Fayzullayeva gulyorning oqsillar tuzilishi va muhandisligi fanidan

O’ZBEKISTON RESPUBLIKASI OLIY VA O’RTA MAXSUS TA’LIMI VAZIRLIGI

URGANCH DAVLAT UNIVERSITETI KIMYOVIY TEXNALOGIYALAR FAKULTETI

181 BT GURUH TALABASI

FAYZULLAYEVA GULYORNING

OQSILLAR TUZILISHI VA MUHANDISLIGI FANIDAN

MAVZU: Rekombinant DNK olish usullari.

Bajardi: Fayzullayeva. G

Qabul qildi: Bobojanov. E
Mavzu: Rekombinant DNK olish usullari.

MUNDARIJA

Kirish

I BOB. Nazariy qism

1. 
   Rekombinant dnk
   
2. 
   Rekombinant DNK texnologiyasi
   
3. 
   Genetik injeneriya 
   

II BOB. Asosiy qism

2.1 Rekombinant DNK olish usullari

2.2 Vektor molekulalar, genlar bibliotekasini yaratish va individual genlarni ajratish texnologiyasi.

2.3 Gen klonlash

XULOSA

FOYDALANILGAN ADABIYOTLAR

Kirish

Molekulyar klonlash laboratoriya jarayoni rekombinant DNKni yaratish uchun ishlatiladi. Bu polimeraza zanjiri reaktsiyasi (PCR) bilan birgalikda eng ko'p ishlatiladigan ikkita usuldan biridir va eksperimentator tomonidan tanlangan har qanday aniq DNK ketma-ketligini replikatsiya qilish uchun ishlatiladi. Usullar o'rtasida ikkita asosiy farq mavjud. Ulardan biri shundaki, molekulyar klonlash DNKni tirik hujayrada ko'paytirishni o'z ichiga oladi, PCR esa DNKni tirik hujayralardan ozod bo'lgan in vitro shaklida ko'paytiradi. Yana bir farq shundaki, klonlash DNK ketma-ketligini kesish va joylashtirishni o'z ichiga oladi, PCR esa mavjud ketma-ketlikni nusxalash orqali yaxshilanadi.

Rekombinant DNKning shakllanishi klonlash vektorini , tirik hujayrada ko'payadigan DNK molekulasini talab qiladi . Vektorlar odatda plazmidlar yoki viruslardan kelib chiqadi va ko'paytirish uchun zarur bo'lgan irsiy signallarni o'z ichiga olgan DNKning nisbatan kichik segmentlari, shuningdek, xorijiy DNKni kiritish qulayligi uchun qo'shimcha elementlar, rekombinant DNK o'z ichiga olgan hujayralarni aniqlash va kerak bo'lganda xorijiy DNKni ifoda etuvchi elementlardir. Molekulyar klonlash uchun vektorni tanlash mezbon organizmni tanlashga, klonlanadigan DNK hajmiga va chet ellik DNKni qanday ifodalash kerakligiga bog'liq. Ushbu DNK segmentlarini turli xil usullar yordamida birlashtirish mumkin, masalan, cheklov fermentlari / klonlash ligazalari yokiGibson yig'ilishi .

Oddiy klonlash protokollarida har qanday DNK fragmentini klonlashtirish asosan etti bosqichni o'z ichiga oladi: (1) mezbon organizmni tanlash va vektorni klonlash, (2) DNK vektorini olish, (3) DNKni klonlash, 4) rekombinant yaratish. DNK, (5) Uy egasi organizmiga rekombinat DNKni kiritish, (6) Rekombinant DNKni o'z ichiga olgan organizmlarni izolyatsiyalash va (7) kerakli DNK qo'shimchalari va biologik xususiyatlarga ega klonlarni skrining qilish. Ushbu bosqichlar batafsilroq maqolada ( Molekulyar klonlash ) tasvirlangan.

Asosiy maqola: oqsil ishlab chiqarish

Mezbon organizmga ko'chirib so'ng, chet el DNK yoki mumkin emas mumkin, rekombinat DNK tarkibidagi bildirdi . Ya'ni, DNKni ifoda qilmasdan ko'paytirish mumkin, yoki uni dekodlash va tarjima qilish mumkin va rekombinant protein olinadi. Umuman olganda, begona genning ifodasi genlarni qayta tartibga solish uchun translyatsiya xosti tomonidan ishlatilishi mumkin bo'lgan molekulaning mRNKini olish uchun zarur bo'lgan ketma-ketlikni (masalan, promouter , tarjimani boshlash signali va transkripsiya terminatori) talab qiladi.) Ektopik genning ifodasini yaxshilash uchun mezbon organizmdagi aniq o'zgarishlar bo'lishi mumkin. Bundan tashqari, o'zgartirishlar ketma-ketlikni kodlash uchun, shuningdek tarjimani optimallashtirish, oqsilni eriydigan qilish, rekombinant oqsilni tegishli uyali yoki hujayradan tashqaridagi joyga yo'naltirish va oqsilni parchalanishdan barqarorlashtirish uchun zarur bo'lishi mumkin.

I BOB. Nazariy qism

1. 
   Rekombinant dnk
   

Rekombinat DNK molekulasi laboratoriya bilan hosil bo'lgan bir molekula bo'lib genetik rekombinatsiya usullari (masalan, molekulyar klonlash yaratish, bir necha manbalardan birgalikda genetik material yig'ishda) ketliklar aks holda ham topilmadi genomunun . Tirik organizmda qayta birlashtiruvchi DNK birinchi tomonidan 1973 yilda erishilgan Herbert Boyer bu universiteti tashkil  Kaliforniya, San-Fransisko, va Stanley Cohen ning, Stenford ishlatiladi, E.coli, cheklash fermentlarni xorijiy DNKni plazmidlarga kiritish uchun.

Rekombinant DNK, DNKning kamida ikkita ipning kombinatsiyasi yordamida yaratilgan qismi uchun keng tarqalgan nom. Rekombinant DNK mumkin, chunki barcha organizmlarning DNK molekulalari bir xil kimyoviy tuzilishga ega va faqat ushbu umumiy strukturadagi nukleotidlar ketma-ketligi farqlanadi . Rekombinant DNK molekulalari ba'zan kimyoviy DNK deb ataladi, chunki ular materialdan afsonaviy kimyeralar singari ikki xil turdan tayyorlanishi mumkin . R-DNK texnologiyasi palindromik ketma-ketlikni qo'llaydi va yopishqoq va to'mtoq uchlarning paydo bo'lishiga olib keladi .

DNKsini va shu bakteriya plazmidini alohida probirkalarda «yopishqoq» uch hosil qiluvchi EcoRl (iko-er-bir) restriktaza fermenti bilan ishlov berganlar. Halqasimon plazmid tarkibida faqat bir dona EcoRl restriktaza fermenti tan- lab kesadigan maxsus nukleotidlar izchilligi bo‘lganligi sababli restriktaza DNK qo‘sh zan- jirini faqat bir joydan kesib halqasimon plazmidni yopishqoq uchli ochiq holatga o‘tkazadi. Xromosoma DNK molekulasida EcoRl restriktaza fermenti taniy oladigan maxsus nukleotidlar izchilligi qancha bo‘lsa, bu molekula shuncha bo‘lakka bo‘linadi. DNK bo‘laklarini elektroforez moslamasida kuchli elektr maydonida katta-kichikligiga qarab ajratiladi va hosil bo‘lgan bo‘laklar max­sus bo‘yoq bilan bo‘yaladi. Natijada, bir nuqtada yig‘ilgan bir xil kattalikdagi DNK bo‘laklari to‘plamini oddiy ko‘z bilan ko‘rish mumkin. Elektroforez gelidan xohlagan kattalikdagi DNK bo‘lagi- ni suvda eritib ajratib olish mumkin. Boyer va Koen shu usullar bilan ajratib olingan yopishqoq uchli xromosoma DNK bo‘lagini ochiq holatdagi yopishqoq uchli plazmid DNKsi bilan probirkada aralashtirib ligaza (ulovchi) fermenti vositasida bu ikki xil DNK bo‘laklari uchlarini bir-biriga kovalent bog‘lar yordamida uladi. Natijada, plazmid tarkibiga xromosoma DNK bo‘lagi kiritildi. Shu usulda rekombinant plazmid ilk bor hosil qilindi (10-rasm). Bu molekular qurilmada (konstruksiyada) plazmid DNK vektor (yo‘naltiruvchi) funksiyasini bajaradi, chunki yuqorida aytib o‘tga- nimizdek plazmidlar xromosoma DNKsiga rekombinatsiyalana oladi hamda mustaqil ko‘paya oladi. Bu vektor konstruksiya o‘z tarkibida antibiotikka chidamlilik geni bo‘lganligi uchun maxsus yaratilgan plazmidsiz, ya’ni antibiotikka chidamsiz shtamm hujayralariga kiritildi. Rekombinant plazmid kiritilgan bakteriya hujayralari kloni antibiotikka chidamli genga ega bo‘lib qolganligi sababli, plazmidsiz bakteriyadan farq qilib, antibiotik ta’sirida o‘lmaydi. Shu sababli tajriba o‘tkazayotgan probirkaga antibiotik qo‘shib rekombinant bakteriya kloni ajratib olinadi va ko‘paytiri- ladi. Bu klonni tashkil etuvchi har bir bakteriyada yot (geterologik) DNK bo‘lagi bor bo‘lib, bakteriya biomassasi qanchalik ko‘payti- rilsa, yot DNK bo‘lagi shunchalik ko‘payishi mumkin. Undan tashqari rekombinant plazmid vektor avtonom replikatsiyalanuv- chi plazmid bo‘lsa, yot DNK bo‘lagini yana o‘nlab barobar ko‘paytirish mumkin. Yot DNK bo‘lagini rekombinant vektor konstruksiyalar vositasida ko‘paytirish genlarni klonlash deb ata­ladi. DNK bo‘lagini klonlashda vektor sifatida virus va fag DNK molekulasidan yoki ko‘chib yuruvchi genetik elementlardan ham foydalanish mumkin.

O‘simlik irsiyatini gen injeneriyasi usuli bilan o‘zgartirish

Klassik genetik usul bilan irsiyatni o‘zgartirishning asosiy kamchiligi ikki xil genotipli organizm chatishtirilganda ularning barcha xo‘jalik uchun molik va molik emas genlari o‘zaro rekom- binatsiyalanishidir. Natijada, yaratilgan navga genetik tadqiqotchi istagan gendan tashqari, navning xususiyatini buzuvchi ko‘pdan ko‘p genlar o‘tadi.

Gen injeneriyasi usuli qo‘llanganda bu muammo yengil hal qilinadi.

Buning uchun takomillashtirilayotgan o‘simlik navi

Rekombinant DNK molekulalari qurilishida ishlatiladigan DNK ketma-ketligi har qanday turdan bo'lishi mumkin . Shunday qilib, masalan, o'simlik DNK bakterial DNKga yoki inson DNKsi qo'ziqorin DNKiga ulanishi mumkin. Bundan tashqari, DNK - tabiatda boshqa biron joyda topilmaydigan kimyoviy DNK sintezi yordamida yaratilishi va rekombinant molekulalarga qo'shilishi mumkin. Rekombinat DNK texnologiyasi va sintetik DNK yordamida har qanday DNK ketma-ketligi yaratilishi va har qanday tirik organizmlarning har biriga kiritilishi mumkin.

Tirik hujayralardagi rekombinant DNKning namoyon bo'lishi natijasida yuzaga keladigan oqsillarga rekombinant oqsillar deyiladi . Proteinni kodlovchi rekombinant DNK xostga kiritilganda, rekombinant protein ishlab chiqarilishi shart emas. Chet el oqsillarini ifoda etish ixtisoslashtirilgan ifoda vektorlaridan foydalanishni talab qiladi va ko'pincha xorijiy kodlash ketma-ketligini sezilarli darajada qayta tartibga solishni talab qiladi.

Rekombinant DNK genetik rekombinatsiyasidan farq qiladi, chunki birinchi natijalar in vitro sun'iy usulidan, ikkinchi natija esa deyarli barcha organizmlarning mavjud DNK ketma-ketliklarining remiksiga olib keladigan oddiy biologik jarayondir.

1.2 Rekombinant DNK texnologiyasi

INCLUDEPICTURE "http://kakmed.com/img/2013/10/artificial-cell.jpg" \* MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE "http://kakmed.com/img/2013/10/artificial-cell.jpg" \* MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE "http://kakmed.com/img/2013/10/artificial-cell.jpg" \* MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE "http://kakmed.com/img/2013/10/artificial-cell.jpg" \* MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE "http://kakmed.com/img/2013/10/artificial-cell.jpg" \* MERGEFORMATINET INCLUDEPICTURE "http://kakmed.com/img/2013/10/artificial-cell.jpg" \* MERGEFORMATINET
Sun’iy sharoitda rekombinant DNK olish va genlarni klonlash ilk bor 1972 yilda AQSH olimlari Boyer va Koen tomonidan amalga oshirilgan. Bu olimlar E.coli bakteriyasining xromosoma DNK siga va shu bakteriya plazmidasiga alohida idishlarda EcoRI restriktaza fermenti bilan ishlov berganlar. Plazmida tarkibida faqat 1 dona EcoRI restriktaza fermenti tanib kesadigan maxsus nukleotidlar ketma-ketligi bo‘lganligi sababli ferment plazmidaning xalqasimon DNK qo‘sh zanjirini faqat bir joydan kesib, plazmidani «yopishqoq« uchli ochiq holatga o‘tkazadi. Xromosoma DNK molekulasida EcoRI restriktaza fermenti taniy oladigan maxsus nukleotidlar ketma-ketligi qancha bo‘lsa, bu molekula shuncha bo‘lakka bo‘linadi.

Turli xil o‘lchamga ega bo‘lgan DNK molekulasi elektroforez uslubi yordamida ajratib olinadi. Ajratib olingan «yopishqoq» uchli xromosoma DNK si bo‘lagi ochiq holatdagi “yopishqoq” uchli plazmida DNK si bilan aralashtirilib ligaza fermenti yordamida tikiladi (ulanadi). Natijada plazmida tarkibiga xromosoma DNK bo‘lagi kiritiladi.

Shu boisdan rekombinant DNK ga quyidagicha tarif berish mumkin: har qanday tirik organizm irsiy molekulasining istalgan bo‘lagini vektor molekulalariga birikishdan hosil bo‘lgan sun’iy DNK - rekombinant DNK deyiladi.

Rekombinant DNK olishning uchta usuli mavjud:

- konnektor usuli;

- restriktaza-ligaza;

- linker molekulalaridan foydalanish usuli.

Konnektor usulida - rekombinatsiyada ishtirok etuvchi DNK bo‘lagining 3' uchiga dezoksinukleotidil-transferaza fermenti yordamida ma’lum uzunlikdagi oligo (dA) - segmenti ulanadi. Ikkinchi uchiga esa oligo (dT) - segmenti ulanadi. Bu DNK bo‘laklari aralashtirilganda dA va dT segmentlarning vodorod bog‘lari asosida komplementar birikishi tufayli xalqasimon DNK strukturasi hosil bo‘ladi. Hosil bo‘lgan DNK dagi bir zanjirli bo‘sh joylar DNK-polimeraza I fermenti yordamida to‘ldiriladi.

Restriktaza-ligaza usuli - rekombinant DNK olishning eng sodda va oson usuli hisoblanadi. Bu usulda DNK molekulasi va vektor plazmida «yopishqoq» uchlar hosil qiluvchi restriktaza bilan qirqiladi va aralashtirilgan holda ma’lum sharoitda reassotsiatsiya qilinadi. Komplementarlik xususiyatiga ko‘ra DNK molekulalari o‘zaro vodorod bog‘lari yordamida birikib xalqasimon struktura hosil qiladi va DNK zanjirining birikmagan joylari DNK-ligaza fermenti yordamida ulanadi.

Linker molekulalaridan foydalanish usulida - DNK molekulasiga va vektor plazmidaga T4 fag DNK-ligaza fermenti yordamida maxsus nukleotid ketma-ketligiga ega bo‘lgan linker molekula ulanadi. Olingan ikki turdagi DNK molekulasi restriktaza fermenti yordamida qirqilib, aralashtirilgan holda qaytadan assotsiatsiya qilinadi. DNK va vektor plazmida molekulalarining birikmagan joylari DNK-ligaza fermenti yordamida ulanadi. SHu yo‘sinda rekombinant DNK molekulasi hosil bo‘ladi.
Rekombinant DNKni avtonom replikatsiya bo‘lishi uchun javob beradigan DNK bo‘lagi - vektor molekulalari deyiladi.

Vektor molekulalar o‘z vazifasiga ko‘ra ikki tipga bo‘linadi:

Birinchisi -avtonom replikatsiya bo‘luvchi vektorlar.

Ikkinchisi - xromosomaga integratsiya bo‘luvchi vektorlar.

Vektor molekulalar gen muhandisligi biotexnologiyasida genlarni klonlashda va transformatsiya qilishda asosiy ish quroli bo‘lib xizmat qiladi. Vektor molekulalari vazifasini fag DNK lari, plazmidalar va o‘simliklarni xloroplast hamda mitoxondrial DNK lari o‘tashi mumkin.

Xo‘jalik ahamiyati qimmatli bo‘lgan genlarni ajratish uchun gen banki tuziladi. Xromosomal DNK asosida gen bibliotekasini tuzish quyidagicha amalga oshiriladi:

DNK va vektor molekulalar restriktaza fermenti yordamida qirqiladi va ma’lum sharoitda qaytadan assotsiatsiya qilinadi;

Nukleotidlar orasida ulanmay qolgan bo‘shliq DNK-ligaza fermenti yordamida o‘zaro biriktiriladi;

Olingan rekombinant DNK bakteriya hujayrasiga transformatsiya qilinadi.

Xromosomal DNK da mavjud genlarni to‘la klonlash uchun DNK o‘lchamiga va olingan klonlarni soniga e’tibor berish kerak.

Genlarni klonlashda ko‘pincha kDNK bibliotekasini tuzish maqsadga muvofiqdir. Bu holda maxsus poli (Y) va oligo (dT) kolonkalari yordamida uchlarida poli (A) nukleotidlar ketma-ketligini saqlovchi iRNK, tRNK va pRNK dan ajratib olinadi. Olingan iRNK molekulasi oligo (dT) nukleotidlari bilan aralashtirilib reassotsiatsiya qilinadi.

Bunda iRNK molekulasining poli (A) uchida dA-dT qo‘sh zanjirli segment hosil bo‘ladi. Ushbu ikki zanjirli segmentning oligo (dT) uchi kDNK sintezini amalga oshiruvchi revertaza fermenti uchun praymer (kDNK sintezining boshlanish nuqtasi) vazifasini o‘taydi.

Sintez qilingan kDNK molekulasi qisqa uchli ikki zanjirli struktura bilan tugallanadi. kDNK sintezida matritsa vazifasini o‘tagan iRNK molekulasi NaOH bilan parchalanadi, natijada qisqa ikki zanjirli va to‘liq iRNK molekulasiga komplementar bo‘lgan bir zanjirli kDNK molekulasi hosil bo‘ladi.

Hosil bo‘lgan qisqa ikki zanjirli struktura kDNK ning ikkinchi zanjirini sintez qilishda praymer vazifasini o‘taydi. DNK-polimeraza I fermenti yordamida kDNK ning ikkinchi zanjiri sintez qilinadi. Hosil bo‘lgan kDNK ning bir zanjirli qismi SI-nukleaza fermenti yordamida parchalanadi va ikki zanjirli kDNK molekulasi hosil bo‘ladi. SHu yo‘sinda hosil bo‘lgan kDNK molekulasi vektor molekulalariga ulangan holda klonlanadi.

Har ikki usul bilan yaratilgan genom bibliotekasidan individual genlarni ajratib olish quyidagicha amalga oshiriladi - rekombinant plazmida denaturatsiya qilinadi (100⁰S haroratda 5 min., 0,2 N NaOH eritmasida 15 min.), bir zanjirli DNK molekulasi stabil qo‘zg‘almaydigan holatda turishi uchun nitrotsellyuloza filtriga biriktiriladi. Olingan filtr [g^-32P] ATF nukleotidi bilan nishonlangan iRNK molekulasi bilan gibridizatsiya qilinadi.

Molekulyar gibridizatsiya jarayonida filtrga birikkan rekombinant DNK molekulasiga komplementarlik qonuniyati asosida nishonlangan iRNK molekulalari birikadi.

Hosil bo‘lgan gibrid DNK molekulasi denaturatsiya qilinib, nishonlangan iRNK molekulasi ajratib olinadi (elyusiya yordamida). Olingan iRNK molekulasi hujayrasiz oqsil sintez qilish tizimida tekshirib ko‘riladi. Hosil bo‘lgan oqsil molekulasini identifikatsiya qilish yo‘li bilan individual genlarni ajratib olish amalga oshiriladi.¹


1.3 Genetik injeneriya - molekulyar genetika sohasi; genlarning tabiatda uchramaydigan yangi birikmalarini genetik va biokimyoviy usullar yordamida maqsadga muvofiq holda vujudga keltirish bilan shugʻullanadi. Muayyan organizm hujayrasidan ajratib olingan gen yoki genlar guruhini nuklein kislotaning maʼlum molekulalari bilan biriktirib, hosil boʻlgan duragayni boshqa organizm hujayrasiga kiritishga asoslangan. Viruslar va b. har qanday tirik mavjudot hujayralarining irsiy programmasini maqsadga muvofiq modellashtirish, yangi shtamm virus va mikroorganizmlar, oʻsimlik, hayvon hujayralarining yangi xillarini, oʻsimlik navlari va hayvon zotlarining q. x. uchun zarur shakllarini yaratish va b. G. i. vazifasidir. AQSH olimi P. Berg xodimlari bilan birga virus va mikroorganizmlar irsiy molekulasi qismlarini probirkada ulab, rekombinant DNK olishi G. i. ning vujudga kelishiga asos soldi (1972). G. i. umumiy genetika, molekulyar genetika, molekulyar biologiya, bioorganik kimyo, mikrobiologiya, oʻsimlikshunoslik kabi biologik fanlar nazariyalari hamda tadqiq etish usullarining bir-birini toʻldirishi tufayli shakllandi. G. i.ning rivojlanishida genetik enzimologiya va nuklein kislotalar kimyosi yutuklari katta ahamiyatga ega. Molekulyar darajada olib boriladigan ishlar natijasi ikki xil ferment — restriksiyey endonukleaza va ligazaga bogʻliq. Restriktazalardan (300 dan ortiq xili bor) DNK molekulasini har xil qismlarga ajratishda, ligazadan esa ularni yana qayta birlashtirishda foydalaniladi. G. i.da eng koʻp ishlatiladigan restriktaza (Yeso Rb) 1971 y.da olingan. G. i.ning rivojlanish tarixi in vitro sharoitida (organizmdan tashqarida) rekombinant DNK molekulalarini, yaʼni har xil plazmidalar (xromosomalarsiz, mustaqil yashash xususiyatiga ega DNK halqa molekulalari), hattoki plazmida bilan faglar orasida duragaylar yoki vektor molekul alar (xoʻjayin hujayrada mustaqil qayta tiklana olish xususiyatiga ega DNK molekulasi) olish mumkinligini prinsipial isbotlashdan boshlangan. Keyinchalik prokariotlar (shakllangan yadrosi yoʻq organizmlar)ga taalluqli xromosoma genlari bilan har xil plazmidalar orasida rekombinant molekulalar olindi. Vektor molekulalarga eukariot (shakllangan yadroga ega) organizm (asosan, hayvon va oʻsimlik) genlari DNKsini kiritish G. i.ning katta yutugʻidir. Natijada hayvon genlarini bakteriya hujayralarida koʻpaytirish va ekspressiya qilish (genlarni klonlash) imkoniyati vujudga keddi. Nihoyat, G. i. bilan hujayra injeneriyasi yutuqlarining sintezi tufayli biotexnologiya fani shakllandi.gen injeniriyasi - asosan o'zida yashirin genlarni saqlaydi va ularning chatishish natijasida yangi gen hosil qiladi. G.i birinchilardan bo'lib Ch.Darvin ham o'z ma'lumotlarini berib o'tgan.G.i da birinchi bo'lib 1865 yilda G.Mendel o'zining birinchi tajribasini o'tkazadi.U o'zining bu tajribasini sariq va yashil no'xotlar ustida olib boradi. Va u o'zining bu tajribasi bilan g.i ni yanada ochiqroq tarza o'rgatadi.

II BOB. Asosiy qism

2.1 Rekombinant DNK olish usullari

Gen muhandisligining poydevori-rekombinant DNK lar texnologiyasi genetik

struturalarini birga qo’shish texnikasi molekulyar biologiyaning eng muhim yutuqlaridandir. Bu texnologiyadan foydalanib zarur mahsulotni (oqsilni) kodlaydigan DNK molekulasining kichik bir qismi genni kesib olish, uning yot gen bilan kombinatsiyasini yaratish, so’ngra bu yangi genomni munosib hujayralarga kiritib xo’jayin hujayra DNKsining sintez mexanizmi yordamida ko’p martalab ko’paytirish mumkin.

Sun’iy sharoitda rekombinant DNK olish va genlarni klonlash ilk bor 1972-yilda AQSh olimlari Boyer va Koen tomonidan amalga oshirilgan. Bu olimlar E.soli bakteriyasining xromosoma DNKsiga va shu bakteriya plazmidasiga alohida idishlarda EsoRI restriktaza fermenti bilan ishlov berganlar. Plazmida tarkibida faqat 1 dona EsoRI restriktaza fermenti tanib kesadigan maxsus nukleotidlar izchilligi bo’lganligi sababli ferment plazmidaning halqasimon DNK qo’sh zanjirini faqat bir joyidan kesib, plazmidani "yopishqoq" uchli ochiq holatga o’tkazadi. Xromosoma DNK molekulasida EsoRI restriktaza fermenti taniy oladigan maxsus nukleotidlar izchilligi qanday bo’lsa, bu molekula shuncha bo’lakka bo’linadi.

Turli xil o’lchamga ega bo’lgan DNK molekulasi elektroforez uslubi yordamida ajratib olinadi. Ajratib olingan "yopishqoq" uchli xromosoma DNKsi bo’lagi ochiq holatdagi "yopishqoq" uchlik plazmida DNK si bilan aralashtirilib ligaza fermenti yordamida tiklanadi. Natijada plazmida tarkibiga xromosoma DNK bo’lagi kiritiladi.Shu boisdan rekombinant DNK ga quyidagicha ta’rif berish mumkin: har qanday tirik organizm irsiy molekulasining istalgan bo’lagini vektor molekulalariga birikishidan hosil bo’lgan sun’iy DNK rekombinant DNK deyiladi.

Rekombinant DNK olishda uchta- konnektor, restriktaza ligaza va linker molekulalari usullaridan foydalaniladn. Konnektor usulida rekombinatsiyada ishtirok etuvchi DNK bo’dagining 3' uchiga dezoksinukleotidiltransferaza fermenti yordamida ma’lum uzunlikdagi oligo (dA) - segmenti ulanadi. Ikkinchi uchiga esa oligo ((dT) - segmenti ulanadi. Bu DNK bo’laklari aralashtirilganida dA va dT setmentlarning vodorod bog‘lari asosida komplementar birikishi tufayli halqasimon DNK strukturasi hosil bo’ladi. Hosil bo’lgan DNK dagi bir zanjirli bo’sh joylar DNK-polimeraza fermenti yordamida to’ldiriladi.

Restriktaza-ligaza usuli eng sodda va oson rekombinant DNK olish usuli hisoblanadi. Bu usulda DNK molekulasi va vektor plazmida "yopishqoq" uchlar hosil kiluvchi restriktaza bilan qirqiladi va aralashtirilgan holda ma’lum sharoitda reassotsiatsiya qilinadi. Komplementarlik xususiyatiga ko’ra DNK molekulalari o’zaro vodorod bog‘lari yordamida birikib halqasimon struktura hosil qiladi va DNK zanjirining birikmagan joylari DNK-ligaza fermenti yordamida ulanadi.

Linker molekulalaridan foydalanish usulida DNK molekulasiga va vektor plazmidaga T4 fag DNK-ligaza fermenti yordamida maxsus nukleotid ketma-ketligiga ega bo’lgan linker molekula ulanadi. Olingan ikki turdagi DNK molekulasi restriktaza fermenti yordamida qirqilib aralashtirilgan holda reassotsiatsiya qilinadi. DNK va vektor plazmida molekulalarining birikmagan joylari DNK-ligaza fermenti yordamida ulanadi. Shu yo’sinda rekombinant DNK molekulasi hosil bo’ladi.

2.2 Vektor molekulalar, genlar bibliotekasini yaratish va individual genlarni ajratish texnologiyasi.

avtonom replikatsiya bo’lishi uchun javob beradigan DNK bo’lagi vektor molekulalari deyiladi. Vektor molekulalar o’z vazifasiga ko’ra ikki tipga bo’linadi. Birinchisi avtopon replikatsiya bo’luvchi vektorlar. Ikkinchisi xromosomaga integratsiya bo’luvchi vektorlar. Vektor molekulalar gen muxandisligi biotexnologiyasida genlarni klonlashda va transformatsiya qilishda asosiy ish quroli bo’lib xizmat qiladi.

Vektor molskulalari vazifasini fag DNK lari, plazmidalar va o’simliklarni xloroplast hamda mitoxondriya DNK lari o’tashi mumkin. Xo’jalik ahamiyati qimmatli bo’lgan genlarni ajratish uchun gen bibliotekasi tuziladi. Xromosomal DNK asosida gen bibliotekasini tuzish quyidagicha amalga oshiriladi: DNK va vektor molekulalar restriktaza fermenti yordamida qirqiladi va ma’lum sharoitda reassotsiatsiya qilinadi. Nukleotidlar orasida ulanmay qolgan bo’shliq DNK-ligaza fermenti yordamida o’zaro biriktiriladi. Olingan rekombinant DNK bakteriya hujayrasiga trangformatsiya qilinadi. Xromosomal DNKda mavjud genlarni to’la klonlash uchun DNK o’lchamiga va olingan klonlarni soniga e’tibor berish kerak. Bu ko’rsatgich quyidagi formula yordamida hisoblanadi,

1п (1-)

1п (1-х/у)

bunda:

x-klonlanayotgan DNK o’lchami), u-gaploid genomning o’lchami va r=0,99 ga teng bo’lsa 99 ga teng xromosomal DNKning unikal qismi klonlanadi.

Genlarni klonlashda ko’pincha kDNK bibliotekasini tuzish maqsadga muvofiqdir. Bu holda maxsus poli (Y) va oligo (dT) kolonkalari yordamida uchlarida poli (A) nukleotidlar ketma-ketligini saqlovchi iRNK tRNK va rRNK dan ajratib olinadi. Olingan iRNK molekulasi oligo (dT) nukleotidlari bilan aralashtirilib reassotsiatsiya qilinadi. Bunda iRNK molekulasining poli (A) uchida dA va dT qo’sh zanjirli segment hosil bo’ladi. Ushbu ikki zanjirli segmentning oligo (dT) uchi kDNK sintezini amalga oshiruvchi revertaza fermenti uchun praymer (kDNK sintezining boshlanish nuqtasi) vazifasini o’taydi.

Sintez qilingan kDNK molekulasi qisqa uchli ikki zanjirli struktura bilan tugallanadi. kDNK sintezida matritsa vazifasini o’tagan iRNK molekulasi NaON bilan parchalanadi natajada qisqa ikki zanjirli va to’liq iRNK molekulasiga komplementar bo’lgan bir zanjirli kDNK molekulasi hosil bo’ladi. Hosil bo’lgan qisqa ikki zanjirli struktura kDNK ning ikkinchi zanjirini sintez qilishda praymer vazifasini o’taydi. DNK-polimeraza-I fermenti yordamida kDNKning ikkinchi zanjiri sintez qilinadi. Hosil bo’lgan kDNKning bir zanjirli qismi SI-nukleaza fermenti yordamida parchalanadi va ikki zanjirli kDNK molekulasi hosil bo’ladi. Shu yo’sinda hosil bo’lgan kDNK molekulasi vektor molekualariga ulangan holda klonlanadi.

Har ikki usul bilan yaratilgan genom bibliotekasidan individual genlarni ajratib olish quyidagicha amalga oshiriladi rekombimant plazmida denaturatsiya qilinadi (100° S haroratda 5min., 0,2n NaOH eritmasida 15 min), bir zanjirli DNK molekulasi stabil qo’zg‘almaydigan holatda turishi uchun nitrotsellyuloza filtrga biriktiriladi. Olingan filtr [32R] ATF nukleotidi bilan nishonlangan iRNK molekulasi bilan gibridizatsiya :qilinadi. Molekulyar gibridizatsiya jarayonida filtrga birikkan rekombinant DNK molekulasiga komplementarlik qonuniyati asosida nishonlangan iRNK molekulalari birikadi.

Hosil bo’lgan gibrid DNK molekulasi denaturatsiya qilinib nishonlangan iRNK molekulasi (elyutsiya yordamida) ajratib olinadi. Olingan iRNK molekulasi hujayrasiz oqsil sintez qilish tizimida tekshirib ko’riladi. Hosil bo’lgan oqsil molekulasining identifikatsiya qilish yo’li bilan individual genlarni ajratib olishga omalga oshiriladi.
2.3 Gen klonlash
Gen klonlash - bu bitta genning nusxalarini yoki klonlarini yaratish aktidir. Bir gen aniqlangandan keyin, klonlar biomedikal va sanoat tadqiqotlarning ko'plab sohalarida qo'llanilishi mumkin. Genetika muhandisligi genlarni yangi organizmalarga klonlash yoki oqsil mahsulotini o'zgartirish uchun DNK ketma-ketligini o'zgartirish jarayonidir. Genetika muhandislik quyidagi asosiy tartiblarni bajarish qobiliyatiga bog'liq.

 01 Polimeraza zanjiri reaktsiyasi

 Taq polimeraz kabi termostabl DNK polimerazlari kashfiyoti laboratoriyada DNKning replikatsiyasini o'zgartirishga imkon berdi va PCR ning rivojlanishi uchun muhim edi. Qiziqish genining har ikki tomonida ma'lum bir DNK mintaqasiga xos primerlar ishlatiladi va replikatsiya to'xtatiladi va qayta boshlanadi, bu genning millionlab nusxalarini yaratadi. Ushbu nusxalar keyin ajratilgan va jel elektroforez yordamida tozalanadi.

 02 cheklash enzimleri

Rezektsiya endonuktazalari deb ataladigan fermentlarning kashf qilinishi proteinlar bo'yicha muhandislik uchun juda zarur edi. Ushbu fermentlar nukleotid sekansına asoslangan aniq joylarda DNKni kesdi. DNKni aniq bir joyda kesishga qodir bo'lgan yuzlab turli cheklovli fermentlar turli bakteriyalar turlaridan ajratilgan. DNKning cheklash enzimi bilan kesilgani turli o'lchamdagi kichikroq qismlarni ishlab chiqaradi. Ular jel elektroforez yoki kromatografiya yordamida ajratilishi mumkin.

 03 Elektroforez

DNKni tasavvur qila olmasak, ya'ni hujayra madaniyatidan tozalovchi DNKni yoki cheklovli fermentlar yordamida kesib tashlashni istamasangiz, ya'ni sizning ekstrakangizda biror narsa bor yoki yo'qligini, uni kesib tashlang. Buning bir usuli - jel elektroforez. Jeller turli maqsadlar uchun, DNKning aniqlanishini ko'rib, DNK qo'shimchalarini va naqshlarni aniqlash uchun ishlatiladi.

 04 DNKning ikki qismiga qo'shiling

Genetika tadqiqotida ko'pincha ikki yoki undan ko'p DNKning bir-biriga bog'lanishi, rekombinatsial chok hosil qilishi yoki cheklash fermentlari bilan kesilgan dumaloq ipning yopilishi kerak bo'ladi. DNK ligasi deb ataladigan fermentlar nukleotid zanjirlari orasidagi kovalent aloqalarni hosil qiladi. DNK polimeraz I va polinukleotid kinaz fermentlari, bu jarayonda bo'shliqlarni to'ldirish yoki navbati bilan 5 'uchlarini fosforilash uchun muhimdir.

 05 Kichik o'zini o'zi takrorlovchi DNKni tanlash

Bakterial genomning tarkibiy qismi bo'lmagan, lekin o'zini takrorlash qobiliyatiga ega bo'lgan kichik dumaloq DNK parchalari plazmid deb nomlanadi. Plazmidlar mikroorganizmlar orasidagi genlarni o'tkazish uchun ko'pincha vektor sifatida ishlatiladi. Biotexnologiyada, qiziqish geni kuchaytirilgach, gen va plazmid cheklash fermentlari bilan kesiladi, ular birlashtirilgan DNK deb nomlanadigan narsalarni ishlab chiqarish bilan birlashadilar. Virusli (bakteriyofag) DNK ham kosmik, bakteriofag genlarini o'z ichiga olgan rekombinat plazmidlar kabi vektor sifatida ham ishlatilishi mumkin.

 06 Xost hujayra ichiga vektorni ko'chirish usuli

Plazmid kabi vektorda genetik materialni yangi konakçı hujayralarga uzatish jarayoni transformatsiya deb ataladi. Ushbu usul xosting hujayralarining atrof-muhit o'zgarishiga duchor bo'lishini talab qiladi, bu esa ularni "vakolatli" yoki vektorga vaqtincha o'tkazadigan qiladi. Elektroporatsiya - bunday texnikadir. Plazmid qanchalik katta bo'lsa, hujayralar tomonidan olinadigan samaradorligi past bo'ladi. Katta DNK segmentlari transdüksiya deb ataladigan usulda bakteriofagiya, retrovirus yoki boshqa virusli vektor yoki kosmid yordamida osonroq klonlanadi. Faj yoki virusli vektor ko'pincha rejenerativ tibbiyotda ishlatiladi, lekin biz istamagan xromosomalarning ayrim qismlarida DNKning kiritilishiga olib keladi, bu esa asoratlarni va hatto saratonni keltirib chiqaradi.

 Transgenik organizmlarni tanlash usullari

Barcha hujayralar o'zgarish paytida DNKni qabul qilmaydi. Bunda qiladigan narsalarni aniqlash usullari mavjud. Umuman olganda, plazmidlar antibiotik qarshiligi uchun genlarni o'z ichiga oladi va transgenik hujayralar bu genlarni ifodalash va bu antibiotikni o'z ichiga olgan vositalarda o'sishga qobiliyatiga qarab tanlanishi mumkin. Shu bilan bir qatorda selektsiya usullari x-gal / lacZ tizimi yoki rangli va floresans asosidagi selektivlikni ta'minlovchi yashil floresans oqimi kabi boshqa muxbir proteynlar mavjudligiga bog'liq.
Xulosa.

Xulosa qilib aytadigan bo’lsak, gen muhandisligi uslublari bilan aniq reja asosida mikroorganizmlar, o’simliklar, hayvonlarning yangi shakllarini yuzaga keltiruvchi genlarini konstruktsiya qilish mumkin ekan. Genlar bibliotekasini yaratish xo’jalik ahamiyatiga ega bo’lgan genlarni ajratish, ulardan individual genlarni olish va vektor molekulyar tarkibiga transformatsiya qilishi uchun zarurdir.

Adabiyotlar

1. 
   Biotexnologiya. Dunyo tamoyillari va qo'llanmalari 1988 yil.
   
2. 
   Gracheva I.M. Ferment preparatlari texnologiyasi. 2000 yil.
   
3. 
   Maurer G. "Disk elektroforez 1971 yil.
   
4. 
   Determan G. Gel xromatografiyasi 1982 yil.
   
5. 
   Biotexnologiya. Printsiplar va qo'llash 1988 yil.
   

Internet saytlar:

1. 
   https://books.google.co.uz/books?id=DTt_kgAACAAJ&dq=biotexnologiya+haqida+kitob&hl=ru&sa=X&ved=0ahUKEwiZmIanruzpAhVu-yoKHR7bDHwQ6AEIOzAD
   
2. 
   https://uz.wikipedia.org/wiki/Biotexnologiya
   
3. 
   https://fayllar.org/biotexnologiya-asoslari.html
   

1