Каллусная ткань основной объект исследований

	< Пред СОДЕРЖАНИЕ ОРИГИНАЛ След >
Способы получения каллусной ткани Каллусную ткань in vitro можно получить практически из любой живой ткани растений (рис. 2.1)^[1]. Рис. 2.1. Получение культуры каллусной ткани из различных эксплантов: сегментов стебля, корня, листа, лепестков, тычинок и других частей растений Каллусная ткань in vitro в основном бывает белого или желтоватого, реже светло-зеленого цвета. Очень редко она может иметь интенсивную зеленую окраску, как, например, у мандрагоры, а также антоциановые включения (рис. 2.2). Темно-коричневая окраска чаще возникает при старении каллусных клеток и связана с накоплением в них фенолов. Последние окисляются в хиноны. Для избавления от них в питательные среды вносят антиоксиданты. Рис. 2.2. Каллусная ткань, полученная: а — из листьев табака; б — незрелых зародышей пшеницы; в — сегментов гипокотиля стерильных проростков подсолнечника; г — листовых эксплантов картофеля Каллусная ткань аморфна и не имеет конкретной анатомической структуры, но в зависимости от происхождения и условий выращивания она может быть разной консистенции. По классификации Р. Г. Бутенко существует три типа каллусной ткани 1) рыхлая, состоящая из сильно оводненных клеток, легко распадающаяся на отдельные мелкие агрегаты; 2) средней плотности, с хорошо выраженными меристематическими очагами; 3) плотная, в которой дифференцируются элементы камбия и проводящей системы. Любой тип плотности каллусной ткани можно превратить в другой. Существует несколько приемов: замена одного ауксина на другой (например, ИУК на 2,4-Д); изменение концентрации ауксина в питательной среде; увеличение или уменьшение концентрации соли хлорида кальция в питательной среде; добавление в питательную среду ферментов (в случае если необходимо получить каллус- ную ткань рыхлого типа). Обязательным условием дедифференцировки растительной клетки и превращения ее в каллусную является присутствие в питательной среде представителей двух групп фитогормонов: ауксинов и цитокининов. Ауксины вызывают процесс дедифференцировки клетки, подготавливающий ее к делению, а цитокинины — пролиферацию (деление) дедифференцированных клеток. Если в питательную среду без гормонов поместить кусочек стебля, листа, корня (без верхушки) или любой другой растительный эксплант, состоящий из специализированных (дифференцированных) клеток, то деления клеток не произойдет и каллусная ткань не образуется. Это связано с неспособностью дифференцированных клеток к делению. Каждая клетка проходит три фазы роста: 1) деление; 2) растяжение; 3) дифференцировку. Характерной чертой заключительной фазы роста является утолщение вторичной клеточной оболочки и потеря клеткой способности к делению. Для того чтобы дифференцированные клетки вновь приобрели способность к делению, необходимо, чтобы произошла их дедифференцировка, т. е. клетки как бы возвратились в меристематическое состояние. Размножение дедифференцированных клеток приводит к анархическому, неорганизованному росту, в результате чего образуется каллусная ткань. Таким образом, превращение специализированной клетки в каллусную связано с индукцией клеточного деления, способность к которому она потеряла в процессе дифференцировки. У сердцевинной паренхимы табака (СПТ) отсутствие цитокини- нов в питательной среде блокирует клеточный цикл в премитотиче- ском периоде. Поэтому если в питательной среде присутствует только ауксин, то клетки не делятся и после четырехдневной латентной фазы переходят к росту растяжением. Одни цитокинины без ауксинов приводят к такому же старению тканей СПТ, как и на среде без гормонов. Приведенные данные, полученные для СПТ, не всегда могут объяснить всех случаев, когда каллусная ткань получается на среде с одним гормоном, например, каллусообразование на среде с 2,4-Д без цитокининов у незрелых зародышей пшеницы или получение каллуса на семядолях подсолнечника на среде с цитоки- нинами, но без ауксинов. Установлено, что результаты во многом зависят от эндогенных гормонов, содержащихся в клетках того или иного экспланта, т. е. связаны с особенностями их гормонального статуса. Имеются новые представления, согласно которым не ауксины и цитокинины, а полисахариды и какие-то другие индукторы вызывают деление клеток, приводящее к образованию каллуса. Процесс перехода к каллусному росту в базальной части апекса начинается с остановки клеточных делений. Лаг-фаза продолжается 24—48 ч. В течение этого времени клетки увеличиваются в размерах и ткань разрыхляется. После лаг-фазы клетки начинают быстро делиться, образуя каллусную ткань. Таким образом, если дедифференцировка специализированной клетки связана с индукцией деления под влиянием фитогормонов, то дедифференцировка делящейся меристематической клетки связана с остановкой делений, деспециализацией клетки и только после этого — с индукцией делений, приводящей к каллусообразованию. Эффект, вызываемый действием одних и тех же фитогормонов, может быть различным в зависимости от физиологической характеристики ткани-мишени. Компетентность ее определяется степенью дифференцировки клеток.

Культивирование каллусной ткани в условиях in vitro
Переход клетки in vitro из дифференцированного состояния к дедифференцировке и активным клеточным делениям обусловлен изменением активности генов (эпигеномной изменчивостью). Активирование одних генов и репрессирование других приводит к изменению в белковом составе клеток. В каллусных клетках появляются специфические белки и одновременно исчезают или уменьшаются в количестве белки, характерные для фотосинтезирующих клеток листа. У двудольных растений процесс репрессии и дерепрессии генов, лежащий в основе дедифференцировки, происходит легче, чем у однодольных.
При переходе дедифференцированной клетки к неорганизованному анархическому размножению, приводящему к образованию каллусной ткани, в клетках происходят биохимические и цитологические изменения. Дедифференцировка начинается с использования запасных веществ и разрушения специализированных клеточных органелл. Через 6—12 ч после индукции дедифференцировки клеточная стенка разрыхляется и разбухает, увеличивается число свободных рибосом, число элементов аппарата Гольджи, а также размеры и число ядрышек. Все эти изменения предшествуют делениям, которые начинаются через 48—72 ч. Следует учитывать, что в клетках экспланта в начале культивирования могут наблюдаться изменения в метаболизме, вызванные как дедифференцировкой, так и травматическими синтезами. Для разделения этих процессов лучше проводить предынкубацию экспланта на безгормональной среде 3—6 сут. Каллусная клетка имеет свой цикл развития и повторяет развитие любой клетки, включая деление, растяжение и дифференцировку, после чего наступает старение и отмирание клетки. Каллусную дифференцировку можно назвать вторичной, но ее не следует путать со вторичной дифференцировкой клетки, лежащей в основе морфогенеза.
Для того чтобы не произошло старения, утраты способности к делению и отмирания каллусных клеток, первичный каллус, возникающий на эксплантах, через 4—6 недель переносят на свежую питательную среду. Эту операцию называют пассированием. При регулярном пассировании способность к делению может поддерживаться в течение десятков лет.
Ростовая кривая каллусных клеток имеет S-образную форму (рис. 2.3).