Учебное пособие для самостоятельной подготовки к экзамену по микробиологии, вирусологии и иммунологии

29. Методы выделения чистых культур анаэробных бактерий.
Культивирование анаэробов требует специальных условий, т.к. эти микробы необходимо лишить доступа свободного кислорода. В питательные среды, используемые для посева анаэробов, добавляют вещества, которые поглощают кислород из среды и снижают его концентрацию: глюкозу 1-2%, аскорбиновую кислоту – 0,08%. Все питательные среды перед посевом регенерируют, т.е. кипятят на водяной бане не менее 15 минут и быстро охлаждают, удаляя, таким образом, воздух, содержащийся в среде. Среду после посева заливают слоем вазелинового или парафинового масла, чтобы предупредить доступ кислорода. Культивируют анаэробы в бескислородных условиях.
Выделение чистых культур анаэробных бактерий
1 этап. Накопление материала.
Исследуемый материал, предварительно прогретый в течение 15 мин при 80°С для уничтожения вегетативной флоры (споры анаэробов при этом не гибнут), засевают на среду Кита-Тароцци и ставят в термостат.
2 этап. Выделение чистой культуры.
После суточного инкубирования в результате роста микробов среда мутнеет, иногда в ней видны пузырьки газа. Выделение культуры проводят или по методу Цейсслера или по методу Вейнберга.
Метод Цейсслера. Каплю материала со среды Китта-Троцц помещают в чашку с кровяным сахарным агаром, тщательно распределяют его по поверхности среды шпателем, затем этим же шпателем делают посев во второй и третьей чашке. Сутки инкубируют чашки в термостате в анаэробных условиях. На следующий день по форме колоний и морфологии микробов, изученной в мазках, окрашенных по Граму, ориентировочно определяют вид бактерий, изученные колонии пересевают на среду Кита-Тароцци для выделения чистой культуры и точного определения виды микроорганизмов.
Метод Вейнберга. 1-2 капли материала со среды Кита-Тароцци вносят в пробирку с МПБ для разведения. Затем пастеровской пипеткой с запаянным концом переносят материал последовательно в 3-5 узких пробирок с сахарным МПА, предварительно расплавленным и прокипяченным в течение 20 мин и остуженным до 50°С, погружая капилляр пипетки в расплавленный агар до дна пробирки. Засеянные пробирки быстро охлаждают под струей холодной воды, при этом агар застынет и зафиксирует разобщенное положение отдельных микробных клеток. Инкубируют в анаэробных условиях. Через сутки отбирают колонии, на уровне колонии пробирку распиливают, колонию отсасывают пипеткой и переносят в среду Китта-Троцци для накопления и идентификации.