Universidade estadual de campinas faculdade de Engenharia de Alimentos
Identificação e quantificação das antocianinas por UPLC (Ultra
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- 4.4.5.1. Materiais e solventes utilizados
- 4.4.5.3. Separação e Quantificação das Antocianinas por UPLC
- 4.5.2. Extração por PLE (Lote 1)
- 4.5.4. Extrações por SFE com cossolventes (Lotes 1 e 2)
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4.4.5. Identificação e quantificação das antocianinas por UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatography) Para a identificação das antocianinas foi utilizado um sistema de cromatografia líquida de ultra eficiência ACQUITY UPLC ® acoplado a um espectrômetro de massas quadrupolo (UPLC-QToF-MS) (Synapt G2, Waters Corp.,Milford, MA, USA) localizado nas dependências do Departamento de Química Analítica da Universidade de Cádiz (Espanha). 70 Os picos das antocianinas individuais detectadas nas corridas cromatográficas foram identificados pela comparação com os tempos de retenção do respectivo padrão do mirtilo e analisados usando UPLC-QToF-MS. O padrão utilizado e mais comum foi o cloreto de cianidina. A concentração dos compostos identificados foi calculada pelas curvas de calibração obtidas usando soluções do padrão puro, não hidrolisado, com concentrações variando de 0 a 60 mg/L (ppm). As antocianinas foram quantificadas comparando-as com a reta de calibração, levando em consideração a massa molecular de cada uma das antocianinas. Como a fruta mirtilo apresenta 14 diferentes antocianinas, se torna economicamente inviável fazer a calibração com todos os padrões, portanto, foi escolhido o padrão mais comum. Os resultados foram expressos como mg de antocianina/100 g de resíduo fresco (RF). Os resultados são apresentados como a média ± desvio padrão de três diferentes injeções. A Tabela 4.1, na Seção 4.4, informa para quais amostras foram realizadas as análises de UPLC. 4.4.5.1. Materiais e solventes utilizados Foram usados metanol (Merck, Darmstadt, Alemanha) e ácido fórmico (Panreac, Barcelona, Espanha) grau HPLC. Água pura Mili-Q foi purificada em um sistema de purificação de água Millipore (Bedford, MA, USA). O padrão de antocianina para o Lote 1 (Pelargonidin Chloride) e Lote 2 (Cyanidin Chloride) foram adquiridos da Sigma – Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO, USA). 4.4.5.2. Identificação das Antocianinas por UPLC-QToF-MS O equipamento de UPLC usado na identificação das antocianinas é composto pelos seguintes módulos: sistema de bomba quaternária ACQUITY UPLC, detector de arranjo de diodos ACQUITY UPLC, injetor automático ACQUITY UPLC, 71 compartimento para a coluna e detector quadrupolo ACQUITY UPLC. Para o controle do instrumento e o processamento dos dados foi utilizado o software Empower™ (versão 3.0, Waters). Extratos do Lote 1 foram passados através de um filtro de 0,20 µm de tamanho de poro (Chromafil ® Xtra, PA-20/25, Alemanha). Já os extratos do Lote 2 foram filtrados com filtros de mesma porosidade (0,20 μ m), porém de outra empresa (Membrane Solutions, Dallas, USA). Foi utilizada a coluna analítica ACQUITY UPLC ® BEH C18, 1.7 µm, 2.1 × 100 mm (Waters, Irlanda). As temperaturas da coluna e do injetor automático foram mantidas a 50 e 15 °C, respectivamente. O volume de injeção dos extratos foi ajustado para 3,0 µL. A eluição da fração de antocianinas foi utilizada com fases móveis, água (solvente A) e metanol (solvente B) com a primeira contendo 2 % de ácido fórmico. O gradiente linear aplicado foi: 0 min, 15% B; 3,30 min, 20% B; 3,86 min, 30% B; 5,05 min, 40% B; 5,35 min, 55% B; 5,64 min, 60% de B, 5,94 min, 95% B; 7,50 min, 95% B. O tempo de execução total da corrida foi de 12 min, incluindo 4 min para o equilíbrio da coluna. A vazão de solvente foi de 0,4 mL/min. A determinação dos analitos foi realizada por meio de uma fonte de eletrospray (ES), operando no modo de ionização positivo nas condições que seguem: vazão de gás de dessolvatação = 700 L/h, temperatura de dessolvatação = 500 °C, vazão de gás do cone = 10 L/h, temperatura da fonte = 150 °C e voltagem do capilar 700 V. A voltagem do cone para o Lote 1 foi de 30 V, e a energia de colisão foi de 20 eV e modo de varredura completa foi utilizada (m/z = 100 - 800). Para o Lote 2, a voltagem do cone foi de 20 V, a energia de colisão foi de 4 eV e o modo de varredura completa foi utilizada (m / z = 100 - 1200). O efluente do sistema cromatográfico também passou pelo detector de arranjo de diodos (espectro UV-vis), onde as antocianinas foram monitoradas de 200 a 600 nm. O equipamento UPLC-QToF-MS, tem um Photodiode Array (PDA) antes de massa. Com isso, pode-se afirmar que os perfis do equipamento de identificação e quantificação são os mesmos. Ambos estão em série. Todo o método foi desenvolvido e com ensaios prévios nas dependências do Departamento de Química Analítica da Universidade de Cádiz (Espanha). 72 4.4.5.3. Separação e Quantificação das Antocianinas por UPLC A quantificação de antocianinas foi realizada em um cromatógrafo UPLC Elite LaChrom (VWR Hitachi, Tóquio, Japão), consistindo de um injetor automático de amostras (L-2200U), um forno para coluna (L2300), uma bomba (L-2160) e um detector UV-Vis (L-2420U). O forno da coluna foi ajustado a 50 ºC para a cromatografia. O detector UV-Vis foi fixado a 520 nm para as análises. As antocianinas do Lote 1 foram analisadas em uma coluna C18 Halo TM Hitachi LaChrom (100 x 3 mm de diâmetro, tamanho de partícula 2,7 µm). Um método de gradiente, usando água acidificada (ácido fórmico a 5%, de solvente A) e metanol (solvente B), trabalhando a uma vazão de 1,0 mL/min, foi utilizado para a separação cromatográfica. O gradiente utilizado foi o seguinte: 0 min, 15% B; 1,50 min, 20% B; 3,30 min, 30% B; 4,80 min, 40% B; 5,40 min, 55% B; 5,90 min, 60% B; 6,60 min, 95% B; 9,30 min, 95% B, 10 min, 15% B. Já para o Lote 2, as antocianinas foram analisadas em uma coluna Kinetex C18 100Å (50 x 2.1 mm I.D., tamanho de partícula 2.6 µm, Phenomenex Inc., UK). Um método de gradiente, usando água acidificada (ácido fórmico a 5%, de solvente A) e metanol (solvente B), trabalhando a uma vazão de 0,7 mL/min, foi utilizado para a separação cromatográfica. O gradiente utilizado foi: 0 min, 5% B; 1,50 min, 5% B; 3,50 min, 15% B; 5,00 min, 25% B; 5,50 min, 40% B; 6,50 min, 45% B; 7,0 min, 100% B; 9,30 min, 100% B, 10 min, 10% B. 4.5. Métodos de extração O processo de extração a baixa pressão pelo método Soxhlet foi realizado a fim de comparar os resultados de rendimento e composição de extrato com os obtidos por SFE e PLE. 73 4.5.1. Extração Soxhlet As extrações pelo método Soxhlet foram realizadas na matéria-prima do Lote 1 (fresca, liofilizada e seca em estufa) utilizando hexano e metanol como solventes, e cerca de 5 g de amostra. Foram realizados ensaios preliminares a fim de definir o tempo de extração. Foram realizados treinamentos para conhecer o procedimento da extração no aparelho Soxhlet. Inicialmente testou-se a manta de aquecimento para conhecer a variação da temperatura do solvente durante a extração. Para isto foi colocado um termômetro no interior da câmara Soxhlet preso por uma pinça na extremidade superior do extrator e suspenso para evitar o contato direto com a parede da câmara, pois a temperatura da parede da câmara é superior à temperatura do solvente condensado. Foram confeccionados cartuchos com papel filtro Qualy (JProlab, Cód. 3006-5, Curitiba-PR), e no seu interior foi colocada a amostra. Foram depositados 0,2 L de solvente em balão com capacidade de 0,25 L colocado em manta aquecedora com controlador de voltagem (Fisaton, modelo 102, São Paulo, SP). A temperatura de aquecimento foi determinada visando à obtenção de refluxos em intervalos de tempo espaçados e o tempo de extração foi determinado. Após o resfriamento, o frasco coletor foi acoplado a um sistema de rota evaporação (Heidolph Instruments modelo Laborota 4001, Viertrieb, Alemanha) com bomba de vácuo (Heidolph Instruments, modelo Rotavac Control, Viertrieb, Alemanha) a 40 ºC e 0,11 atm, para remover o solvente. A composição do extrato é função da temperatura de extração, mas também do tempo. Assim, realizaram-se experimentos preliminares modificando o tempo de extração e avaliando a sua influência na composição do extrato. 74 4.5.2. Extração por PLE (Lote 1) A PLE foi realizada com a matéria-prima do Lote 1 (fresca e liofilizada). A unidade de extração utilizada nos experimentos pode operar com células de extração de três diferentes volumes (5, 50 ou 100 mL) revestidas por uma “camisa” de aquecimento elétrico. A unidade conta com um recipiente para conter o solvente, uma bomba de HPLC (Thermoseparation Products, Modelo 3200 ConstaMetric P/F, Fremoni, EUA) que opera com vazões na faixa de 0,001 a 10,0 mL/min, um manômetro, uma válvula que controla a vazão do solvente, um indicador e controlador de temperatura, uma válvula back pressure responsável pelo controle e manutenção da pressão e um recipiente de coleta. Todas as ligações dentro do sistema foram feitas de tubos de aço inoxidável (1/16” e 1/8”). Esta unidade trabalha em temperaturas e pressões nas faixas de 25 a 180 ºC e 0,5 a 40 MPa, respectivamente. A Figura 4.2 mostra um diagrama esquemático da unidade utilizada, e a Figura 4.3 mostra a fotografia da unidade PLE que foi montada no Laboratório de Alta Pressão em Engenharia de Alimentos (LAPEA /DEA/FEA/Unicamp). Figura 4.2. – Diagrama esquemático da unidade de extração com liquidos pressurizados (PLE). R - Recipiente (solvente); B - Bomba de solvente; M - Manômetro; V - Válvula de bloqueio; CE - Célula de extração com aquecimento; BP – Válvula back pressure; T – Controlador e indicador de temperatura; VC – Vaso de coleta. 75 Figura 4.3. – Unidade PLE. A - Bomba de HPLC; B - Manômetro; C - Válvula de bloqueio; D - Célula de extração com aquecimento; E - Válvula back pressure. A utilização dos respectivos solventes, bem como suas combinações, se baseou em estudos anteriormente realizados por Seabra et al. (2010). As extrações por PLE foram realizadas fixando a temperatura, pressão e vazão de solvente em 40 ºC, 20 MPa e 10 mL/min, respectivamente, e variando a proporção volumétrica de solventes, como mostra a Tabela 4.2. Água acidificada com pH 2,0 foi usada como solvente em alguns experimentos, por ser indicada para a solubilização das antocianinas. Acetona também foi testada como solvente somente na amostra fresca. As extrações foram realizadas usando uma célula de 5 mL, e em duplicata. Para as amostras frescas foram utilizados 4 g e para a amostra liofilizada, 0,8 g, sendo o restante da célula preenchido por microesferas de vidro. O solvente foi bombeado por uma bomba de HPLC (Thermoseparation Products, Modelo 3200 ConstaMetric P/F, Fremoni, EUA) para a célula de extração colocada em uma camisa de aquecimento elétrico na temperatura desejada até que a pressão desejada fosse obtida. Após a PLE, os extratos foram resfriados rapidamente até 5 o C em água gelada para evitar a degradação das antocianinas e de outros 76 compostos termolábeis. A PLE geralmente requer menos tempo (tempo de extração varia entre 5 a 30 minutos) e menor consumo de solventes que as técnicas convencionais (MENDIOLA et al., 2007). Com isso, as extrações por PLE foram realizadas em 15 minutos e em duplicata. O solvente foi evaporado da solução do extrato utilizando um evaporador rotativo a vácuo ( MARCONI, MODELO MA120) com bomba de vácuo (MARCONI, MODELO MA 057/3, pressão máxima de 5,3 bar e 730 mmHg de vácuo . Todos os extratos foram armazenados a -10 ºC no escuro até serem caracterizados. Tabela 4.2. Planejamento de extrações por PLE e respectivos solventes. H 2 O (%) Etanol (%) Acetona (%) Amostra fresca (4 g) - 100 - 50 50 - 100 - - Água acidificada (*) 100 Amostra liofilizada (0,8 g) - 100 - 50 50 - 100 - - Água acidificada (*) 50 50 - Água acidificada (*) (*) com ácido cítrico em pH = 2,0. 4.5.3. Extrações por SFE (Lotes 1 e 2) O método dinâmico semi-contínuo de SFE foi empregado nos experimentos cinéticos e na determinação do rendimento global de extração da amostra fresca. Este método é caracterizado pela passagem contínua da solvente supercrítico pela matriz sólida (FERREIRA, 1999). Inicialmente foram realizados ensaios de SFE em uma unidade de extração construída no LAPEA e detalhada na Figura 4.4, conforme procedimentos determinados por Pascual-Martí et al. (2001) e limitações do equipamento. Estes ensaios foram realizados com 40 g de amostra fresca utilizando CO 2 (99,5% de pureza, White Martins, Campinas/SP) para definir a melhor condição de pressão e 77 vazão de CO 2 para as futuras etapas. Foram construídas OECs para as pressões de 10, 15, 20, 25 e 30 MPa e vazões de CO 2 de 1,05 X 10 -4 e 1,4 X 10 -4 kg/s. Segundo Khanal et al. (2009), a degradação de antocianinas durante o processo de extração não ocorre a 40 °C. Por este motivo, essa foi a temperatura adotada em todas as extrações. Os testes foram realizados para verificar o funcionamento do equipamento com a matéria-prima escolhida. As pressões avaliadas nos testes preliminares foram de 10, 15, 20 e 25 MPa e a temperatura foi fixada em 40 ˚C. O solvente empregado foi CO 2 puro e todos os ensaios foram realizados em duplicata. O rendimento global de extração, obtido usando uma determinada razão entre massas de solvente (S) e de matéria-prima (F) (X o, S/F ), foi calculado relacionando a massa total de extrato (Mextr) e a massa de alimentação de matéria-prima em base seca, de acordo com a Equação 8. (????????????, ??????/??????) = ( ?????????????????????????????? ?????? ) ??????100 (8) O rendimento global foi calculado usando a soma das massas dos extratos obtidos nos frascos de coleta. Os resultados são apresentados como médias aritméticas de experimentos realizados em duplicata. Segundo Pereira (2005), se a razão S/F for mantida constante para cada experimento de rendimento de extração, o X 0 é suficiente para determinar a extensão da influência de temperatura e pressão sobre o rendimento. Portanto, no presente trabalho, as SFEs tiveram seus tempos de extração calculados para cada experimento e a razão S/F foi fixada em 10 kg solvente/kg matéria prima. A unidade de SFE é composta por uma célula de extração de aço inoxidável com volume de 300 mL, que suporta pressões de até 45 MPa. A unidade é equipada com um banho de refrigeração que controla a temperatura do CO 2 na entrada da bomba, um banho de aquecimento e uma manta de aquecimento que mantêm a temperatura da célula de extração. A unidade ainda conta com uma bomba de cossolvente, um totalizador de vazão, termopares e manômetros. A Figura 4.4 mostra o diagrama esquemático da unidade de SFE. 78 Figura 4.4. Diagrama esquemático da unidade de extração supercrítica; V-1, V- 2, V-3, V-4 e V-5 – Válvulas de bloqueio; V-6 – Válvula micrométrica; C - Compressor; F - Filtro de ar comprimido; BR – Banho de refrigeração; B - Bomba (Booster); BA – Banho de aquecimento; I-1 e I-2 – Indicadores de pressão e temperatura, respectivamente; IC-1 e IC-2 – Temperatura da célula de extração e temperatura da válvula micrométrica, respectivamente; CE – Célula de extração (300 mL); S – Sonda ultrassônica. O CO 2 inicialmente estocado no reservatório, é resfriado até -10 o C no banho ultratermostatizado BR (Marconi, modelo MA184, Piracicaba-SP) que opera com etileno glicol. Desta forma, o CO 2 é liquefeito na entrada da bomba pneumática, evitando a cavitação. Esta última, por sua vez, comprime o solvente até a pressão de extração. O estado supercrítico é atingido por troca térmica em uma serpentina instalada dentro de um banho de aquecimento, que está regulado para a temperatura de extração (40 °C). A temperatura do processo é monitorada pelos termopares que se encontram em contato com a parede externa e na saída do leito de extração. Assume-se que a temperatura indicada seja a mesma do leito de partículas, uma vez que o extrator é feito de aço inox, que possui alta condutividade térmica. O solvente IC-1 IC-2 79 escoa através do leito de extração e a vazão é controlada por uma válvula micrométrica (agulha), que se encontra na saída da linha. Esta válvula possui um sistema de aquecimento elétrico monitorado por um termopar com o objetivo de diminuir os efeitos da expansão Joule-Thomson. Na válvula micrométrica o solvente é despressurizado até a pressão ambiente e o soluto é precipitado em um recipiente de coleta de 100 mL. O CO 2 , agora na fase gasosa, passa pelo rotâmetro, que permite medir a vazão de solvente no processo. Antes de ser liberado para o ambiente, o CO 2 atravessa o totalizador de vazão (LAO, modelo G 0,6 ± 0,001 m³; São Paulo - SP) que permite calcular o volume total de solvente usado no processo. 4.5.4. Extrações por SFE com cossolventes (Lotes 1 e 2) Com base nas cinéticas de extração, no rendimento global e na composição dos extratos obtidos por SFE com CO 2 puro, foi definida a melhor condição de extração. Nessa condição, um planejamento de extrações com cossolventes foi realizado, a fim de obter maior rendimento dos extratos, conforme descrito por Leal (2008) e Takeuchi (2009). O planejamento está apresentado na Tabela 4.3. Os experimentos de SFE com cossolvente foram realizados na unidade descrita na Seção 4.5.3, utilizando uma célula de extração de 300 mL. As extrações foram realizadas fixando a temperatura em 40 °C, a pressão em 20 MPa e a vazão de CO 2 em 1,4 x 10 -4 kg/s. Já os cossolventes adicionados ao CO 2 foram etanol, água e água acidificada com ácido cítrico (pH 2,0). A razão S/F foi mantida em 10 kg solvente/kg matéria prima. O tempo de extração estático (t E ) (tempo em que o sistema carregado de CO 2 permanece à espera do equilíbrio termodinâmico) e dinâmico (t D ) (tempo da extração em si) e a vazão de cossolvente (Q cossolvente ) foram calculados para cada extração com base na densidade fornecida pelo site NIST (National Institute of Standars and Technology, 2013). As concentrações dos cossolventes utilizados foram selecionadas de acordo com estudos prévios de SFE de compostos fenólicos já publicados na literatura (PEREIRA, 2005; ADIL et al., 2007; GHAFOORA et al., 2010) e também com os resultados dos testes preliminares. 80 Tabela 4.3. Condições experimentais de SFE com cossolventes. CO 2 (%) H 2 O (%) Etanol (%) Adição de ácido cítrico (pH = 2,0) Experimentos com amostra fresca 90 10 - - 50 50 - - 90 10 - X 50 50 - X 90 - 10 - 50 - 50 - 50 40 10 - 90 5 5 - 90 8 2 - 95 4 1 - Após as extrações, todos os extratos foram congelados e posteriormente liofilizados em liofilizador de bancada (LioTop/LIOBRAS - São Carlos, SP, Brasil) com o tempo variando de 48 a 72 horas, dependendo da umidade das amostras. Com a melhor composição de solvente selecionada, com base nas análises realizadas e condições do equipamento, realizou-se uma SFE com o resíduo de mirtilo liofilizado e outra extração com o mirtilo fresco macerado sob o abrigo de luz, ambas em duplicata. A partir da melhor condição de extração utilizando a matéria-prima do Lote 1, definida com base nos resultados obtidos nas análises físico-químicas (fenólicos totais, capacidade antioxidante DPPH e ABTS e antocianinas) e no rendimento de extração, foram realizadas mais 15 (quinze) extrações com a matéria-prima do Lote 2, para obtenção dos extratos a serem utilizados nos processos de separação com membranas. Todos os extratos foram acondicionados em um mesmo frasco e mantidos a -18 o C. Download 5.01 Kb. Do'stlaringiz bilan baham: 
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