Yilda Nature jurnalida Jeyms Uotson

24.Kepping


25.kodlanmagan RNK ( ncRNK ) proteinga aylantirilmaydigan funktsional RNK molekulasidir . Funktsional kodlanmaydigan RNK transkripsiya qilinadigan DNK ketma-ketligi ko'pincha RNK geni deb ataladi . Kodlanmagan RNKlarning ko'p va funktsional muhim turlariga transfer RNK (tRNK) va ribosoma RNK (rRNK), shuningdek mikroRNK , siRNK , piRNK , snoRNK , snRNK , exRNK , scaRNA kabi kichik RNKlar kiradi .va Xist va HOTAIR kabi uzun ncRNA'lar .
Inson genomidagi kodlanmaydigan RNKlar soni noma'lum; ammo, so'nggi transkriptomik va bioinformatik tadqiqotlar minglab kodlanmagan transkriptlar mavjudligini ko'rsatadi. ^{[1] [2] [3] [4] [ 5] [6] [7]} Yangi aniqlangan ncRNKlarning koʻpchiligi oʻz funksiyalari uchun tasdiqlanmagan. ^[8] Adabiyotda kodlanmagan transkripsiyaning qanchalik funktsional ekanligi haqida konsensus mavjud emas. Ba'zi tadqiqotchilar ko'p ncRNKlar ishlamaydigan (ba'zan "keraksiz RNK" deb ataladi), soxta transkripsiya ekanligini ta'kidladilar. ^[9] [10] Boshqalar esa bunga qo'shilmaydilar va buning o'rniga ko'plab kodlanmagan transkriptlarning funktsiyalari borligini va bu funktsiyalar kashf qilinmoqda va kashf qilinishda davom etadilar.


26. Biz metillanishning mos kelishi nisbatini o'rtacha metillanishning ikkita ko'rsatkichi (ya'ni, an'anaviy o'rtacha metilatsiya va hujayraning heterojenligi bo'yicha sozlangan klonal metilatsiya (CHALM) 21 , usullarga qarang) va metilatsiya o'zgarishining uchta ko'rsatkichi (ya'ni, Shennon entropiyasi 15 ) bilan solishtiramiz . Epipolimorfizm 13 va mos kelmaydigan o'qishlar nisbati (PDR) 12 , usullarga qarang). Qo'shimcha 1b- rasmda turli ko'rsatkichlarning hisob-kitoblari simulyatsiya qilingan ma'lumotlar bilan taqqoslanadi. Metilatsiyaning o'zgarishi ko'rsatkichlari oynaga asoslangan va faqat kamida 4 CpGni (jami o'qishning atigi ~ 20%) qamrab olgan o'qishlarni oladi, metilatsiyaning muvofiqligi esa bunday cheklovga ega emas va barcha o'qishlardan foydalanadi (Qo'shimcha 1c-rasm) .). Bundan tashqari, metillanish moslashuvi metillanish o'zgarishiga qaraganda ko'proq tartibga soluvchi elementlarni (masalan, promotorlar) aniqlaydi (Qo'shimcha rasm 1d ).
Sichqonchaning embrion ildiz hujayralaridan (mESC) olingan butun genom bisulfit sekvensiyasi (WGBS) ma'lumotlaridan foydalangan holda, biz ushbu oltita metilatsiya chorasi ChIP tomonidan o'lchangan mos keladigan namunalardagi gen promotorlarida DNMT3A1 va TET1 fermentlarining DNK bilan bog'lanish intensivligi bilan turli darajada bog'liqligini kuzatamiz. -seq (xromatin immunoprecipitation, keyin yuqori o'tkazuvchanlik sekvensiyasi). Biz o'rtacha metilatsiya choralari metiltransferaza DNMT3A1 va demetilaz TET1 ning bog'lanish intensivligi bilan ijobiy va salbiy bog'liqligini kuzatamiz, bu ikki fermentning ma'lum fermentativ faolligiga mos keladi (Qo'shimcha shakl 2b va 2c ) . Uchta metilatsiya o'zgarishi o'lchovlari o'xshash korrelyatsiya naqshlarini ko'rsatadi (Qo'shimcha rasm 2d , 2e)., va 2f ). Bundan farqli o'laroq, metilatsiyaning moslashuv nisbati DNMT3A1 va TET1 bog'lanish intensivligi bilan ijobiy bog'liqdir (Qo'shimcha rasm 2a ). Ikki fermentning qo'shma ta'sirini batafsil o'rganish uchun biz promotorning DNMT3A1-TET1 "qo'shma tartibga solish ko'rsatkichi" (n) ni ushbu promouter ichidagi DNMT3A1 va TET1 bog'lanish intensivligining mahsuloti sifatida aniqlaymiz (Usullarda (2) tenglamaga qarang ) . Ushbu qo'shma tartibga solish ko'rsatkichi promotorning ikkala ferment tomonidan birgalikda ishg'ol qilingan darajasini ko'rsatadi va agar biron bir ferment past bog'lanish intensivligiga ega bo'lsa, u past qiymatni oladi. Kutilganidek, qo'shma tartibga solish ko'rsatkichi metilatsiyaning moslashuv nisbati ( 1b- rasm) bilan kuchli ijobiy korrelyatsiyaga ega, ammo o'rtacha metilatsiya choralari bilan unchalik ko'p emas (1-rasm). 1c va qo'shimcha 2c- rasm ) yoki metilatsiya o'zgarishi choralari ( 1d- rasm va qo'shimcha 2e va 2f- rasm ). Bu natija o'rtacha metillanish va metillanish o'zgarishi ikkita qarama-qarshi fermentning qo'shimcha ta'siri bilan neytrallanganligi va DNMT3A1 va TET1 ning mos kelishini faqat metilatsiyaning muvofiqlik nisbati xarakterlashi bilan mos keladi. Quyidagi matnda biz an'anaviy o'rtacha metilatsiyani o'rtacha metilatsiya o'lchovi sifatida va Shennon entropiyasini metilatsiya o'zgarishi o'lchovi sifatida ishlatamiz.


27. Agar tekislashdagi ikkita ketma-ketlik umumiy ajdodga ega bo'lsa, nomuvofiqliklar nuqta mutatsiyalari va bo'shliqlar bir-biridan ajralib chiqqan vaqt ichida bir yoki ikkala naslda kiritilgan indellar (ya'ni kiritish yoki o'chirish mutatsiyalari) sifatida talqin qilinishi mumkin. Oqsillarning ketma-ket joylashishida ketma-ketlikda ma'lum bir pozitsiyani egallagan aminokislotalar o'rtasidagi o'xshashlik darajasini ma'lum bir mintaqa yoki ketma-ketlik motivi nasllar orasida qanchalik saqlanib qolganligining taxminiy o'lchovi sifatida talqin qilish mumkin. O'rinbosarlarning yo'qligi yoki faqat juda konservativ almashtirishlarning mavjudligi (ya'ni, yon zanjirlari bo'lgan aminokislotalarni almashtirisho'xshash biokimyoviy xususiyatlarga ega) ketma-ketlikning ma'lum bir mintaqasida, bu hududning tarkibiy yoki funktsional ahamiyatga ega ekanligini ko'rsatadi ^{[4] .} DNK va RNK nukleotid asoslari aminokislotalarga qaraganda bir-biriga ko'proq o'xshash bo'lsa-da, tayanch juftlarining saqlanishi o'xshash funktsional yoki strukturaviy rolni ko'rsatishi mumkin.Juda qisqa yoki juda o'xshash ketma-ketliklar qo'lda tekislanishi mumkin. Biroq, eng qiziqarli muammolar uzoq, juda o'zgaruvchan yoki juda ko'p sonli ketma-ketliklarni tekislashni talab qiladi, ularni faqat inson kuchi bilan moslash mumkin emas. Buning o'rniga, inson bilimi yuqori sifatli ketma-ketliklarni moslashtirish uchun algoritmlarni qurishda va vaqti-vaqti bilan yakuniy natijalarni algoritmik tarzda ifodalash qiyin bo'lgan naqshlarni aks ettirish uchun sozlashda qo'llaniladi (ayniqsa, nukleotidlar ketma-ketligida). Ketma-ketlikni tekislashda hisoblash yondashuvlari odatda ikkita toifaga bo'linadi: global hizalamalar va mahalliy hizalamalar . Global moslashuvni hisoblash global optimallashtirishning bir shaklidirbu hizalanishni barcha so'rovlar ketma-ketligining butun uzunligini qamrab olishga "majbur qiladi". Bundan farqli o'laroq, mahalliy hizalanishlar odatda keng tarqalgan bir-biridan farq qiladigan uzoq ketma-ketliklar ichidagi o'xshashlik hududlarini aniqlaydi. Mahalliy tekislashlar ko'pincha afzalroqdir, ammo o'xshashlik hududlarini aniqlashning qo'shimcha qiyinchiliklari tufayli hisoblash qiyinroq bo'lishi mumkin. ^[5] Ketma-ketlikni tekislash masalasiga turli xil hisoblash algoritmlari qo'llanilgan. Bu dinamik dasturlash kabi sekin, lekin rasmiy ravishda to'g'ri usullarni o'z ichiga oladi . Bular, shuningdek, samarali, evristik algoritmlar yoki keng ko'lamli ma'lumotlar bazasini qidirish uchun mo'ljallangan, eng yaxshi mos keladiganlarni topishga kafolat bermaydigan ehtimollik usullarini o'z ichiga oladi.


28. Evolyutsion biologlar uchun asosiy tashabbus fenotipik xilma-xillik asosidagi molekulyar asosni tushunishdir. Uzoq muddatli faraz shuni ko'rsatadiki, turlarga xos xususiyatlar oqsil darajasidagi farqlar emas, balki genlarni tartibga solishdagi farqlar bilan izohlanishi mumkin. So'nggi bir necha yil ichida evolyutsion tadqiqotlar oddiy ketma-ket taqqoslashdan integrativ tahlillarga o'tdi, bunda genlarni tartibga solish turlar evolyutsiyasini tushunish uchun kalit hisoblanadi. DNK metilatsiyasi ko'plab biologik jarayonlarni tartibga solishda ishtirok etadigan muhim epigenetik modifikatsiyadir. Shunga qaramay, inson metilomasining evolyutsiyasi va bunday o'zgarishlarni qo'zg'atuvchi jarayonlar yaxshi tushunilmagan. Bu erda biz sitozin-fosfat-guanin (CpG) metilatsiyasi va asosiy genom ketma-ketligi o'rtasidagi yaqin o'zaro bog'liqlikni, shuningdek, uning evolyutsion ta'sirini ko'rib chiqamiz. Shuningdek, biz inson va noinsoniy primatlar haqidagi asosiy adabiyotlarni qayta ko'rib chiqib, sohadagi so'nggi yutuqlarni umumlashtiramiz. Biz ilmiy hamjamiyatni qiyosiy epigenomika sohasidagi ko'plab muammolarni hal qilishga undashga umid qilamiz.


29. Inson mitoxondrial genomi: asosiy biologiyadan kasallikka qadar inson mitoxondrial genomikasini keng qamrovli, zamonaviy tekshirishni taklif etadi, bu asosiy tadqiqotlarni turli xil kasalliklarda translatsion tibbiyot bilan bog'laydi. Bu yerda xalqaro ekspertlar inson mitoxondrial DNKsi (mtDNK) ning asosiy biologiyasini, jumladan, uni saqlash, taʼmirlash, ajratish va irsiyatni muhokama qiladi. Bundan tashqari, mtDNKning evolyutsiyasi va ekspluatatsiyasi, mutatsiyalar, mtDNKni funktsional o'rganish usullari va modellari ko'rib chiqiladi. Kasallik muhokamasi davolash strategiyalari uchun yondashuvlar bilan birga bo'lib, kasallik sohalari, jumladan, saraton, neyrodegenerativ, yoshga bog'liq, mtDNKni yo'q qilish, o'chirish va nuqta mutatsion kasalliklari muhokama qilinadi. Nukleozidlarni qo'shish, mitoTALENlar ​​va mitoZNF nukleazlari chuqur o'rganilgan terapevtik yondashuvlar qatoriga kiradi.
MtDNK tadqiqotlarini moliyalashtirishning ko'payishi bilan ko'plab klinisyenlar va klinisyen olimlar e'tiborini mtDNK kasalliklari assotsiatsiyasiga qaratmoqda. Ushbu kitob haplogrupni aniqlovchi variantni yoki kasallik bilan bog'liq mutatsiyani farqlashdan tortib, yangi terapevtik yo'llarni o'rganishgacha bo'lgan ushbu hayajonli makonda yangi, ta'sirli tadqiqotlarni amalga oshirish uchun zarur bo'lgan vositalar va asosiy bilimlarni taqdim etadi.


30. Operonlar - bu birlik sifatida boshqariladigan genlar klasterlari.
Bakterial genlarni tartibga solish uchun operon modeli birinchi marta Fransua Yakob va Jaques Monod tomonidan )) ning salbiy tartibga solinadigan laktoza genlaridan foydalangan holda taklif qilingan . Laktoza operoni ,Bakterial genlarni tartibga solish uchun operon modeli birinchi marta Fransua Yakob va Jaques Monod tomonidan E. coli misol sifatida taklif qilgan. O'shandan beri ko'plab bakterial genlar, shu jumladan faollashtiruvchi va repressorli genlar ushbu modelga yoki uning variantlariga o'rnatildi. Eukariotlarda operonlar juda kam uchraydi, lekin ular mavjud ( 16.01 qutiko'p bakterial operonlar kabi, ikki darajada nazorat qilinadi. Maxsus tartibga solish ma'lum bir operonga xos bo'lgan omillarga, bu holda shakar laktozasining mavjudligiga javoban tartibga solishni anglatadi. Keyinchalik muhokama qilinadigan global tartibga solish, hujayraning umumiy uglerod va energiya ta'minoti kabi umumiy shartlarga javoban tartibga solishdir .


31. Primer qisqa sintetik oligonükleotid bo'lib, u ko'plab molekulyar texnikada qo'llaniladiPCR uchunDNK ketma-ketligi . Ushbu primerlar ketma-ketlikka ega bo'lish uchun mo'ljallangan bo'lib, biz primerning tavlanishini xohlagan shablon yoki maqsadli DNK mintaqasining teskari to'ldiruvchisi hisoblanadi.

Primer ketma-ketligini tahlil qilish 
PCR, sekvensiya yoki mutagenez uchun primerlarni loyihalashda ko'pincha bu primerlar haqida bashorat qilish kerak bo'ladi, masalan, erish harorati (Tm) va reaktsiyada o'zi yoki boshqa primerlar bilan dimerlarni hosil qilish moyilligi. Quyidagi dastur ushbu hisob-kitoblarni har qanday primer ketma-ketligi yoki juftligida bajaradi.
IDT DNK (Oligo Analizatorni tanlang)
Dasturlar astarlarning Tm ni ham, astarlarning istalgan kiruvchi juftliklarini ham hisoblab chiqadi. Astarlar soch turmagi yoki dimerlarni hosil qilganda, kerakli reaktsiya uchun kamroq primer mavjud. Masalan... 




Astarlarni loyihalash bo'yicha ba'zi fikrlar. 
1. astarlar uzunligi 17-28 tayanch bo'lishi kerak;
2. asosiy tarkibi 50-60% (G+C) bo'lishi kerak;
3. primerlar (3') G yoki C yoki CG yoki GC bilan tugashi kerak: bu uchlarning "nafas olishini" oldini oladi va astarlash samaradorligini oshiradi; ^{4. 55-80 o}
S gacha bo'lgan Tms afzallik beriladi; 5. Primerlarning 3'-uchlari bir-birini to'ldiruvchi (ya'ni, tayanch juft) bo'lmasligi kerak, chunki aks holda primer dimerlari boshqa har qanday mahsulotga nisbatan ustunlik bilan sintezlanadi; 6. primerning o'zini-o'zi to'ldiruvchiligi ( soch iplari kabi 2 ^o tuzilmalarni shakllantirish qobiliyati ) oldini olish kerak; 7. Primerlarning 3'-uchlarida uch yoki undan ko'p C yoki G larning ketma-ketligi G yoki C ga boy ketma-ketlikda noto'g'ri aspiratsiyaga olib kelishi mumkin (tavlanish barqarorligi sababli) va undan qochish kerak.
Shuni ham yodda tutingki, oligonukleotid sintez reaktsiyalarining aksariyati faqat 98% samaralidir. Bu shuni anglatadiki, har safar baza qo'shilsa, oligoslarning faqat 98% bazani oladi. Bu qisqaroq oligoslar uchun ko'pincha muhim emas, lekin uzunligi oshgani sayin, primerning asosini yo'qotish ehtimoli ortadi. Bu mutagenez yoki klonlash reaksiyalarida juda muhimdir. Ba'zi hollarda HPLC yoki PAGE orqali tozalash tavsiya etiladi. 


32. Poliadenilatsiya - bu RNK transkriptiga, odatda xabarchi RNK (mRNK) ga poli(A) dumining qo'shilishi . Poli(A) dumi bir nechta adenozin monofosfatlardan iborat ; boshqacha aytganda, bu faqat adenin asoslariga ega bo'lgan RNKning bir qismidir . Ökaryotlarda poliadenilasyon translatsiya uchun etuk mRNK ishlab chiqaradigan jarayonning bir qismidir . Ko'pgina bakteriyalarda poli(A) dumi mRNKning parchalanishiga yordam beradi. Shuning uchun u genlarni ifodalashning katta jarayonining bir qismini tashkil qiladi .
Poliadenilasyon jarayoni genning transkripsiyasi tugashi bilan boshlanadi . Yangi hosil bo'lgan pre-mRNKning 3' -eng segmenti birinchi navbatda oqsillar to'plami tomonidan ajratiladi ; keyin bu oqsillar RNKning 3' uchidagi poli(A) dumini sintez qiladi. Ba'zi genlarda bu oqsillar bir nechta mumkin bo'lgan joylardan birida poli(A) dumini qo'shadi. Shuning uchun, poliadenilatsiya bitta gendan bir nechta transkript hosil qilishi mumkin ( muqobil poliadenilatsiya ), muqobil qo'shilish kabi . ^[1]
Poli (A) dum mRNKning yadroviy eksporti, tarjimasi va barqarorligi uchun muhimdir. Vaqt o'tishi bilan quyruq qisqaradi va u etarlicha qisqa bo'lganda, mRNK fermentativ ravishda parchalanadi. ^[2] Biroq, bir nechta hujayra turlarida qisqa poli(A) dumli mRNKlar keyinchalik sitozolda qayta poliadenillanish orqali faollashish uchun saqlanadi. ^[3] Aksincha, poliadenillanish bakteriyalarda sodir bo'lganda, u RNK degradatsiyasiga yordam beradi. ^[4] Bu ba'zan eukaryotik kodlanmaydigan RNKlar uchun ham sodir bo'ladi . ^[5] [6]
Prokaryotlarda ham, eukariotlarda ham mRNK molekulalari poliadenillangan 3′-uchlariga ega, prokaryotik poli(A) dumlari odatda qisqaroq va kamroq mRNK molekulalari poliadenillangan.


33. Polimeraza zanjiri reaktsiyasi (qisqartirilgan PCR) bu DNKning ma'lum bir segmentining millionlab milliardlab nusxalarini tezda ishlab chiqarish (kuchaytirish) uchun laboratoriya usuli bo'lib, keyinchalik uni batafsilroq o'rganish mumkin. PCR kuchaytiriladigan genom segmentini tanlash uchun primerlar deb ataladigan qisqa sintetik DNK fragmentlaridan foydalanishni va keyin bu segmentni kuchaytirish uchun DNK sintezining bir necha bosqichlarini o'z ichiga oladi. Polimeraza zanjiri reaktsiyasi, PCR. Shunday qilib, PCR 1980-yillarning o'rtalariga to'g'ri keladi, ya'ni Odam genomi loyihasi ko'rib chiqilayotgan va o'sha o'n yillikning oxirida boshlangan vaqt. O'shandan beri PCR juda ko'p biologiya va biotibbiyot tadqiqotlari uchun haqiqatan ham asosiy bo'ldi. Biz Genom institutida bo'lganimiz sababli, shuni ta'kidlash kerakki, bu inson genomi loyihasining dastlabki kunlarida asosiy texnologiya edi. Va u bugungi kungacha muhim rol o'ynadi. Va u uzoq vaqt davomida o'ynashda davom etadi, deb o'ylayman, garchi siz hech qachon bilmasangiz ham - har doim boshqa yangi texnologiya mavjud.


34. Aholi genomikasi dasturlari sog'liqni saqlash tizimida miqyosda klinik ma'lumotlarni genomik ma'lumotlar bilan birlashtirib, sog'liqni saqlash sohasida innovatsiyalar va kashfiyotlarni tezlashtirishga intiladi. ¹ Muntazam klinik parvarishlash vaqtida asosiy biologiyani ko'proq tahlil qilish orqali bunday dasturlar nafaqat bugungi bemorning bevosita ehtiyojlarini qondirishi, balki ertangi bemorga yordam berish uchun ma'lumotlar bazasini yaratishi mumkin. ^2-4
Muvaffaqiyatli populyatsiya genomikasi dasturi tibbiy va tadqiqot hamjamiyatlarini hukumatlar va sanoat bilan birgalikda takomillashtirilgan natijalar, aholi salomatligini yanada samarali boshqarish va tarjima orqali tezlashtirilgan kashfiyot sur'atlarini ta'minlash uchun yagona strategiyaga qo'shiladi.
Aholi genomikasi, shuningdek, farmatsevtika, biotexnologiya va ma'lumotlar sektorlarida sanoatni jalb qilish va investitsiyalar uchun platformani taqdim etadi. Katta, xilma-xil ma'lumotlar to'plamlarini integratsiyalash va ilg'or hisoblash texnologiyalaridan (masalan, sun'iy intellekt yoki mashinani o'rganish) sog'liqni saqlash tizimlari va hamkorlar genomning kuchini yanada ochish, shu bilan birga hayot va parvarish sifatini yaxshilash va iqtisodiy o'sishni rag'batlantirish uchun optimal tarzda joylashtirilgan. .


35. Primerlar qisqa DNK ketma-ketliklari bo'lib, odatda 18 dan 24 gacha tayanch juftlikdan iborat bo'lib, ular PCR jarayonida DNK polimeraza fermenti tomonidan DNKni kuchaytirish uchun boshlang'ich nuqta bo'lib xizmat qiladi.
DNK polimeraza fermentlari faqat qurilayotgan DNK zanjirining oxiriga nukleotidlarni qo'shishga qodir bo'lganligi sababli, primerlar DNK replikatsiyasi jarayonining muhim komponentlari hisoblanadi. Shuning uchun PCR reaktsiyasini to'g'ri bajarish va kerakli qismni yuqori samaradorlik bilan takrorlash uchun mos primerlarni loyihalash juda muhimdir.
Primerni loyihalash uchun siz avval nuklein kislotalar ketma-ketligi ma'lumotlar banklaridan ( NCBI kabi) FASTA formatida o'rganilgan gen ketma-ketligini olishingiz kerak . Keyingi bosqichda astarlarni loyihalash uchun Oligo, gen runner, primer3, beacon designer va boshqalar kabi turli xil dasturlardan foydalanish mumkin.

Astarni loyihalashning asosiy tamoyillari

Astar uzunligi

Odatda, 18 dan 22 gacha nukleotidlar uzunligi odatda primer uchun mos keladi. Agar primerning uzunligi qisqaroq bo'lsa, primerning shablon DNK zanjiriga o'ziga xos bo'lmagan bog'lanish ehtimoli ortadi va agar primerning uzunligi ushbu diapazondan uzunroq bo'lsa, primerning shablonga bog'lanishi qiyinlashadi. tavlanish haroratida. Primerlarning erish haroratiPrimerlarning erish harorati yoki Tm ikki zanjirli DNKning yarmi ajralib, bir zanjirli DNKga aylanadigan haroratdir. Bu harorat DNK-DNK gibridining barqarorligini baholash hisoblanadi va tavlanish haroratini aniqlashda juda muhimdir. Odatda, 55 dan 65 darajagacha bo'lgan erish harorati primerlar uchun mos keladi. Erish harorati primerlarning tavlanish haroratini (Ta) hisoblash uchun ishlatiladi.