Учебное пособие Якупов Т. Р. Молекулярная биотехнология Биоинженерия Казань 2016

Генетический вектор
Генетический вектор – это молекула ДНК или РНК, которые способны переносить в клетку чужеродную ДНК, обеспечить её амплификацию и интеграцию в геном.
По профилю использования векторы бывают:
1. Векторы для клонирования – используются для амплификации фрагмента ДНК, встроенного в вектор посредством её репликации.
2. Экспрессионные векторы – для наработки определенного белка, а также для анализа генома и его продуктов.
3. Векторы для трансформации – для введения чужеродного фрагмента ДНК в геном реципиента.
Требования векторам:
Вектор должен быть небольшим и содержать сайты рестрикции для нескольких рестриктаз, должен обладать определенной емкостью; быть способным поддерживаться в клетке-хозяине (реплицироваться), многократно копироваться (ампфлицироваться), экспрессировать соответствующий ген (содержать соответствующие регуляторные последовательности); должен иметь маркерный ген, позволяющий различать гибридные клетки для эффективной селекции; должен быть способным передаваться в клетку соответствующего организма.
В настоящее время широко применяются, в качестве прокариотических векторов - плазмиды, бактериофаги, а в качестве эукариотических - вирусы животных и растений, а также искусственно сконструированные векторы, способные реплицироваться как в бактериальных, так и в эукариотических клетках (челночные векторы).
Плазмиды - это внехромосомные генетические элементы про- и эукариот, которые автономно реплицируются в клетках.
Бактериальные плазмиды делятся на два класса. Одни плазмиды (например, хорошо изученный фактор F, определяющий пол у E.coli) сами способны переходить из клетки в клетку, другие такой способностью не обладают. По ряду причин, и прежде всего для предотвращения неконтролируемого распространения потенциально опасного генетического материала, подавляющее большинство бактериальных плазмидных векторов создано на основе плазмид второго класса.
Как правило они состоят из факторов переноса и тех или иных детерминантов фенотипических свойств бактерий (лекарственной, резистентности, токсичности и т. д.). К настоящему времени плазмиды обнаружены во многих микроорганизмах. Они образовались в результате процесса, который можно назвать «блочной» эволюцией. При этом различные гены объединяются с репликоном, образуя более сложную струк­туру.
Клеточная организация природных плазмид и дала основание для разработки методов конструирования плазмидных векторов в лабораторных условиях. Оказалось, что плазмиды могут быть «разобраны» и «собраны» по заданной программе с помощью рестриктаз и лигаз, аналогично тому, как это происходит в природе.
Важнейшим компонентом вектора является его репликон - элемент, от которого зависит автономное размножение вектора в клетке-хозяине. Чтобы получить плазмидный вектор, необходимо объединить репликон с генами, которые допускали бы возможность селекции (генетические маркеры). Гены, кодирующие резистентность к антибиотикам, оказались наиболее полезными для этой цели.
Современные плазмидные векторы имеют обычно два маркера резистентности. Например, в векторной плазмиде рВР 322 имеются маркер резистентности к ампициллину и маркер резистентности к тетрациклину.


Рис.16. Плазмидный вектор E.coli – pBR 322.

Бактериальные клетки, содержащие такой вектор, устойчивы одновременно к ампициллину и тетрациклину. При включении фрагментов ДНК в участок гена резистентности к тетрациклину, устойчивость к тетрациклину из-за этой вставки нарушается, и все рекомбинантные плазмиды сохраняют устойчивость только к ампициллину. Таким образом, высевая клетки на среды с антибиотиками, можно отобрать клоны, содержащие рекомбинантные молекулы ДНК.
На рис. 16 показан один из самых распространенных плазмидных векторов E.coli - pBR322. Особенность плазмиды состоит в том, что в присутствии ингибитора синтеза белка антибиотика хлорамфеникола (опосредованно ингибирующего репликацию хозяйской хромосомы) ее число в E.coli возрастает от 20-50 до 1000 молекул на клетку, что позволяет получать большие количества клонируемого гена.
Плазмидный вектро pBR322 – это наиболее универсальный вектор 80-х годов. Название формируется так: