Nyukasl kasalligiga ifa reaksiyasida test o’tkazish bajarilish tartibi

NYUKASL KASALLIGIGA IFA REAKSIYASIDA TEST O’TKAZISH

Bajarilish tartibi. Qon zardobidagi antitelolar miqdorini o’lchash test tizimi hisoblanadi. Testda virus antigeni shimdirilgan 96 chuqurchali planchetda o’tkaziladi. Inkubatsiya qilish vaqtida chuqurchalarda antigen va antitelolarga quyish bilan tekshirilayotgan namunalarni inkubatsiya davrida kompeks antigenlar hosil qiladi. Namunada antitelolar bo’lmasa unda kon’yugat erkin holatda (lunka) chuqurchaning yuza qismida birikadi. Undan keyin bog’lanmagan kon’yugat yuvib tashlanadi va substrat quyiladi. Namunadagi navbatdagi bo’yash antitelolarga teskari proporsionallikda olib boriladi.

Reagentlar

Barcha reagentlar 2-8 ⁰C da saqlanadi.

Reagentlar:

Reagentlar			Miqdori
1	Planshetlar, antigen shimdirilgan	5
2	Musbat nazorat	2,0 ml
3	Manfiy nazorat	2,0 ml
4	Kon’yugat	55 ml
5	Namunani suyultirish uchun buffer eritma	235 ml
6	TMV substrat	60 ml
7	Stop reagent	60 ml
8	Yuviladigan konsentrat (10 marta)	235 ml

Qo’yish tartibi

Barcha komponentlarni ishlatishdan oldin harorati 18-26 ⁰C bo’lgan joyga chiqarib qo’yish lozim. Reagentlarni ishlatishdan oldin sekinlik bilan aralashtirib olish kerak. Har bir namunani aralashtirishda nakonechniklarni almashtirish kerak.

1. planshetlarni tayyorlash va ularga yozish

2. namunani qo’yish ikki lunkaga K^- 100 mkl dan quyiladi

3. namunani qo’yishda ikkita lunkaga K⁺ 100 mkl dan quyiladi

4. tayyorlangan zardobdan bir necha (2 yoki 3) lunkaga 100 mkl dan quyiladi

5. 60 daqiqada (±5 daq.) 18-26 ⁰C da saqlanadi, usti yopiq holda

6. har bir lunkani 3-5 marotaba yuvish (taxm. 350 mkl eritma ketadi)

7. har bir lunkaga 100 mkl dan Kon’yugat (xren peroksidaza, antigen va antitelo bog’lanishi uchun) quyiladi

8. 30 daqiqa (±2 daq.) 18-26 ⁰C da saqlanadi

9. yuvish jarayoni yana 6 marta

10. har bir lunkaga 100 mkl dan TMV substati quyib chiqiladi

11. 15 daqiqada (±1 daq.) 18-26 ⁰C da saqlanadi

12. har bir lunkaga 100 mkl dan Stop eritmadan quyib chiqiladi, reaksiyani oxirgi bosqichi ya’ni to’xtatish uchun

13. spektrofotometrni to’g’rilab olish

14. namunalarni 650 nm o’lchamdan olib boriladi. Ularning optic zichligini yozish

15. natjalarni hisoblash
1. maxsus immunoglobulinlar (immune zardobdan ammoniy sulfat bilan cho’ktirib, keyin tozalab olinadi)

2. turga qarshi globulinlar (giperimmun zardobdan ammoniy sulfat bilan cho’ktirib, keyin tozalab olinadi).

3. oqsil A (tilla rang stafilakokkdan olinadi) yoki ho’kiz zardobi albumin

4. antigen (zararlangan hayvonlar organlaridan tayyorlanadi). Oldindan ma’lum bo’lgan musbat va manfiy antigenlar.

5. peroksidaza fermenti (xrendan olinadi)

6. kon’yugat (periodatli oksidlanish usulida antitelo yoki antigenbilan bog’langan peroksidaza)

7. substratli aralashma (5- aminosalitsil kislota va vodorod peroksidi yoki ortofenilindiamin va vodorod perikisi)

8. detergent (sirtga faol moddalar: tvin 20, -SO, triton X -100, Sorbital S – 20).

9. Immunologik planshet (shaffof polistroldan tayyorlangan)

10. Dozator (reaksiya ingredientlarini quyish uchun). Reaksiyani qo’yishning bevosita va bilvosita usullari mavjud.

Amalyotda asosan bilvosita usul qo’llaniladi.

Antigenni immunoferment usulida aniqlash. Reaksiyani qo’yishdan avval, liofillangan komponentlar yorlig’ida ko’rsatilgan hajmda 0,01 M fosfatli buffer eritma yoki distillangan suv bilan eritiladi va ishchi eritma hajmiga yetkaziladi. Planshet o’yiqchalarga bosqichma bosqich solinadigan komponentlar o’zaro teng hajmda bo’lib 0,1 ml ni tashkil etadi.

Reaksiya bosqichda:

1. 
   Planshetni sensibillash. Pilanshet o’yiqchalaga maxsus antitelolar (immunoglobulinlar) yorlig’ida ko’rsatilgan ishchi eritmasi qo’yiladi. Planshet antitelolar bilan uch soat termostatda 37 ⁰C da qo’yiladi. Keyin planshetlar tvinli fosfat buferli eritmasi bilan 3-4 marta yuviladi. Eritmaning qoldiqlari filtr qog’ozga planshetni bir necha bor qoqib olinadi.
   
2. 
   Antigen quyish. Maxsus antitelalar bilan sensibillangan planshet o’yiqchalarida nazoratli musbat va manfiy antigenlar hamda 1:10 dan 1:1280 nisbatgacha suyultirilgan sinovli namunani quyib, termostatda 37 ⁰C da 1 soat qo’yiladi. Inkubatsiya muddati o’tishi bilan planshet o’yiqchalaridagi antitelo bilan bog’lanmay qolgan antigenlarni 3 marta yuvib, filtr qog’ozda quritiladi.
   
3. 
   Antigen + antitelo kompleksini aniqlash uchun suyultirmalarga turga qarshi perosidazali kon’yugatni quyish. Kon’yugat quyib chiqilgach planshetlar termostatga 37 ⁰C da 1 soat qo’yiladi. Keyin o’yiqchalarni uch marta tvinli fosfatli bufer bilan yuvib quritiladi.
   
4. 
   Substratli aralashmani quyish. Reaksiya namoyon bo’lishi uchun planshet o’yiqchalariga substrat eritmasi (peroksidaza indikatori) – ortofenildiamin quyiladi. Eritmaga antigen + antitelo – kon’yugat kompleksini aniqlash uchun 3 % li vodorod peroksid eritmasi qo’shiladi. Planshetlarni yopib qorong’u joyda xona haroratida 15-30 daqiqa qoldiriladi.
   
5. 
   Reaksiya ko’rish orqali yoki spektrofotometrik usulda hisobga olinadi. Reaksiya ko’rish orqali baholanganda kesishmalar soni bilan ifodalanadi:
   

Ikki va undan ortiq nishonga baholangan namuna musbat hisoblanadi. Maxsus antitelo bilan reaksiyada eng yuqori suyultirishda planshetning nazoratli o’yiqchalari rangidan intensivligi yuqori bo’lib, och sabzi rang bo’yalsa (++), antigen titri hisoblanadi.

Reaksiya natijalarini spektrofotometrik hisobga olishda maxsuslik koeffisienti hisoblanadi. U o’yiqchalardagi reaksiya mahsulotlarining nazoratli musbat antigen (OZ1) optik zichligi (OZ) o’yiqchalardagi substratli aralashmani nazoratli manfiy antigenli (OZ2) optik zichligi nisbatiga teng.

Maxsuslik koeffisienti 2,1 dan kam bo’lmasa reaksiya musbat, 2,1 dan kam bo’lsa manfiy hisoblanadi. Antitelolarni aniqlash (yoki titrlash) uchun immunofermentli usulni qo’yish texnikasi mikrob antigenini aniqlash va qiyoslash singari bajariladi, farqi shundaki, material sifatida tekshiriladigan qon zardobi ishlatiladi.