Tadqiqot metodologiyasi

Peroksidaza
Tadqiqot metodologiyasi
Tadqiqot davomida 0,05 M fosfat tampon (pH 7) bilan ekstraksiya paytida bahorgi yumshoq bug'doy navining Ivolga navining unib chiquvchi donalaridan ajratilgan peroksidazalar tomonidan katalizlangan tirozin peroksid oksidlanishining fermentativ reaktsiyasi davomida atrof-muhit sharoitlari optimallashtirildi. Bug'doy donalari 25 ° C haroratda suvda unib chiqdi. 1 g o'simlik materialining og'irligi 10 ml fosfat buferi bilan ohakda bir hil holga keltirildi va keyin mexanik aralashtirgichda 15 yoki 30 daqiqa davomida aralashtiriladi. Olingan aralash 12000 g da santrifüj qilindi.
Enzimatik reaksiyani amalga oshirish uchun 1, 2, 3 ml ekstrakt namunalari olindi. Tajribaning dastlabki ikki variantidagi ekstraktning umumiy hajmi fosfat buferi bilan 3 ml ga o'rnatildi. Tekshirish variantlarida ferment oqsillari qo'shilishi bilan faollashtirilmagan ferment ekstraktiga 5 ml 10% li sulfat kislota eritmasi. Nazorat va eksperimental namunalardagi ferment eritmasiga 0,06 mg/ml konsentratsiyali 5 ml tirozin eritmasi va 1 ml 1% yoki 2% vodorod periks eritmasi qo'shildi. Enzimatik reaksiya 10-30 daqiqa davomida 25-40 ° S haroratda harorat bilan boshqariladigan suv hammomida amalga oshirildi. Belgilangan vaqtdan keyin fermentlarni faolsizlantirish va fermentativ reaktsiyani to'xtatish uchun faol ferment bilan namunaga 5 ml 10% sulfat kislota eritmasi qo'shildi. Zarur bo'lganda, fermentativ reaktsiyadan so'ng olingan aralashma suyultirilib, 280 nm to'lqin uzunligida 0,1-0,7 optik zichlik oralig'ida spektrofotometrda tirozin kontsentratsiyasini eng aniq o'lchashga erishiladi. Dastlabki reagentdagi tirozin kontsentratsiyasi xuddi shu printsip yordamida tanlangan.
Biz ishlab chiqqan metodikadan foydalanib, bug‘doy donlarining unib chiqishida, shuningdek, ko‘chatlar nihollari va ildizlarida peroksidaza faolligi dinamikasini o‘rgandik. Bundan tashqari, vazni bo'yicha farq qiluvchi donlarning urug'lik sifatini baholash uchun unib chiqadigan don va ko'chatlarda peroksidazalarning faolligi ishlatilgan. Peroksidazalarning faolligi 1 g o'simlik massasiga (urug'larning havo-quruq massasi va ko'chatlarning nam massasi) nanokataloglarda ifodalangan.
Eksperimental materialni statistik qayta ishlash K.A nomidagi Rossiya davlat agrar universiteti-Moskva qishloq xo'jaligi akademiyasining axborot-hisoblash markazining modifikatsiyasida "Straz" kompyuter dasturi yordamida dispersiya usuli yordamida amalga oshirildi. Timiryazev (2.1-versiya, 1989-1991).
Tadqiqot natijalari
Tadqiqotning birinchi bosqichida ferment oqsilining kontsentratsiyasiga qarab peroksidaza faolligining o'zgarishi aniqlandi. Peroksidazalarni ajratib olishda 10 ml fosfat tamponi gomogenlashtirilgan o'simlik moddasi (uch kunlik ko'chatlar donasi) namunasiga qo'shilgan va bu eritmaning bir qismi tirozin peroksid oksidlanishini amalga oshirish uchun o'simlik namunasi bilan bog'langan. reaktsiya uchun 3 ml ferment ekstraktining ikkita parallel namunasini imkon qadar ko'proq olish mumkin edi: bitta namuna - faol ferment bilan reaktsiya uchun, ikkinchisi faol bo'lmagan ferment bilan reaktsiya uchun (5 ml 10% sulfat kislotasi) eritma qo'shildi).
Tajribada 3 ta variant o‘rganilib, unda tirozinni vodorod peroksid bilan oksidlash uchun peroksidazalarning ferment ekstraktidan 1, 2 va 3 ml dan olindi (1-jadval) va reaksiya 35° haroratda olib borildi. C 15 daqiqa davomida. 1% vodorod periks eritmasi yordamida. Elektromexanik aralashtirgichda ferment oqsillarini ekstraktsiya qilish muddati 15 minutni tashkil etdi. 1-jadvaldagi ma'lumotlardan ko'rinib turibdiki, 280 nm to'lqin uzunligida nazorat (Bq) bilan solishtirganda, fotometrli namunaning (Bo) optik zichligining pasayishi bilan kuzatilgan peroksidazalarning eng katta faolligi 280 nm. 3 ml ferment ekstrakti bilan variant.