Mavzu: Mikroorganizmlardan nuklein kislotalarni ajratish usullari

Mavzu: Mikroorganizmlardan nuklein kislotalarni ajratish usullari

Bakteryalarda hujayra hromosoma DNKsidan tashqari halqasimon tuzulishga ega bo’lgan DNK molekulalari bo’lib ular plazmidlar deyiladi. Plazmidlar tarkibida zaharli moddalarga, antibiotiklarga chidamlilik geni mavjud. Ular mustaqil ravishda replikatsiyalana oladi. Shu hususiyati tufayli plazmidlardan gen muhandisligida vektor sifatida foydalanish mumkin. Plazmidlarni ajratish asosan 3 ta bosqichdan iborat.

1.Bakteriya hujayralarini parchalanish (lizes qilish)

2. Plazmid DNKsini xromasoma DNKsidan ajratish.

3. Plazmid DNKsini hujayra RNKsidan va oqsillardan tozalash.

Material va asbob uskunalar: E. coli bakteriyasi kloin, LB ozuqa muhiti, 1-eritma (50mm saharoza, 25 mm tris HCl , pH 8,0, 10mm EDTA ) , 2-eritma (0.2 n Na OH, 1% SDS ), 5M kaliy atsetat pH 4.8 (60 ml 5M kaliy atsetat tayorlash uchun 11.5 ml sirka kislotasi, 28.5 ml distirlangan suv), 1ml 96 %-li etil sipirti, TE- buferi, muzlatgich, stol tsentrafugasi, 4 ta ependorf probirkalari, steril shisha tayoqcha, parafilm, filtir qog’ozi, 1ml-li avtomat pipitka.

Ishning borishi.

1. Tanlangan koloniyani mikrobiyologik sirtmoq yordamida 3 ml LV ozuqa muhiti va antibiotikli probirkaga solinadi va bir kecha davomida 37o C temperaturada o’stiriladi.

2. 1,5 ml tungi kulturani eppendorf probirkasiga solinadi va stol sentrofugasida 15 daqiqa 5000 ayl/daq aylantiriladi.

3. Chokmaga 100 mkl (mikrolitr) 1 – eritma solinadi va aralashtiriladi.

4. Tezda 200 mkl 2 – eritma solinadi va 5 daqiqa yaxshilab aralashtirilganidan so’ng muz hammomda 15 daqiqa saqlanadi. Bunda suspenziyaning rangi oqarib shilimshiq holiga kelishi kerak.

5. Ustiga sovutilgan 150 mkl 3 M natriy atsetat ( pH 4,8 – 5,0 ) solinadi va yaxshilab aralashtiriladi, bunda oq cho’kma tusha boshlaydi. (oqsil va xromosoma DNK si). daqiqa 5000 ayl/daq. Sentrofugalanadi.

6. Cho’kma steril shisha tayoqcha yordamida olib tashlanadi va suyuq qismiga 1 ml 96 % li etil spirit solinadi va plasmid DNK si cho’kmaga yaxshi tushishi uchun sovutgichga qo’yiladi. 2 soatdan so’ng 3 min davomida 3000 ayl/daq sentrofugalanadi. Cho’kma xona haroratida quritilib, 150 mkl TE buferida eritiladi va plasmid DNK si elektroforez yordamida tekshiriladi.