Лабораторная работа №4 Извлечение рнк и ДНК из природных источников

---

Лабораторная работа №4 
Извлечение РНК и ДНК из природных источников 
Один из самых распространенных способов выделения нативных нуклеиновых 
кислот состоит в их экстракции и депротеинизации в смеси водной и фенольной фаз, 
предложенной К. Кирби (1956). Связь белка с РНК менее прочная, чем с ДНК , поэтому 
отделение РНК от белков может быть достигнуто прииспользовании смеси воды или 
слабого буферного раствора с фенолом. Лля выделения ДНК в водную фазу вводят ДДС 
(0,5-1%) , параминосалицилат натрия (4-5% ) или 1 М хлористый натрий.
Оборудование и реактивы. Центрифуга с 
охлаждением, рНметр, песочная баня, колба для перегонки фенола из термостойкого 
стекла на 250-500 мл, термометр на 200
о
С, качалка, химическая посуда. Водонасыщенный 
фенол, содержащий 0,1 % 8-оксихинолина (фенол перегоняют нагреванием на песочной 
бане при 200
о
С в аппарате из стекла, смешивают с дистиллированной водой в отношении 
8:2, растворяют 0,1 г 8-оксихинолина в 100 мл фенола; раствор стабилен в течение трех 
суток); 10 м М трис-НС1 буфера, рН 7,8 (0,7 мл 0,01 М НС1, 121 мг трис и 1 г ДДС 
растворяют в 100 мл водного раствора, хранится в течение двух недель на холоду); 96%-
ный этанол; 2 М ацетатный буфер, рН 5,3 (1,92 мл ледяной уксусной кислоты и 21,76 г 
CH
3
COON a • ЗН
2
О растворяют в 100 мл водног о раствора); хлороформ.
Ход работы. 1 г ткани растирают в жидком азоте и переносят с помощь ю 5 мл 
холодного трис-буфера с 1%-ным ДДС в колбу на 50 мл с 5 мл водонасыщенного фенола, 
содержаще го 0,1 % 8-оксихинолина. Встряхивают на холоду на качалке 20 мин, 
добавляют 1 мл хлороформа и встряхивают еще 20 мин. Фазы разделяют 
центрифугированием на холоду при 4 - 6 тыс.g. в течение 5 мин. Верхнюю водную фазу 
отсасывают пипеткой сотбитым кончиком (чтобы не повредить молекулы ДНК, диаметр 
кончика должен быть около 2 мм), переносят в новую колбу, содержащую 5 мл фенола с 
0,1 % 8-оксихинолина, и повторяют депротеинизацию. Вновь отобранную водную фазу 
депротеинизируют третий раз. Промежуточную и нижнюю фенольную фазу после каждой 
депротеинизации промывают 1 мл буфера, отделяют водный слой центрифугированием и 
присоединяют к основной водной пробе, а промежуточный и фенольный слои 
отбрасывают. Нуклеиновые кислоты осаждают, добавляя к объединенному водному 
экстракту 2 объема этанола и 2 М ацетатный буфер (О,1-0, 2 мл буфера на 20 мл водно-
спиртовой смеси). Выдерживают смесь на холоду (-20
о
С) в течение 1- 2 ч и отделяют 
осадок центрифугированием. Осадок перерастворяют в 2 мл трис-буфера и еще раз 
проводят депротеинизацию, как описано выше, промывая фенольный и промежуточный 
слои буфером после отделения основной водной фазы. Затем нуклеиновые кислоты снова 
осаждают подкисленным спиртом . Осадок промывают 2- 3 раза 96%-ным этанолом (по 3 - 
4 мл) и хранят под спиртом при -20
о
С. Препарат содержит РНК, ЛНК , полисахариды (в 
основном крахмал). Он может фракционироваться хроматографией, электрофорезом , 
ультрацентрифугированием. Если требуется удалить крахмал, то можно проинкубировать 
водный раствор препарата с β-амилазой (0,2 мг/мл ) при 37
о
С в течение 30-60 мин, затем 
удалить фермент фенольной депротеинизацией. ДНК и полисахариды можно осадить 2-
этоксиэтанолом.