Ўзбекистон республикаси соғЛИҚни сақлаш вазирлиги фармацевтика таълим ва тадқИҚот институти малака ошириш ва қайта тайёрлаш маркази

ЎЗБЕКИСТОН РЕСПУБЛИКАСИ СОҒЛИҚНИ САҚЛАШ ВАЗИРЛИГИ
ФАРМАЦЕВТИКА ТАЪЛИМ ВА ТАДҚИҚОТ ИНСТИТУТИ

МАЛАКА ОШИРИШ ВА ҚАЙТА ТАЙЁРЛАШ МАРКАЗИ

Фан: инструментал тахлил усуллари


Мустақил иш 2
Мавзу: Дори воситалар таҳлилида биологик таҳлил усулларининг қўлланилиши.


Бажарди: Шароюиддинов О


Қабул қилди: проф. В.Н. Абдуллабекова


Тошкент 2023

Дори воситалари таҳлилида физик, физик - кимёвий ва кимёвий таҳлил усулларидан ташқари биологик таҳлил усуллари ҳам қўлланилади.

Биологик стандартлаш дори модданинг физиологик таъсирини тирик ҳайвонларда стандарт моддалар билан солиштириб аниқлашдир. Дори моддалар миқдорини кимёвий ёки физико-кимёвий усуллар ёрдамида аниқлаб бўлмаганда биологик усуллардан фойдаланилади. Биологик усулда дори модданинг сифати унинг фаоллигига қараб баҳоланади. Биологик фаолликни ўрганишда тирик, бутун организмлардан ажратиб олинган органлар, тўқималар культураси ёки алоҳида тўқималар ишлатилади. Синовлар лаборатория ҳайвонлари (бақа, оқ сичқон, каламуш, денгиз чўчқалари, қуёнлар, мушуклар, итлар, кабутар ва бошқалар) да ўтказилади. Лаборатория ҳайвонлари яхшилаб танлаб олиниши керак. Чунки уларнинг берган реакциясига қараб текширилувчи дори модданинг фаоллиги, сифати ва миқдори баҳоланади. Ҳайвонлар танлаб олинаётганда уларнинг оғирлиги, жинси, ёши ва соғлигига алоҳида эътибор берилади. Улар учун бир вақтда овқатланиш режаси тузилган бўлиши, уларни бир хил шароитда ва маълум бир вақт давомида сақлаш керак. Синовлар ўтказилаётган вақтда албатта тажрибалар шароити бир хил бўлиши лозим. Аммо шу шароитларни қатъий режа асосида ушлаб турилса ҳам ҳайвонларнинг сезгирлиги ўзгариб туради ва бу ўзгаришни ҳар бир биологик синовда кўзда тутиш керак. Шунинг учун биологик баҳолашда аввал текширилувчи препаратга ҳайвоннинг сезгирлик даражасини стандарт намуна билан солиштирган ҳолда аниқланади. Стандартлар деб ҳар бир гуруҳ препаратларга маълум хусусий фаолликка эга бўлган, стандартлаш қўмитаси ёки фармакопея қўмитаси томонидан тасдиқланган намуналарга айтилади. Стандартлар ҳайвонлар сезгирлигинииг миқдорий характеристикаси учун эталон ҳисобланади. Стандартлардан фойдаланиб, маълум ўлчаш бирлигида ҳайвонларнинг сезгирлик даражасини ифодалаш, уларнинг таъсир кучи билан текширилувчи дори моддаларнинг таъсир кучини таққослаш мумкин. Стандартларнинг ишлатилиши маълум омиллар таъсири натижасида ўзгариши мумкин бўлган ҳайвонларнинг сезгирлигини миқдорий баҳолашга имкон беради ва бу ўзгаришларни ҳисобга олган ҳолда текширилувчи модданинг фаоллигини аниқлашда олинган натижалар аниқлаштирилади.
Стандартлар сифатида таъсир этувчи моддалар аралашмаси ёки индивидуал тоза моддалар ишлатилиши мумкин: барглар кукуни, спиртли экстрактлар, целанид, цимарин, строфантин ва бошқалар.
Стандарт намуналар фаоллиги таъсир бирлигида ифодаланади – ТБ. 1 ТБ - бу маълум миқдордаги стандарт намунанинг ҳайвонда чақирувчи маълум таъсиридир.
Дори воситалари таҳлилида биологик таҳлил усуллари икки хил: биологик синовлар ва биологик миқдорий таҳлиллар қўлланилади.
Биологик синовлар
Стерилликни текшириш
Микробиологик тозалик
Пирогенлик
Бактериал эндотоксинлар
Заҳарлилик
Депрессор моддалар (Гистамин ва гистамин каби моддалар)
Микобактериялар
Микоплазмалар
Ёт вирусларга текшириш
Тирик вакциналарни нейровирулентликка текшириш
Қон ивиши факторларини текшириш
Биологик миқдорий таҳлил усуллари
Витаминларни аниқлаш
Антибиотиклар фаоллигини аниқлаш
Инсулиннинг биологик фаоллигини аниқлаш
Вакциналарни миқдорий аниқлаш
Гепаринни миқдорий аниқлаш
Қон ивиши факторлари миқдорини аниқлаш
9.1. Стерилликни текшириш
Инъекция учун ишлатиладиган дори воситалари, кўз томчилари, суртмалар, пленкалар ва бошқа воситалар стерил бўлиши керак. Стерилликни текширишда олинадиган намуналар сони стериллаш шароитига қараб аниқланади. Агар дори воситаси тўйинган буғ билан юқори босим 0,11±0,02 МПа (1,1±0,2 кгс/см2) остида ва 121±1(С ҳароратда стерилланган бўлса, 10 та намуна олинади. Агар бошқа усулда стерилланган бўлса, унда қуйидаги формула бўйича намуналар сони аниқланади:
n=0,4 N
бу ерда n- намунадаги бирликлар сони;
N – текширилувчи сериялардаги бирликлар сони.
Бунда n=3 дан 40 гача бўлиши керак.
Стерилликни текширишдан олдин моддаларнинг антимикроб хусусияти ўрганилади. Бунинг учун 2 та пробиркага (бирида 10 мл тиогликол муҳити, иккинчисида 10 мл Сабура муҳити бор) керакли миқдорда текширилувчи модда ва ҳар иккисига 1 мл да 100 та ҳужайра сақловчи микробдан 0,1 мл дан солинади. Тиогликол муҳит сақловчи пробирка 30-35(С да 48 соат, Сабура муҳитини сақловчи пробирка эса 20-25(С да 72 соат давомида инкубация қилинади.
Назорат тажрибаси ўтказиладиган идишлар худди шундай муҳитлар сақлайди, уларга текширилувчи модда ўрнига тозаланган сув қўшилади. Дори моддаларнинг антимикроб хусусиятини аниқлашда қуйидаги тест-микроорганизмлар ишлатилади:
Sfaphylococcus aureus;
Bacillus subtilis;
Escherichia coli;
Сandida albicans.
Дори воситаларининг антимикроб хусусияти йўқ бўлган тақдирда тест-микроорганизмларнинг ўсиши кузатилади. Агар антимикроб хусусиятлар топилса, унда инактиваторлар ишлатилади. Инактиваторлар хусусий мақолаларда келтирилган бўлади. (сульфаниламидлар учун ПАБК, пенициллин, цефалоспоринлар учун пенициллиназа ва бошқалар).
Агар инактиваторлар йўқ бўлса, унда экилган материал билан озуқа муҳит орасидаги нисбат ўзгартирилиб, озуқа муҳитининг ҳажми 250 мл гача келтирилади. Антимикроб хусусият ўзгармаса, унда экилаётган материал миқдори 1 мл гача камайтирилади. Шунда ҳам антимикроб хусусият ўзгармаса, унда мембранали фильтрлаш усулидан фойдаланилади.
Дори моддаларининг стериллигини текширишда 2 хил: тўғридан – тўғри экиш ва мембранали фильтрлаш усулларидан фойдаланилади.
9.1.1.Тўғридан – тўғри экиш усули
Бу усулда текширилувчи дори модда суюлтирилади ва тиогликол ёки Сабуро муҳитига экилиб, 14 кун давомида инкубация қилинади (тиогликол 30-35(С, Сабуро-20-25(С). Микроорганизмлар экилгандан сўнг лойқаланиш кузатилса, унда бошқатдан экилади. Суртма ва дори моддаларнинг мойли эритмаларини синовдан ўтказилаётганда аниқ 0,1 г (мл) тортма асептик шароитда тортиб олинади ва шиша шарчалар, 100 мл 1/15 моль фосфатли буфер эритмаси (pН 6,8-7,0) ва эмульгатор сақловчи ҳажми 250 мл бўлган колбага солинади. Синов ўтказишдан олдин аралашма 41±1(С гача иситилади ва бир хил аралашма-эмульсия ҳосил бўлгунча 30 минут чайқатилади. Ҳосил бўлган эмульсиядан 5 мл дан олиб ичида 40 мл тиогликол ва Сабуро муҳитини сақловчи 2 та колбага солинади. 14 кун керакли ҳароратда инкубация қилинади.
9.1.2. Мембранали фильтрлаш усули
Мембранали фильтрлаш усулида асосан кучли антимикроб таъсирга эга бўлган ва ҳажми 100 мл дан ошиқ бўлган дори воситаларининг стериллиги текширилади. Текшириш учун 30 та идиш олинади. 3 та гуруҳга бўлинади. 20 таси стерилликни текшириш учун, 10 таси назорат учун ишлатилади. Синовлар фильтрловчи ускунада олиб борилади. Бу ускуна фильтрловчи ва қабул қилувчи колбадан иборат. Фильтр ушловчи қопқоқли воронка ва тешикчали пластинка асосдан иборат. Ана шу асосга Д=47 мм, тирқишининг катталиги 0,45±0,02 мкм бўлган мембрана ўрнатилади. Текшириш вакуум остида ва сувнинг ўтиш тезлиги 1 мин 55-75 мл бўлган тезликда олиб борилади. Текшириш олиб боришдан аввал бу мосламанинг ҳамма қисмлари стерилланади. Текширилувчи модда керакли стерил эритувчида эритилади ёки суспензия ҳолида стерил мембранадан ўтказилади. Антимикроб таъсирли дори моддасини эритишда микроорганизм ўсадиган ҳар қандай эритувчидан фойдаланиш мумкин, масалан 0,2% NaCl эритмаси. Ишлатиладиган эритувчи синовлардан олдин механик ёт моддалардан фильтрлаб тозаланган бўлиши шарт.
Текширилувчи модданинг эритмаси мембрана орқали вакуум ёрдамида ўтказилади. Сўнгра мембрана бир неча марта ювилади ва стерилланган қайчи билан 2 га бўлинади. Бир бўлаги 100 мл тиогликол, иккинчиси Сабуро муҳити солинган колбага солинади, биринчи колба 30-35(С, иккинчи колба 20-25(С да 7 кун сақланади ва вақти-вақти билан текшириб турилади. Назорат ўтказиш учун идишдаги дори моддаси маълум эритувчида эритилади, сўнгра таркибида 200 мг таъсир этувчи модда миқдорида олиб, 100 мл эритувчи солинган идишга солинади. Дарҳол фильтрланади, фильтр юқорида кўрсатилгани каб ювилади ва иккига бўлиб, бирини тиогликол, иккинчисини Сабуро муҳитли колбага солинади.
9.2. Заҳарлиликни аниқлаш
Заҳарлилик. Дори воситаларини заҳарлиликка текширилишидан мақсад – препарат захарлилигини белгиланган ва рухсат этилган меъёрдан ошиши мумкин булган даражасини аниқлашдан иборат. Бунда ҳайвонларни ўлиши даражасининг ошиши ёки кутилмаган (белгиланмаган) интоксикация кузатилиши бўйича назорат қилинади.
Аномал заҳарлилик препаратни ишлаб чиқариш ва сақлаш жараёнида унинг таркибида ишлаб чиқариш регламенти ёки меъёрий ҳужжат билан белгиланмаган ўзгаришлар юз берганда намоён бўлади. У дори воситалари хавфсизлигини баҳолашда муҳим роль ўйнайди.
Дори моддаларнинг заҳарлилиги оғирлиги 19-21 г келадиган оқ сичқонларда олиб борилади. Уларда аввал синовлар ўтказилмаган бўлиши керак. Синовлардан 24 соат олдин ва синовлар вақтида хона ҳарорати бир хил бўлиши керак. Синовдан 2 соат олдин сичқонларга овқат ва сув берилмайди. Ҳар бир серия 5 та сичқонда синалади. Эритувчи тури ва модданинг концентрацияси хусусий мақолада кўрсатилган бўлади. Текширилувчи модданинг эритмаси 37(С ҳароратгача иситилади ва сичқоннинг дум венасига 0,5 мл 0,1 м/с тезликда юборилади. Хусусий мақолада кўрсатилган юбориш усули бошқа бўлса (тери остига, ошқозон ёки ичакка) унда эритма 1 мл гача юборилади. Ошқозонга эритма учи йўғонлаштирилган инъекцион игна ёрдамида юборилади. Сичқонлар 48 соат давомида кузатилади. Шу вақт ичида битта ҳам сичқон ўлмаслиги керак. Агар битта сичқон ўлса, унда синовлар яна 5 та сичқонда (оғирлиги 20±0,5 г), агар яна 1та сичқон ўлса унда 15 та сичқонда қайтарилади. Ўлган сичқонлар сони 10% дан ошмаса, унда препарат токсик эмас, акс ҳолда токсик деб топилади. Текшириш учун ҳар 10000 та флакон ёки ампуладан 2 та флакон ёки ампула, ундан кўп бўлса, унда 3 та флакон ёки ампула олинади.
9.3. Депрессор моддаларга текшириш
Депрессор моддаларга текшириш дори воситаларини ишлаб чиқаришда улар таркибида гипотензив моддалар мавжуд бўлса беморларда дори воситаси юборилгандан сўнг артериал босимини пасайиши хавфини олдини олиш учун бажарилади. Микробиологик синтез йўли билан ёки ҳайвон ва одам тўқималаридан олинган моддалар энг хавфли ҳисобланади. Чунки, уларда юқори фаолликка эга депрессор моддалар: гистамин, брадикинин, айрим пептидлар ва бошқалар бўлиши мумкин. Депрессор моддаларга 2 та умумий мақола мавжуд. «Депрессор моддалар» ва «Гистамин», усуллар мушукларда ва in vitro денгиз чўчқалари изоляция қилинган йўғон ичаги тасмаларида бажарилади.
9.4. Пирогенлик
Дори воситаларининг пирогенлиги аксарият ҳолларда микроблардан келиб чиқади ва граммманфий бактериялар томонидан чақирилади. Бу инсон учун хавфли бўлган, бактерия ҳужайраси парчаланганда ҳосил бўладиган липополисахариддан иборат ҳужайра деворлари қолдиқлари (эндотоксинлар)дир. Эндотоксинлар стериллашнинг оддий усулларига жуда чидамли ва инсон учун кенг миқёсдаги ноҳуш биологик самара, жумладан, иситма, тромбоцитопения, эндотоксик шок, кескин (кучли) метаболик бузилишлар, анафилактик шок чақириши ва ўлимга олиб келиши мумкин. Фармацевтика саноатида пироген ифлосланишни олдини олиш ва уни текшириш долзарб масалалардан биридир.
Кўп йиллар давомида қўлланиб келинаётган дори воситаларининг пирогенлик даражасини назорат қилиш қуён ректал ҳароратини препарат вена ичига юборилишидан аввал ва кейин қиёсий тахлил қилишга асосланган. У фақат таъқиқловчи ёки рухсат этувчи тест, яъни сифат таҳлили ҳисобланади.
Бу усулнинг камчиликлари қуйидагилардан иборат:
- натижалар ҳайвон ҳолатига боғлиқ.
- бу усул билан айрим дори воситаларини ва технологик жиҳозларни аниқлаш мумкин эмас.
- фармацевтика саноатида дори воситаларини ишлаб чиқаришда пироген аралашмаларни тез ва миқдорий аниқлаш долзарб ҳисобланади.
Қуйидагиларни текшириш мумкин эмас:
Тана ҳароратини пасайтирувчи антипиретиклар. Улар пирогенлар мавжудлигини ниқоблайди (нонаркотик анальгетиклар, транквилизаторлар, нейролептиклар, кортикостероидлар, айрим анестетиклар);
Фармакологик хоссасидан келиб чиқиб, тана ҳароратини оширувчи препаратлар ҳайвонларда гипертермиянинг асосий сабабларини баҳолашга тўсқинлик қилади (вакциналар, плацента препаратлари, новокаин);
Фармакологик хоссасидан келиб чиқиб ҳайвонлар физиологик ҳолатини ўзгаришига олиб келувчи препаратлар (наркоз воситалари, юрак гликозидлари, наркотик анальгетиклар, инсулин, адреналин, ухлатувчи воситалар, деполярловчи миорелаксантлар) ;
Одамга юбориладиган бир суткалик ҳажми 700 мл ва ундан кўп бўлган инфузион препаратлар;
радиофармацевтик препаратлар; хом ашё, ампулалар, флаконлар
Технологик жихозларнинг ҳамма элементлари.
9.4.1. Пирогенликни аниқлаш
Дори моддаларнинг пирогенлиги оғирлиги 2-3,5 кг келадиган қуёнларда текширилади. Ҳар бир қуён алоҳида хоналарда ва бир хил ҳароратда сақланади (ҳароратдаги ўзгариш ±3(С дан ошмаслиги керак). Овқатдан олдин кунора уларнинг оғирлиги текшириб турилади. Бунда ҳайвонларнинг оғирлиги камаймаслиги керак. Синовлардан 3 кун олдин уларнинг ҳарорати ҳар куни эрталаб овқатдан олдин 0,1(С аниқликда ўлчанади. Термометр тўғри ичакка 7-9 см узунликда ўрнатилади. Бошланғич ҳарорат 38,5-39,5(С бўлиши керак. Ундан кам ёки кўп ҳам бўлиши мумкин эмас. Ундан ташқари қуёнлар венасига аввал 10 мл/кг миқдорида 0,9% стерил пироген бўлмаган NaCl эритмаси юборилади (реакцияни текшириш учун). Агар қуёнларда ҳарорат ±0,4(С га ўзгарса, унда улар синовлар учун яроқсиз ҳисобланади. Синовлардан 18 соат олдин қуёнлар пирогенлик текшириладиган хоналарга ўтказилади. Бунда ҳарорат қуёнлар яшаган хонадаги ҳарорат билан бир хил бўлиши керак. Тажрибалар бошланишидан олдин қуёнларга кечқурун овқат берилмайди. Синовлар вақтида овқат ўрнига сув берилади. Агар хусусий мақолада кўрсатилмаган бўлса, синов учун ҳар 1000 тадан 10000 тагача флакон ёки ампула сақловчи сериядан 2 тадан ампула ёки флакон олинади. Агар флакон ёки ампула сони 10000 тадан кўп бўлса 3 тадан олинади. Ҳар бир сериядан аралаш намуналар тайёрланади. Агар 1000 тадан кам бўлса, унда 1 та олинади. Синов олиб борилаётганда шприцлар, игналар, эритувчилар ва бошқалар стерил ва апироген бўлиши керак. Текширувчи модда эритмаси қуённинг қулоқ венасига юборилади. Юбориш усули ва миқдори кўпинча хусусий мақолада кўрсатилади.
Инъекцион сувнинг пирогенлигини текшириш учун ундан 0,9% NaCl нинг изотоник эритмаси тайёрланади. NaCl стерил, апироген бўлиши керак. NaCl ҳаволи усулда 180-200(С да 30-60 минут давомида стерилланган бўлиши керак. Худди шундай усулда бошқа ёрдамчи воситалар ҳам стерилланган бўлиши лозим. 1 кг оғирликка 10 мл миқдорда 0,9% ли NaCl изотоник эритмаси 2 минут давомида (эритма 37(С ҳароратда иситилган бўлиши керак) юборилади.
Синовлар 3 та, оғирлиги бир хил бўлган қуёнларда олиб борилади. Уларнинг оғирлиги 0,5 кг га фарқ қилиши мумкин. Қуёнларнинг ҳарорати ҳар 30 минут оралиғида эритма юборилишидан олдин 2 мартадан ўлчанади. Уларнинг ўртасидаги фарқ 0,2(С дан ошмаслиги керак. Агар ошиб кетса, бундай қуёнлар тажриба учун ишлатилмайди. Агар инъекцион эритма вена қон томирига юбориладиган (в/в) бўлса, ҳарорат эритма юборишдан 15-30 минут аввал ўлчанади, ҳарорат кейинчалик яна 3 марта 1 соат оралиқда, агар мушакка (в/м), тери остига (п/к) юборилган бўлса, унда 5 марта 1 соат оралиқда ўлчанади. 3 та қуён ҳароратининг кўтарилиши 1,4( С дан ошмаса ва 2,2(С гача бўлса, бу сув ёки текширилувчи эритма апироген, агар ошса пироген ҳисобланади. Агар ҳарорат 1,5-2,20С га ошса, унда синовлар яна 5 та қуёнларда қайта ўтказилади. 8 та қуёнда ҳарорат ошишининг йиғиндиси 3,7(С дан ошмаса, сув ва текширилаётган эритма пироген эмас деб ҳисобланади. Агар ҳароратлар йиғиндиси 3,8(С дан ошса, унда пироген ҳисобланади. Текширилган сув ёки эритма пироген бўлмаса текширувлар олиб борилган қуёнларни, 3 кундан кейин 2 марта тажриба учун ишлатиш мумкин, агар пироген бўлса, унда 2 ҳафта ўтганидан кейин қуёнларда тажриба ўтказиш мумкин.
Ҳароратнинг камайиши ҳам худди ҳарорат кўтарилганда қандай бўлса, шундай аниқланади.
Ҳайвонларни яна ишлатилишини чегараловчи препаратлар учун ҳайвонларда пирогенликни текширишни эндотоксинларни аниқлашга алмаштириш иқтисодий жиҳатдан фойдалидир (масалан, антиген ва қон препаратлари).
Эндотоксинларни бактериологик усулда ЛИМУЛУС-АМЕБОЦИТ ЛИЗАТ ёрдамида аниқлаш (LAL-тест) қуёнлардаги тестга альтернатив сифатида биринчи бўлиб АҚШ Фармакопеясининг (( нашрида пайдо бўлди ва «Бактериал эндотоксинларни аниқлаш» номини олди.
Бу 20 йиллик тадқиқот ишлари натижаси эди. 1956 йилда Денгиз биологияси институти лабораториясида ишловчи америкалик олим Bang F.B., қилич думли (мечехвост) қисқичбақаларини тадқиқот қилган. Бактериянинг қилич думли қисқичбақа қон айланиш тизимига киритилганда қон ивийди ва ҳайвон ўлади. Бундан ташқари уларга ўлик бактерияларни инъекция қилинганда ҳам бундай реакция кузатилади (доктор Frederick Bang ва доктор Jack Levin).
Қилич думли қисқичбақаларда қадимий ва содда ҳайвонлар каби организмга кислород ташувчи, одам қонига ўхшамайдиган «гемолимфа» деб номланадиган суюқлик мавжуд. Гемолимфа ҳаво ранг ва битта тур ҳужайра - амебоцитлар сақлайди. Қилич думли қисқичбақалар яшайдиган денгиз тубида бактериялар жуда кўп, лекин табиат уларга патоген бактериялардан жуда содда лекин ишончли ҳимоя механизмни совға қилган. Қисқичбақа терисининг ҳар қандай шикастланишида амебоцит қон ҳужайралари бактериялар билан юзма-юз келади ва улар активатор ролини ўйнайди. Қон ивиши реакцияси юз беради ва ҳосил бўлган қуйқа қон йўқотишга қаршилик кўрсатади.
Limulus Amebocite Lisate": Limulus – қисқичбақанинг лотинча номи, Amebocite Lisate – қисқичбақа қон ҳужайралари лизати. Реактив номи LAL-реактив, тестга LAL-тест номини берган.
Ҳозирда қуйидаги усуллар қўлланилади:
Гель ҳосил бўлиш усули
Ярим миқдорий гель ҳосил бўлиш усули
Турбидиметрик кинетик усул
Хромоген пептид ишлатиш билан кинетик усул
Хромоген пептид ишлатиш билан охирги нуқта усули.