Pharmaceutical Microbiology Manual

Parts 300-499 or USP HPLC methods. Lastly, animal antibiotics are typically 
tested using chemistry methods as published in JOAC, AOAC, Laboratory 
Information Bulletins (LIBs) and/or manufacturer’s methodology.
Improved manufacturing technology (e.g. purification methods) has evolved 
potency testing from a simple biological assay to different chemical assays. 
Most chemical assays are based in the segregation and quantification of 
antibiotic components through the use of high-performance liquid 
chromatography (HPLC). However, chemical assays do not demonstrate 
biological activity and antimicrobial efficacy of a test antibiotic, particularly an 
antibiotic which may contain numerous active components, each exhibiting 
different antimicrobial activities. Chemical potency assay does not require the 
use of a live test microorganism. For the remainder of this chapter, antibiotic 
potency refers to USP <81> testing only.

---

F
OOD AND 
D
RUG 
A
DMINISTRATION
 
O
FFICE OF 
R
EGULATORY 
A
FFAIRS
 
Office of Regulatory Science
 
Document Number: 
ORA.007 
Revision #: 02 
Revised: 
25 Aug 2020 
Title:
Pharmaceutical Microbiology Manual 
Page 45 of 92
For the most current and official copy, check QMiS. 
Antibiotic potency testing is a biological assay whereby varying concentrations 
of antibiotic are tested against a live microorganism. The resulting biological 
response is measured and evaluated against a median reference standard 
[S3] and standard curve [S1], [S2], [S4] and [S5]. The biological response is 
referred to as antibiotic activity or potency. Antibiotic potency is dependent 
upon antibiotic-microorganism specificity and is physically expressed by the 
inability of a microorganism to grow under optimal conditions in the presence 
of a specific test antibiotic.
Antibiotic potency testing is a multi-variable test dependent on a variety of 
factors. Factors may include: 1) Test microorganism growth requirements and 
inoculum levels 2) Test antibiotic dose and 3) Technical competency in 
preparation and/or use of equipment, growth media, reagent, test organism 
and antibiotic standards. Potency testing requires a basic knowledge of 
laboratory safety, analytical chemistry, microbiology and aseptic techniques. 
Potency testing is a manual, multi-step and multi-day process performed with 
common laboratory equipment. At minimum, two employees are required for 
preparation and sample setup. Due to the multiple stages of preparation and 
testing, only qualified (i.e. initial and routine trainings and evaluations) 
laboratory personnel should be authorized to perform USP <81> testing.
Antibiotic potency testing is performed either by the plate (cylinder-plate or 
diffusion) or tube (turbidimetric) method. Both plate and tube methods 
demonstrate measurable levels of growth inhibition. For example, zones of 
inhibition (ZOIs) are observed and measured during cylinder-plate testing. 
And, turbidity is observed and measured during tube testing. Growth inhibition 
measurements are tabulated and integrated into a linear regression curve, 
resulting in extrapolated antibiotic potency values.
Potency is denoted in units (U) or µg of activity and may or may not be exact in 
equivalence to the µg (weight) of the active compound. The following three 
reasons may explain this weight-activity discrepancy: 1) activity may be 
caused by the antibiotic’s free base or salt form and activity is denoted in either 
form 2) the antibiotic may contain similar chemical components but differ in 
activity or 3) the antibiotic activity is represented by a heterogeneous family of 
antibiotics and not a single analog.
An internal quality control is built into each plate and tube tested. Since 
antibiotics have different listed dosages per label, the test antibiotic/unknown 
sample is diluted to a known sample concentration ([U3]). The unknown 
sample [U3] has an equivalent concentration of the median reference standard 
([S3]). The median reference standard ([S3]) is the median concentration (i.e. 
mid-point) of the five-point standard curve ([S1], [S2], [S4] and [S5]). The five-

---