Методы изучения биоплёнок 2 Методы культивирования биоплёнок Генетические методы изучения биоплёнок Методы выявления биоплёнок

Заключение.

Таким образом в работе были рассмотрены ультроструктура и этапы формирования биоплёнок, а так же представлены механизмы взаимодействия микроорганизмов между собой и с окружающей средой в составе биоплёнок.

Биопленка - микробное сообщество, характеризующееся клетками, которые прикреплены к поверхности или друг к другу, заключены в матрикс синтезированных ими внеклеточных полимерных веществ. Отличительными особенностями биоплёнки, по сравнению с колониями микроорганизмов, являются наличие внеклеточного матрикса, наличие у бактерий генов, контролирующих биопленкообразование, сложная архитектурная структура.
Выделяют пять стадий существования биоплёнки: первичная и вторичная адгезия, созревание, рост, дисперсия. Адгезия к биологическим поверхностям обусловливается специфическим взаимодействием белков-адгезинов или лектинов фимбрий экзоплазматического компартмента бактериальной клетки с рецепторами или определенными доменами поверхности мембран хозяйских клеток. У грамположительных микроорганизмов одним из важнейших элементом в процессе адгезии является (Polysaccharide Intercellular Adhesin) (PIA) - полисахарид, который участвует как в клеточной субстратной адгезии, так и в последующем формировании клеточных кластеров (клеточно-клеточная адгезия). У грамотрицательных микроорганизмов важную роль в адгезии и клеточной агрегации играют жгутики и фимбрии IV типа.
Одним из основных компонентов биоплёнки является экзополисахаридный матрикс, который содержит такие полисахариды как декстран, гиалуроновую кислоту, целлюлозу. Концентрация других химических компонентов очень сильно варьирует. Доля белков может составлять до 60%, липидов до 40% и нуклеиновых кислот 1-20%. Данные соединения находятся в гидратированном состоянии, так как 80-90% объема биопленки занимает вода.
Клетки в слизистом матриксе располагаются не хаотически, а определенным образом. Структура многоклеточных кластеров представлена в виде грибоподобных, столбоподобных образований, «цементированных» в экзополисахаридный слой.
Биопленки, как правило, представляют собой гетерогенные сообщества, состоящие из микроорганизмов разных физиологических групп. Многократно было показано, что биопленки, состоящие из микроорганизмов разных таксонов, прочнее и толще, чем биопленки, состоящие из микроорганизмов одного вида.
Формирование, рост, миграция планктонных форм клеток для колонизации в биопленках регулируются на уровне популяции посредством механизмов межклеточной коммуникации. «Quorum sensing» (QS) - это процесс коллективной координации экспрессии генов в популяции бактерий, опосредующий специфическое поведение клеток. Механизм работы QS основан на сложной иерархической регуляции целевых локусов генома бактериальной клетки. При этом регуляция осуществляется на разных уровнях воздействия: транскрипционном, трансляционном, посттрансляционном.
Биоплёнки играют значительную роль в возникновении и развитии инфекционного процесса. Данные свидетельствуют о том, что хронические инфекции принципиально отличаются от острых образованием биопленок, а фагоциты макроорганизма неспособны поглощать биопленки в отличие от отдельных бактериальных клеток. Биоплёнки так же являются одной из причин повышения устойчивости бактерий к антибиотикам.
В последнее десятилетие произошло значительное расширение возможности изучения формирования микробных биопленок. Основное направление этих исследований связано с разработкой методов культивирования микроорганизмов в динамических и статических условиях.
К динамическим можно отнести методы с использованием лабораторных ферментеров, культивирование в аппарате Робинсона, проточный метод. Основным преимуществом динамических методов формирования биопленок является максимальное приближение к условиям живых систем.
Вторая группа методов основана на создании статических условий культивирования микроорганизмов. К ним можно отнести метод с применением 96-луночных пластиковых планшетов, ALI-метод, метод гидроксиапатитовых дисков.
Для выявления степени различий в экспрессии генов и, соответственно, в белковых составах клеток на разных стадиях развития биопленки, используют различные методы гинетического исследования с использованием флуоресцентных белоков, плазмидного экспрессионного вектора, сравнительного анализа состава мРНК и белков в клетках планктонных и биопленочных бактерий.
В настоящее время наиболее надежным методом изучения микробной биопленки является специальная микроскопия. В первую очередь это конфокальное лазерное сканирующее микроскопическое исследование. Применение КЛСМ для исследования биопленок радикально изменило восприятие их структурных и функциональных особенностей. Этот метод дал возможность исследовать биопленки in situ без ограничений, с которыми сталкивается электронная микроскопия.
Ещё одним методом изучения биоплёнок является измерение биолюминесценции (BPI) . Это достаточно новый метод изучения и детекции биопленок, который можно использовать как in vitro, так и in vivo. Он позволяет проводить визуализацию как адгезированных бактерий, так и матрикса биопленки .
Метод флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) также стал сравнительно недавно использоваться для изучения биопленок в медицине. Данный метод применяют для детекции и определения расположения специфических мРНК в клетках, образующих биопленки, что позволяет установить пространственно-временные особенности экспрессии генов в бактериях.
Другие методы основаны на сорбции молекул красителя на структурах биопленки, с последующей их отмывкой (десорбцией) в органические растворители.


Список литературы

1. 
   Албертс, Б.А. Молекулярная биология клетки / Б.А. Албертс. - М.: Мир, 1987. – 268 с.
   
2. 
   Дюв, К.Д. Путешествие в мир живой клетки / К.Д. Дюв. – М.: Мир, 1987. – 245 с.
   
3. 
   Зенгбуш, П.А. Молекулярная и клеточная биология. В 3-х т. / П.А. Зенгбуш. - М.: Мир, 1982. – 204 с.
   
4. 
   Ленинджер, А.В. Основы биохимии. В 3-х т. / А.В. Ленинджер. - М.: Мир, 1985. – 442 с.
   
5. 
   Страйер, Л.В. Биохимия. В 3-х т. / Л.В. Страйер. - М.: Мир, 1985. – 303 с.
   
6. 
   Третьяк, А. П. Молекулярная биология / А.П. Третьяк. - Чернигов.: 1999. – 380 с.