Учебное пособие Якупов Т. Р. Молекулярная биотехнология Биоинженерия Казань 2016

6. Алгоритм создания генно-инженерного продукта.
Генная инженерия – технология рекомбинантных ДНК. Под рекомбинантными понимают ДНК, образованные объединением in vitro (в пробирке) двух или более фрагментов ДНК, выделенных из различных биологических источников.
Получение рекомбинантных ДНК состоит из нескольких этапов:
1. выделение нужного (целевого) гена;
2. встраивание его в генетический элемент, способный к репликации (вектор);
3. введение вектора в организм-реципиент;
4. идентификация (скрининг) и отбор клеток, которые приобрели желаемый ген или гены.


Получение генов
Выделение генов – один из главных этапов в генетической инженерии. В принципе существует два основных способа получения гена: синтез и выделение из ДНК.
Синтез гена осуществляется 2-мя путями – химико-ферментативный синтез и синтез с помощью обратной транскриптазы.
Химико-ферментативный синтез гена.
Впервые химико-ферментативный синтез гена был осуществлен в конце 60-х – в начале 70-х годов XX века индийским ученым Н.Кhorana, работавшим в США и который был удостоен Нобелевской премии в 1968 г. Корана вместе со своими сотрудниками синтезировал ген одной тРНК, состоящей из 150 нуклеотидных пар.
Химико-ферментативный синтез генов выполняется в двух стадиях: 1) химический синтез коротких, состоящих из 8-16 нуклеотидов одноцепочечных фрагментов ДНК - олигонуклеотидов. Это осуществляется поэтапным образованием фосфодиэфирных связей между нуклеотидами; 2) полученные олигонуклеотиды сшиваются между собой с помощью фермента ДНК-лигазы. Из одноцепочечных олигонуклеотидов формируют двухцепочечную цепь ДНК.
Первичная структура олигонуклеотидов определяется либо по известной последовательности оснований в гене, либо по методу «чтения с листа». В этом случае за основу берется последовательность аминокислот в нужном белке и по ней с помощью таблицы генетического кода записывается последовательность нуклеотидов в гене. Структуру олигонуклеотидов выбирают так, чтобы они частично были комплементарны друг с другом.
Сшивание полученных олигонуклеотидов с помощью ДНК-лигазы осуществляется путем последовательного добавления их в реакционную смесь с определенной ионной силой и температурой.
Химико-ферментативный синтез ДНК используют не только для полного синтеза структурных генов, но и для присоединения к ним регуляторных участков (промоторов, участков связывания РНК с рибосомой), а также последовательностей, необходимых для соединения полученных генов с векторными молекулами.
Данный способ является трудоемким и весьма сложным. Преимуществом его являются то, что позволяет точно воссоздать необходимую последовательность нуклеотидов, кроме того, в процессе синтеза можно ввести различные регуляторные последовательности или участки узнавания различных рестриктаз и т. д. Этим методом получены гены соматостатина, А- и В- цепи инсулина, проинсулина и другие гены.
Синтез генов с помощью обратной транскрипции
Используя реакцию обратной транскрипции, при помощи ферментов ревертаз (обратные транскриптазы), можно синтезировать практически любой ген в присутствии соответствующих мРНК. Методы выделения последних достаточно хорошо разработаны.
Данный метод основан на универсальной способности обратных транскриптаз синтезировать двунитевую ДНК на однонитевых РНК-матрицах. Функционирование обратных транскриптаз нуждаются лишь в наличии короткой затравочной олигонуклеотидной последовательности РНК или ДНК, комплементарной РНК – матрице (затравка – праймер). Основное требование к затравке - присутствие на ее 3'-конце свободной ОН-группы, с помощью которой фермент инициирует обратную транскрипцию.
Промоторные и другие регуляторные участки гена достраиваются к ДНК-копии с помощью химико-ферментатив-ного синтеза. Таким образом получены гены, кодирующие синтез белка хрусталика глаза человека, яичного белка и др.
Выделение гена из ДНК
Выделение генов из естественных источников является сложнейшей задачей, так как из многих тысяч генов, имеющихся в геноме клетки, нужно выделить единственный конкретный ген, контролирующий развитие того или иного признака. Для этого необходимо точно знать расположение гена и произвести его вырезание при помощи соответствующих ферментов.
Рестриктазы — это абсолютно необходимый и единственный своего рода инструмент в генной инженерии для вырезания интересующих фрагментов (генов) из больших молекул ДНК. Поскольку известно более 100 ферментов рестрикции, то это позволяет выбор рестриктаз и селективное вырезание фрагментов из исходной ДНК.
Выделенный или синтезированный ген не может самостоятельно встраиваться в ДНК клетки-мишени и тем более начинать функционировать. Для переноса целевого гена создается специальная конструкция - вектор, несущий полученный ген и способный встраиваться в геном клетки.