Методы изучения биоплёнок 2 Методы культивирования биоплёнок Генетические методы изучения биоплёнок Методы выявления биоплёнок

3. Методы выявления биоплёнок

В настоящее время наиболее надежным методом подтверждения наличия микробной биопленки является специальная микроскопия. В первую очередь это конфокальное лазерное сканирующее микроскопическое исследование.

Принцип действия микроскопа заключается в том, что рефлексируемое изображение, получаемое через объективы в результате преломления по системе зеркал, поступает на детектор, который обрабатывает приходящие лучи, составляя изображение, передаваемое на монитор компьютера. При помощи движения лазерного луча происходит послойное сканирование исследуемого объекта. Изображение, получаемое на мониторе CLSM по отношению к световому микроскопу, имеет зеркальное отображение под углом 90°.
Объёмное изображение в LSCM получается при помощи регистрации флуоресценции в фокусе лазерного луча. Излучаемые фотоны фокусируются объективом на небольшом отверстии, которое ослабляет флуоресцентный сигнал от участков, находящихся не в фокусе.
Применение конфокальной сканирующей лазерной микроскопии для исследования биопленок радикально изменило восприятие их структурных и функциональных особенностей. Этот метод дал возможность исследовать биопленки in situ без ограничений, с которыми сталкивается электронная микроскопия(технология подготовки образцов приводила к их обезвоживанию и разрушению, хотя и при более низких увеличениях. С помощью конфокальной сканирующей лазерной микроскопии показано, что биопленки - не структурно гомогенные монослои микробных клеток на поверхности. Скорее они могут быть описаны как гетерогенные во времени и в пространстве структуры, однако основная структура сообщества универсальна, с некоторыми незначительными вариациями.
Оценить значение ЛСКМ в современных методах изучения биоплёнок можно на примере работы И.В. Чеботарь с соавт. «Современные технологии исследования бактериальных биоплёнок».
Объектом исследования был придонный слой бульонной культуры клинического изолята коагулазопозитивного стафилококка.
Микроскопическое исследование проводили с помощью лазерного сканирующего (конфокального) микроскопа LSM 510 Meta. Непосредственно в чашке Петри слой стафилококков окрашивали флюорохромными красителями. Полученные изображения реконструировали и анализировали при помощи компьютерной программы ZeissLSM Image Browser. Визуализация биопленки с помощью конфокальной выявила характерную для биопленок трехмерную .Толщина двухсуточной биопленки S. aureus колебалась от 20 до 47 мкм.
Отдельная серия микроскопических исследований подвижности биопленочных стафилококков (с аналогичной флюорохромной окраской) была проведена с применением технологии «резонансный сканер» на лазерном сканирующем (конфокальном) микроскопе TCS; изображения были восстановлены при помощи программного обеспечения LAS AF Lite. Микроскопическое наблюдение за живой биопленкой в режиме реального времени позволило обнаружить особый вид хаотического (теплового) движения стафилококков, находящихся в ее составе. Некоторые стафилококки, являясь микроскопическими частицами, совершали хаотические колебания внутри ограниченного объема, соизмеримого с их размерами. При этом стафилококки могли не иметь прямых контактов с соседними клетками. В отличие от классического броуновского движения перемещения стафилококков были ограничены. Это свидетельствовало о том, что стафилококки механически связаны между собой, и являлось косвенным подтверждением существования необходимого атрибута любой биопленки - внеклеточного матрикса, связывающего биопленочные микробы между собой и с подлежащей поверхностью.
Для ультраструктурных исследований рельефа биопленки использовали сканирующий электронный микроскоп JSM 6390А. Фиксацию препарата осуществляли при 4оС в два этапа. Вначале проводили предфиксацию (30 мин) образца в 2,5% растворе глутарового альдегида (рН=7,2) с последующим троекратным отмыванием дистиллированной водой. Затем препарат фиксировали (30 мин) 0,5% раствором OsO4 с последующим троекратным отмыванием в дистиллированной воде. После этого препарат криофиксировали в жидком азоте (-196°С) и подвергали низкотемпературной дегидратации (-100°С) в высоком вакууме в течение 24 ч. После лиофилизации препарат монтировали на держатель электронного микроскопа и на его поверхность методом ионного распыления в аргоновой плазме наносили слой платины (10 нм). Сканирующая электронная микроскопия проводилась при увеличении от 1000 до 10000 раз. В пространственном расположении стафилококков прослеживались два уровня организации. Первый уровень связан с тем, что стафилококки формировали кластеры, включающие от 9 до 55 клеток. На более высоком уровне организации стафилококковые кластеры формировали единую надкластерную структуру, состоящую из многих слоев, - биопленку. Массив биопленки пронизан многочисленными каналами, устья которых открывались на внешнюю (исследуемую) поверхность биопленки. Через просветы каналов не видно подложки, на которой сформировалась биопленка. На 100 мкм2 поверхности биопленки открывается в среднем от 4 до 6 устьев каналов. В образовании стенок каналов в районе устьев принимают участие от 9 до 27 стафилококков. Между стафилококками наблюдалось два типа контактов: непосредственное взаимодействие, с помощью которого формируются кластеры, и матрикс-опосредованные связи. Последние обнаруживались при увеличении от 3000 до 15 000: между отдельными стафилококками существовали необычные «перемычки» - структуры биопленочного матрикса, связывающие бактерии друг с другом. Клеточная поверхность большинства стафилококков - ровной округлой формы, исключения составляли участки клеточной поверхности, связанные с внеклеточным матриксом. Эта поверхность была неровной, матрикс представлял собой неструктурированную, неоформленную субстанцию. Следует отметить, что биопленочный матрикс в условиях in vitro может быть образован как активно секретируемыми бактериальными полимерами, так и дериватами клеток, полученными в результате аутолиза.[8]
Другие методы основаны на сорбции молекул красителя на структурах биопленки, с последующей их отмывкой (десорбцией) в органические растворители. Такой способ индикации биопленок наиболее часто используется в статических методах культивирования микробных биопленок и позволяет дать условную количественную характеристику образовавшимся микробным сообществам, т.е. чем больше образуется матрикс биопленки, тем больше красителя сорбируется на его поверхности и тем выше оптическая плотность образца.[5]
Подобный метод был использован в работе Л. В. Лагун с соавт.
«Интенсивность образования микробных биоплёнок микроорганизмами, выделнными при пиелонефритах и мочекаменной болезни»
В исследовании использовали суточные культуры микроорганизмов, выращенные на агаре Мюллера-Хинтона. Посевы инкубировали в шейкере-инкубаторе при 37 °С в течение 24 ч, после чего бульонную культуру осторожно удаляли и вносили в пробирки 1 мл 0,1% водного раствора кристаллического фиолетового для окрашивания сформированных биопленок. Окрашивание проводили при 37 °С в течение 30 мин. Далее, полностью удалив из пробирок раствор кристаллического фиолетового, проводили экстракцию красителя из биопленки в 1 мл 96% этанола в течении 1 часа при комнатной температуре.
Измерение биолюминесценции (BPI) - достаточно новый метод изучения и детекции биопленок, который можно использовать как in vitro, так и in vivo. При искусственном введении в бактерии плазмид, ответственных за синтез люминесцирующего белка, можно проводить визуализацию как адгезированных бактерий, так и матрикса биопленки .
Метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) также стал сравнительно недавно использоваться для изучения биопленок в медицине (этот метод часто совмещается с методом CLSM). Метод гибридизации применяют для детекции и определения расположения специфических мРНК в клетках, образующих биопленки, что позволяет установить пространственно-временные особенности экспрессии генов в бактериях. С помощью этого метода была определена неоднородность бактерий в биопленке и выявлены клетки-персистеры, ответственные за выживание популяции во время воздействия летальных для основной массы клеток факторов.