Genomika for students

Restriksiya usuli


DNK molekulasining 5¹ uchida fosfat, 3¹ uchida gidroksil gruppa bo’ladi. Har bir restriktaza o’zining aniq taniydigan restriktsiya saytiga ega.
Restriktazalar 2 xil kesadi.
1. Yopishqoq uchlar hosil qilib (EcoRI, Hind III);
2. To’mtoqlar uchlar hosil qilib (Hae III).


Restriktsiya mexanizmlarini o’rganishning ahamiyati:
Restriktsiya mexanizmlarini o’rganish genetik tadqiqotlarni ancha soddalashtirdi.
Restriktsiyalash genetik materialni mayda bo’laklarga bo’lish imkonini berdi.
Fizik usullar (agaroza gelidagi elektroforez) yordamida mazkur bo’laklarni o’lchamiga qarab ajratish, so’ngra har birini restriktsiya xaritalarini tuzish orqali alohida o’rganish mumkin bo’ldi.
DNK ni restriktsiyalash genetik injeneriyaning asosi bo’lib, olib borilayotgan genetik tadqiqotlarda keng qo’llaniladi.
Bakteriyalar o‘rtasida DNK almashinishi keng tarqaganligi, ushbu bakteriyalar oldiga o‘z genomini saqlash vazifasiniyuklaydi. Har doimo hujayra ichiga kirgan begona DNK foydali bo‘lavermaydi. Bundan tashqari, begona genetik material hujayraga zarar yetkazishi mumkin, ayniqsa u bakterial virus yoki bakteriofagga tegishli bo‘lsa. Begona DNK bilan kurashish maqsadida bakteriyalar o‘z DNKlarini ajrata bilishlari kerak. Bunga maxsus modifitsirlovchi ferment yordamida o ‘z DNK larini “nishonlash” yo‘li bilan erishiladi. Deyarli barcha turdagi bakteriyalarda adenin yoki sitozinni ma’lum, faqatgina mazkur turga xos bo'lgan ketma-ketlikni modifitsirlovchi metilazalar mavjud. Bakteriyalardagi boshqa maxsus ferment - restriksiya endonukleazalari (restriktazalar) ana shu ketma-ketlikni parchalaydilar (kesadilar). Shu yo‘l bilan bakteriyalar ularga begona genetik material o‘tish imkoniyatini chegaralaydilar. Molekulyar klonirlashda donor va vektor DNKlarning parchalanishi maxsus uchastkalarda (saytlarda) o‘tishi kerak, natijada ma’lum fragmentlar yig‘indisi hosil bo'lishi lozim. Agar xromasoma DNKsini, ninasi kichik diametrli shpritsdan o‘tkazilsa yoki ana shu DNKga ultratovush bilan ishlov berilsa, natijada 0,3 - 5m.j.n. fragmentlari hosil bo'ladi. Afsuski, ana shu oddiy muolajalar natijasida ikki zanjirli DNK molekulasi tasodifiy yo‘l bilan parchalanadi va har bir ishlov berilgandan so‘ng, butunlay yangi DNK fragmentlarining yig‘indisi hosil bo‘ladi. Ikki zanjirli DNK molekulasidagi asoslarning maxsus ketma-ketliklarni tanib, o‘sha yerdan ikkala zanjiri kesadigan yuqori spetsifik restriktazalarni ajratib olinishi yo‘lga qo‘yilgandan keyingina molekulyar klonirlashni o‘tkazish imkoniyati yaratildi.
Eng birinchi restriktazalar Esherichia coli bakteriyasidan ajratib olinib, unga EcoRll deb nom berildi. Bu ferment DNK molekulasidagi olti juft asoslar palindrom ketma-ketligini tanib, har bir zanjirning adenin va guanin oralaridagi bog‘ni uzadi. Hozirgi vaqtda EcoRll dan boshqa bakterial hujayralardan yuzlab 11- tipdagi restriktazalar ajratib olindi va ular genlarni klonirlashda muhim ahamiyatga egadirlar. DNKni ma’lum restriktaza yordamida parchalash natijasida har doim bir xil DNK fragmentlarining yig‘ indisi hosil bo‘ladi. Agarda restriktsiyaning bir nechta fermentlaridan foydalanilsa va avval har bir restriktaza bilan alohida, keyin esa ularning kombinatsiyalari bilan DNKga ishlov berilsa, mazkur DNKning kartasini tuzish, ya’ni DNK molekulasidagi restriktsiya saytlari ketma-ketlik tartibini aniqlash mumkin. Olingan fragmentlarining gel-elektroforez yordamida
o‘lchamini aniqlab, restriktsion saytlarni joylashishini aniqlash ham mumkin.