Учебное пособие Якупов Т. Р. Молекулярная биотехнология Биоинженерия Казань 2016

3. Ферменты генной инженерии
В генетической инженерии используется большая группа ферментов. Успехи генетической инженерии стали возможны, прежде всего, благодаря изучению ферментов, позволяющих проводить химические операции с генетическим материалом. В генетической инженерии ферменты служат инструментами молекулярного манипулирования с генетическим материалом, где они выступают в роли "скальпеля", "ножниц" и "ниток для сшивания". Ферменты, применяемые при конструировании рекомбинантных ДНК, можно разделить на несколько групп:
- ферменты, с помощью которых получают фрагменты ДНК (рестриктазы);
- ферменты, синтезирующие ДНК на матрице ДНК (полимеразы) или РНК (обратные транскриптазы);
- ферменты, соединяющие фрагменты ДНК (лигазы);
- ферменты, позволяющие осуществить изменение структуры концов фрагментов ДНК.

Рестриктазы
Рестриктазы – специфические эндонуклеазы, расщепляющие молекулу ДНК в строго определенных точках – сайтах рестрикции. Впервые были выделены из Е. coli в 1968 г.
Основной характеристикой рестриктаз является их субстратная специфичность. Сейчас известны следующие основные проявления специфичности этих ферментов: узнаваемая последовательность, место расщепления, зависимость действия рестриктаз от метилирования оснований в пределах узнаваемой последовательности.
Узнаваемая последовательность нуклеотидов в молекулярной биологии называется - сайт рестрикции и является наиболее важным параметром рестриктаз. Сайт рестрикции характеризуется последовательностью нуклеотидов, их числом, а также типом строения. Для большинства участков, узнаваемых рестриктазами, характерна вращательная симметрия второго порядка, т. е. они являются палиндромами. Несмотря на то, что  все рестриктазы узнают на ДНК строго определенные последовательности, различают 3 основных класса рестриктаз.
Рестриктазы 1-го класса осуществляют разрывы в произвольных точках молекулы ДНК, точнее на произвольном от сайтов рестрикции расстоянии.
Рестриктазы 3-го класса узнают и расщепляют ДНК на фиксированном от сайтов рестрикции расстоянии.
Рестриктазы 2-го класса расщепляют ДНК только внутри сайтов узнавания.
В молекулярной биотехнологии в целом, и в генной инженерии в частности, используются исключительно ферменты второго класса. В настоящее время выделено около 500 рестриктаз этого класса.
Большинство рестриктаз класса 2 узнают последовательности, содержащие от 4 до 6 нуклеотидных пар, поэтому рестриктазы делят на мелко- и крупнощепящие. Мелкощепящие рестриктазы узнают тетрануклеотид и вносят в молекулы гораздо больше разрывов, чем крупнощепящие, узнающие последовательность из шести нуклеотидных пар. Это связано с тем, что вероятность встречаемости определенной последовательности из четырех нуклеотидов гораздо выше, чем последовательности из шести нуклеотидов. Если предположить, что участки узнавания рестриктаз распределены вдоль цепи ДНК случайно, то мишень для ферментов, узнающих последовательность (сайт) из четырех нуклеотидов, должна встречаться в среднем 1 раз через каждые 256 пар оснований, а для ферментов, узнающих шесть нуклеотидов, - через 4096 пар оснований.
В 1973 году Смит и Натанс предложили номенклатуру рестриктаз согласно которой:
1. Аббревиатура названия каждого фермента является производной от бинарного названия микроорганизма. К первой прописной букве названия рода добавляют две первые строчные буквы вида: Streptomyces albus - Sal, Escherichia coli – Eco.
2. В случае необходимости добавляют обозначение серотипа или штамма, например, Есо B.
3. Различные системы рестрикции - модификации, кодируемые одной бактериальной клеткой, обозначают римскими цифрами: Hind II, Hind I, Hind III (Haemophilus influenzae).
Рестриктазы по-разному расщепляют ДНК. Одни вносят разрывы по оси симметрии узнаваемой последовательности (Hpa I, Ssp I). Другие - со сдвигом, со "ступенькой" (Pst I).
В первом случае образуются так называемые "тупые" концы, а во втором - "липкие", то есть фрагменты имеющие на своих концах однонитевые взаимно комплементарные участки. Такие фрагменты особенно удобны для создания рекомбинантных ДНК (рис.7).

Рис.7. Механизмы расщепления ДНК рестриктазами.
Реакция разрезания осуществляется в две ступени. Сначала разрезается одна цепь ДНК, а затем рядом разрезается другая. В областях, прилегающих с каждой стороны к сайту разрезания, может иметь место экзонуклеотическая деградация, когда фермент узнает один сайт, а разрезает другой, достаточно удаленный от первого. Это явление напрямую связано с «метилированием ДНК». Сайт-мишень может быть полностью метилирован (обе цепи модифицированы), полуметилирован (только одна цепь метилирована) или не метилирован.
Полностью метилированный сайт не подвержен ни рестрикции, ни модификации. Полуметилированный сайт не узнается ферментом рестрикции, но может быть превращен с помощью метилазы в полностью метилированный. У бактерий метилирование, как правило, связано с сохранением имеющегося состояния модификации. Репликация полностью метилированной ДНК ведет к образованию полуметилированной ДНК.
Неметилированный сайт-мишень представляет собой субстрат либо для рестрикции, либо для модификации in vitro. В клетке немодифицированная ДНК с большей вероятностью рестрицируется.