish raqamlarini, ularning bazasi va xaritalash sifatini beradi.
Shuningdek, biz har bir MA satridan o'qishlarni mos yozuvlar genomiga moslashtirish uchun Novoalign (1.06 versiyasi) dan foydalandik. Malumot ketma-ketligi k -mer uzunligi = 14 va qadam o'lchami = 2 bo'lgan "novoindex" yordamida indekslangan , aks holda standart parametrlar yordamida. Keyin chiqish MAQ ning “.map” formatiga aylantirildi va bu keyinchalik bitta nukleotidli mutatsiyani chaqirish uchun “pileup” formatiga aylantirildi. Qisqa indellar MAQ ning "indelpe" buyrug'i yordamida bashorat qilingan.
Mutatsiyalarni chaqirish
Biz navbatma-navbat uchta MA chiziqli genom hizalamalaridagi har bir saytni taqqosladik. Har bir satr uchun, agar bir xil nukleotid o'qishlarning ≥90% da mavjud bo'lsa, biz to'g'ri konsensus nukleotidini tayinladik, aks holda bu saytdagi konsensus nukleotidi yaroqsiz deb belgilandi. 100% kelishuv bajarilsa, natijalar deyarli ta'sir qilmaydi (ma'lumotlar ko'rsatilmagan). Keyin biz uchta MA chizig'ida haqiqiy konsensus nukleotidlari mavjud bo'lgan saytlarni solishtirdik. Agar bitta chiziqning konsensus nukleotidlari boshqa ikkita chiziqning konsensus nukleotidlari bilan mos kelmasa, nomzod mutatsiya deb ataladi. Saytda to'g'ri konsensus nukleotidlari bo'lgan chiziqlar orasidagi minimal o'qishlar soni qayd etilgan.
Mutatsiyalar deyarli har doim mos yozuvlar ketma-ketligiga mos kelmasligi sababli, mutatsiyalarni o'z ichiga olgan o'qishlar yovvoyi turlarga qaraganda yuqori sifatga moslashish ehtimoli kamroq. Biz buni ≥5 chuqurlikda chaqirilgan mutantlar va ularning mos keladigan yovvoyi turlarini o'z ichiga olgan saytlar uchun o'rtacha o'qish chuqurligini hisoblash orqali tasdiqladik ( 3-jadval ). Ushbu saytlardagi yovvoyi turlar va mutantlar o'rtasidagi o'rtacha o'qish chuqurligidagi farq d bo'lsin. Mutant ko'rsatkichlarining kam ifodalanishi chaqirilgan mutatsiyalar soniga ta'sirini baholash uchun biz uchta MA chizig'i genom hizalanishining har biridan tasodifiy 1 000 000 ta saytdan namuna oldik. O'qishlar soni r 1 ≥ 5 bo'lgan saytlar uchun biz r 2 = r 1 – x ni hisobladik , bu erda x - d parametri bilan Puasson og'ishi. r 2 < 5 bo'lgan bunday saytlarning ulushi bizning o'tkazib yuborilgan mutatsiyalar ulushi haqidagi taxminimizdir.
Mutatsiyalarni Sanger sekvensiyasi orqali tekshirish
Biz uchta MA chizig'ining har birida nomzod mutatsiyalar joylarini o'z ichiga olgan PCR mahsulotlarini ketma-ketlashtirish orqali 40 ta bitta nukleotidli mutatsiyalarning tasodifiy namunasini tekshirdik. Indellar holatida biz nomzod indel mutatsiyasini va boshqa ikkita MA qatoridan birini o'z ichiga olgan qatorni ketma-ketlashtirdik.
O'tish:
Minnatdorchilik
Biz Karlos Lopez-Fanjul va Aurora Garsiya-Doradoga D. melanogaster MA liniyalarining namunalarini saxiylik bilan taqdim etganliklari uchun minnatdormiz; va Aurora Garsia-Dorado, Keti Xaag-Liautard va Donald Smit qo'lyozma bo'yicha foydali izohlar uchun. Illumina ketma-ketligi Edinburgdagi Darvin tresti, Buyuk Britaniyaning tabiiy muhit tadqiqot kengashi, Shotlandiya universitetlarining hayot fanlari alyansi va Edinburg universiteti Biologiya fanlari maktabi tomonidan moliyalashtiriladigan Genepulda amalga oshirildi .