Nuklein kislotalarni tozalash hujayra tuzilishi

NUKLEIN KISLOTALARNI TOZALASH
Hujayra tuzilishi
Barcha hujayralar fosfolipidli membrana bilan o’ralgani uchun nuklein kislotalarni ajratib olishda detergent bilan ekstraksiya qilish kerak

Ajratib olinayorgan organizmga qarab ushbu turlarga bo’linadi

• Bakteriya
• O’simlik va zamburug’
• Xayvon to’qimasi
• Qattiq (teri, mukul)
• Suyuq (qon , so’lak)

1 chi etab hujayralarni yorib olish (hujayra lizisi)

• Bakteriya-lizotsim, ishqor, ulratovush orqali yoriladi
• O’simlik va zamburug’-suyuq azot bilan muzlatiladi xovonchad eziladi va CTAB moddasi bo’lgan buffer qo’shilib ekstraksiya qilinadi.
• Xayvon to’qimasi
• Qattiq (teri, mukul)- suyuq azot bilan xovonchad eziladi va detergent bilan ekstraksiya qilinadi
• Suyuq (qon , so’lak)- detergent bilan ekstraksiya qilinadi

Detergent bilan ekstraksiya qilingandan so’ng DNK ushbu 3 metoddan biri bilan tozalab olinadi.

• Etanol bilan cho’ktirish
• Fenol xloroformli ekstraktsiyasiyalash
• Minikolonkali tozalash

Etanol bilan cho’ktirish- odatda sovuq etanol yoki isopropanol qo’shiladi. DNK bu spirtlarda erimagani uchun, u birlashib, sentrifugalash paytida granulani hosil qilib cho’kadi. DNKning cho'kishini oshirish uchun odatda natriy asetat tuzi qo’shiladi qo'shiladi. Eupernatant(suyuqlik) to’kib yuborilib, cho’kma TE(Tris EDTA lik) bufferda eritib olinadi. .

Fenol xloroformli ekstraktsiyasiyalash- unda fenol namunadagi oqsillarni denaturatsiya qiladi. Namuna santrifuga qilingandan so'ng, denaturatsiya qilingan oqsillar organik fazaga(xloroforimga) o’tadi va nuklein kislotalar suvli fazada qoladi. Odatda bu usuldan so’ng spirt bilan cho’ktirib yanayam yaxshiroq tozalab olinadi

• Fenol xloroformli ekstraktsiyasiyalash- unda fenol namunadagi oqsillarni denaturatsiya qiladi. Namuna santrifuga qilingandan so'ng, denaturatsiya qilingan oqsillar organik fazaga(xloroforimga) o’tadi va nuklein kislotalar suvli fazada qoladi. Odatda bu usuldan so’ng spirt bilan cho’ktirib yanayam yaxshiroq tozalab olinadi

DNK pH8 da RNK esa pH 4 yoki 5,2 da ajratib olinadi.

Minikolonkali tozalash- Nuklein kislotalarning buferdagi pH va tuz kontsentratsiyasiga qarab qattiq fazaga (kremniy yoki boshqa moddaga) shimib olinishi (adsorbsiyasi) mumkinligiga asoslangan. Bunda faqat nuklein kislatalar adsorbsiya bo’ladi. Boshqa moddalar kalonkadan tushib ketadi. TE(Tris EDTA lik) buffer quyilsa, nuklein kislatalar kalonkadan buferga erib chiqadi

• Minikolonkali tozalash- Nuklein kislotalarning buferdagi pH va tuz kontsentratsiyasiga qarab qattiq fazaga (kremniy yoki boshqa moddaga) shimib olinishi (adsorbsiyasi) mumkinligiga asoslangan. Bunda faqat nuklein kislatalar adsorbsiya bo’ladi. Boshqa moddalar kalonkadan tushib ketadi. TE(Tris EDTA lik) buffer quyilsa, nuklein kislatalar kalonkadan buferga erib chiqadi

DNK konsentratsasini aniqlash

спектрофотометр
nanodrop 2000
Флурометр Qubit
Ajratib olingan DNK ushbu aparatlardan birida konsentratsiyasi aniqlanadi
Ajratib olingan DNK yoki RNK elektrofarezda ko’riladi.

Elektrofarezda DNK sifatini ko’rish

Agar DNK da musir bo’lsa spirtda cho’ktirilib qayta tozalanadi.

RNK gel elektrafarezda ko’rilganda ribasomaning katta va kichik qisimlari 2 bend bo’lib yaqqol ko’rinadi. Chunki ular umumiy RNK ning (total RNA) 90% ni tashkil qiladi. Agar ushbu 2 bend ko’rinmasa RNK sifatsiz, parchalanib ketgan bo’ladi
ETIBORINGIZ UCHUN RAHMAT